Разработка in vitro модели дисферлинопатии посредством crispr/cas-опосредованной активации гена dysf

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Для разработки методов генной терапии и геномного редактирования при моногенных заболеваниях необходимы клеточные модели из тканей человека, полученных малоинвазивными методами, позволяющие провести скрининг и выбрать наиболее эффективный подход по восстановлению синтеза целевого белка. В работе применена система транскрипционной активации CRISPR/dCas9-SAM, обеспечивающая экспрессию гена DYSF в клетках линии HEK 293Т, а также в фибробластах десны пациента с дисферлинопатией (с гомозиготной мутацией c. 2779delG (Ala9 27LeufsX 2 1)). После активации гена DYSF удалось детектировать его функциональные продукты (мРНК гена и белок) в транскрипционно активированных (ТА) клетках HEK293Т (HEK293Т_ТА) и мРНК в фибробластах. Активация транскрипции интересующего гена в фибробластах и клеточной линии HEK 293Т_ТА может быть использована для in vitro оценки эффективности геномного редактирования и генной терапии дисферлинопатии. Активируя ген, участвующий в развитии той или иной патологии, можно впоследствии использовать системы редактирования генома, а также конструкции для генной терапии. Это позволит более точно изучать вклад различных мутаций в патогенез заболевания и разрабатывать этиотропное лечение.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

И. А. Яковлев

ПАО “Артген биотех”; ООО “Генотаргет”, Инновационный центр “Сколково”

Автор, ответственный за переписку.
Email: mail@genotarget.com
Россия, Москва; Москва

Я. С. Слесаренко

ООО “Генотаргет”, Инновационный центр “Сколково”

Email: mail@genotarget.com
Россия, Москва

И. Г. Старостина

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: mail@genotarget.com
Россия, Казань

А. А. Шаймарданова

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: mail@genotarget.com
Россия, Казань

В. В. Соловьева

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: mail@genotarget.com
Россия, Казань

П. А. Бобровский

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. Ю. М. Лопухина ФМБА России

Email: mail@genotarget.com
Россия, Москва

Е. Н. Графская

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. Ю. М. Лопухина ФМБА России

Email: mail@genotarget.com
Россия, Москва

Л. Д. Беликова

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины им. Ю. М. Лопухина ФМБА России

Email: mail@genotarget.com
Россия, Москва

С. Н. Бардаков

ПАО “Артген биотех”

Email: mail@genotarget.com
Россия, Москва

А. А. Ризванов

Казанский (Приволжский) федеральный университет; Отделение медицинских и биологических наук, АН Республики Татарстан

Email: mail@genotarget.com
Россия, Казань; Казань

А. А. Исаев

ПАО “Артген биотех”

Email: mail@genotarget.com
Россия, Москва

Р. В. Деев

ПАО “Артген биотех”; ООО “Генотаргет”, Инновационный центр “Сколково”; Научно-исследовательский институт морфологии человека им. акад. А.П. Авцына

Email: mail@genotarget.com
Россия, Москва; Москва; Москва

Список литературы

  1. Деев Р.В., Мавликеев М.О., Бозо И.Я., Пулин А.А., Еремин И.И. 2014. Генно-клеточная терапия наследственных заболеваний мышечной системы: современное состояние вопроса. Гены и клетки. Т 9. № 4. С. 6. (Deev R.V., Mavlikeev M.O., Bozo I.Ya., Pulin A.A., Eremin I.I. 2014. Gene- and cell-based therapy of muscle system hereditary disorders: state-of-art. Genes Cells V. 9. No. 4. P. 6.)
  2. Исаев А.А., Бардаков С.Н., Мкртчян Л.А., Мусатова Е.В., Хмелькова Д.Н., Гусева М.В., Каймонов В.С., Яковлев И.А., Деев Р.В. 2023. Новые варианты нуклеотидных последовательностей гена DYSF, выявленные методом секвенирования нового поколения. Мед. генетика. Т. 22. № 6. С. 3. (Isaev A.A., Bardakov S.N., Mkrtchyan L.A., Musatova E.V., Khmelkova D.N., Guseva M.V., Kaimonov V.S., Yakovlev I.A., Deev R.V. 2023. New nucleotide sequence variants of the DYSF gene, identified by the next-generation sequencing. Medical Genetics. V. 22. No. 6. P. 3.)
  3. Старостина И.Г., Соловьева В.В., Шевченко К.Г., Деев Р.В., Исаев А.А., Ризванов А.А. 2012. с. Гены и клетки. Т.7. № 3. C. 25. (Starostina I.G, Solovyeva V.V., Shevchenko K.G. et al. 2012. (Formation of the recombinant adenovirus encoding codon-optimized dysferlin gene and analysis of the recombinant protein expression in cell culture in vitro. Cell. Transplantat. Tiss. Eng. V.7. No. 3. P. 25.)
  4. Яковлев И.А., Деев Р.В., Соловьева В.В., Ризванов А.А., Исаев А.А. 2016. Пред- и посттранскрипционная модификация генетической информации в программе лечения мышечных дистрофий. Гены и клетки. Т. 1 1. № 2. С. 42. (Yakovlev I.A., Deev R.V., Solovyеva V.V., Rizvanov A.A., Isaev A.A. 2016. Pre- and posttranscriptional genetic information modification in muscular dystrophy treatment. Genes Cells. V. 11. No 2. P. 42.)
  5. Agrawal G. Aung A., Varghese S. 2017. Skeletal muscle-on-a-chip: an in vitro model. V. 17. P. 3447. https://doi.org/10.1039/c7lc00512a
  6. Arab-Bafrani Z., Shahbazi-Gahrouei D., Abbasian M., Fesharaki M. 2016. Multiple MTS assay as the alternative method to determine survival fraction of the irradiated HT-29 colon cancer cells. J. Med. Signals Sens. V. 6. P. 112.
  7. Argov Z., Sadeh M., Mazor K., Soffer D., Kahana E., Eisenberg I., Mitrani-Rosenbaum S., Richard I., Beckmann J., Keers S., Bashir R., Bushby K., Rosenmann H. 2000. Muscular dystrophy due to dysferlin deficiency in Libyan Jews. Clinical and genetic features. Brain. V. 6. P. 1229. https://doi.org/10.1093/brain/123.6.1229
  8. Barthelemy F. Santoso J.W., Rabichow L., Jin R., Little I., Nelson S.F., McCain M.L., Miceli M.C. 2022. Modeling patient-specific muscular dystrophy phenotypes and therapeutic responses in reprogrammed myotubes engineered on micromolded gelatin hydrogels. Front Cell Dev Biol. V. 10: 830415. https://doi.org/10.3389/fcell.2022.830415
  9. Belanto J., Diaz-Perez S., Magyar C., Maxwell M., Yilmaz Y., Topp K., Boso G., Jamieson C.H., Cacalano N.A., Jamieson C.A. 2010. Dexamethasone induces dysferlin in myoblasts and enhances their myogenic differentiation. Neuromuscul Disord. V. 2. P. 111. https://doi.org/10.1016/j.nmd.2009.12.003
  10. Bouchard C., Tremblay J.P. 2023. Portrait of dysferlinopathy: diagnosis and development of therapy. J. Clin. Med. V. 12: 6011. https://doi.10.3390/jcm12186011
  11. Bruge C., Geoffroy M., Benabides M., Pellier E., Gicquel E., Dhiab J., Hoch L., Richard I., Nissan X. 2022. Skeletal muscle cells derived from induced pluripotent stem cells: a platform for limb girdle muscular dystrophies. Biomed. V. 10: 1428. https://doi.org/10.3390/biomedicines10061428
  12. Chamberlain J.R., Chamberlain J.S. 2017. Progress toward gene therapy for duchenne muscular dystrophy. Mol. Ther. V. 5. P. 1125. https://doi.10.1016/j.ymthe.2017.02.019
  13. Crisafulli S., Sultana J., Fontana A., Salvo F., Messina S., Trifiro G. 2020. Global epidemiology of duchenne muscular dystrophy: an updated systematic review and meta-analysis. Orphanet J. Rare Dis. V. 15. P. 141. https://doi.org/10.1186/s13023-020-01430-8
  14. Defour A., Van der Meulen J.H., Bhat R., Bigot A., Bashir R., Nagaraju K., Jaiswal J.K. 20 14. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. V. 5: 1306. https://doi.org/10.1038/cddis.2014.272
  15. Heidersbach A.J., Dorighi K.M., Gome J.A. 2023. A versatile, high-efficiency platform for CRISPR-based gene activation. Nat. Commun. V. 14. P. 902. https://doi.org/10.1038/s41467-023-36452-w
  16. Hunt C., Hartford S.A., White D., Pefanis E., Hanna T., Herman C., Wiley J., Brown H., Su Q., Xin Y., Voronin D., Nguyen H., Altarejos J., Crosby K., Haines J. et al. 2021. Tissue-specific activation of gene expression by the Synergistic Activation Mediator (SAM) CRISPRa system in mice. Nat. Commun. V. 12. P. 2770. https://doi.org/10.1038/s41467-021-22932-4
  17. Illarioshkin S.N., Ivanova-Smolenskaya I.A., Tanaka H., Vereshchagin N.V., Markova E.D., Poleshchuk V.V., Lozhnikova S.M., Sukhorukov V.S., Limborska S.A., Slominsky P.A., Bulayeva K.B., Tsuji S. 1996. Clinical and molecular analysis of a large family with three distinct phenotypes of progressive muscular dystrophy. Brain. V. 6. P. 1895. https://doi.org/10.1093/brain/119.6.1895
  18. Jean J., Lapointe M., Soucy J., Pouliot R. 2009. Development of an in vitro psoriatic skin model by tissue engineering. J. Dermatol. Sci. V. 53. P. 19. https://doi.org/10.1016/j.jdermsci.2008.07.009
  19. Jiang J., Sun Y., Xiao R., Wai K., Ahmad M.J., Khan F.A., Zhou H., Li Z., Zhang Y., Zhou A., Zhang S. 2019. Porcine antiviral activity is increased by CRISPRa-SAM system. Biosci. Rep. V. 8. https://doi.org/10.1042/BSR20191496
  20. Jensen T.I., Mikkelsen N.S., Gao Z, Foßelteder J., Pabst G., Axelgaard E., Laustsen A., König S., Reinisch A., Bak R.O. 2021. Targeted regulation of transcription in primary cells using CRISPRa and CRISPRi. Genome Res. V. 3111. P. 2120. https://doi.org/10.1101/gr.275607.121
  21. Johnson C.I., Argyle D.J., Clements D.N. 2016. In vitro models for the study of osteoarthritis. Vet. J. V. 209. P. 40. https://doi.org/10.1016/j.tvjl.2015.07.011
  22. Kabadi A.M., Thakore P.I., Vockley C.M., Ousterout D.G., Gibson T.M., Guilak F., Reddy T.E., Gersbach C.A. 2015. Enhanced MyoD-induced transdifferentiation to a myogenic lineage by fusion to a potent transactivation domain. ACS Synth. Biol. V. 6. P. 689. https://doi.org/10.1021/sb500322u
  23. Katt M.E., Placone A.L., Wong A.D., Xu Z.S., Searson P.C. 2016. In vitro tumor models: advantages, disadvantages, variables, and selecting the right platform. Front. Bioeng. Biotechnol.V. 4. P. 12. https://doi.org/10.3389/fbioe.2016.00012
  24. Khaiboullina S.F., Martynova E.V., Bardakov S.N., Mavlikeev M.O., Yakovlev I.A., Isaev A.A., Deev R.V., Rizvanov A.A. 2017. Serum cytokine profile in a patient diagnosed with dysferlinopathy. Case Rep. Med. V. 2017: 3615354. https://doi.org/10.1155/2017/3615354
  25. Konermann S., Brigham M.D., Trevino A.E., Joung J., Abudayyeh O.O., Barcena C., Hsu P.D., Habib N., Gootenberg J.S., Nishimasu H., Nureki O., Zhang F. 2015. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. V. 7536. P. 583. https://doi.org/10.1038/nature14136
  26. Lek A., Evesson F. J., Sutton R. B., North K. N., Cooper S.T. 2012. Ferlins: regulators of vesicle fusion for auditory neurotransmission, receptor trafficking and membrane repair. Traffic. V. 13. P. 185. https://doi.org/10.1111/j.1600-0854.2011.01267.x
  27. Leshinsky-Silver E., Argov Z., Rozenboim L., Cohen S., Tzofi Z., Cohen Y., Wirguin Y., Dabby R., Lev D., Sadeh M. 2007. Dysferlinopathy in the jews of the caucasus: a frequent mutation in the dysferlin gene. Neuromus. Disord. V. 17. P. 950. https://doi.org/10.1016/j.nmd.2007.07.010
  28. Liu W., Pajusalu S., Lake N.J., Zhou G., Ioannidis N., Mittal P., Johnson N.E., Weihl C.C., Williams B.A., Albrecht D.E., Rufibach L.E., Lek M. 2019. Estimating prevalence for limb-girdle muscular dystrophy based on public sequencing databases. Genet. Med. V. 21. P. 2512. https://doi.10.1038/s41436-019-0544-8
  29. Luo N., Zhong W., Li J., Zhai Z., Lu J., Dong R. 2022. Targeted activation of HNF4α/HGF1/FOXA2 reverses hepatic fibrosis via exosome-mediated delivery of CRISPR/dCas9-SAM system. Nanomed. V. 17. P. 1411. https://doi.org/10.10.2217/nnm-2022-0083
  30. Mamchaoui K., Trollet C., Bigot A., Negroni E., Chaouch S., Wolff A., Kandalla P.K., Marie S., Di Santo J., St. Guily J.L., Muntoni F., Kim J., Philippi S., Spuler S., Levy N., et al. 2011. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. V. 1. P. 34. https://doi.org/10.1186/2044-5040-1-34
  31. Rossi R., Torelli S., Ala P., Weston W., Morgan J., Malhotra J., Muntoni F. 2023. MyoD-induced reprogramming of human fibroblasts and urinary stem cells in vitro: protocols and their applications. Front. Physiol. V. 14: 1145047. https://doi.org/10.3389/fphys.2023.1145047
  32. Salmon P., Trono D. 2006. Production and titration of lentiviral vectors. Curr. Protoc. Neurosci. V. 4. U. 4.21. https://doi.org/10.0.3.234/0471142301.ns0421s53
  33. Salari N., Fatahi B., Valipour E., Kazeminia M., Fatahian R., Kiaei A., Shohaimi S., Mohammadi M. 2022. Global prevalence of Duchenne and Becker muscular dystrophy: a systematic review and meta-analysis. J. Orthop Surg. Res. V. 17. P. 96. https://doi.org/10.1186/s13018-022-02996-8
  34. Shin M.K., Bang J.S., Lee J.E., Tran H.D., Park G., Lee D.R., Jo J. 2022. Generation of skeletal muscle organoids from human pluripotent stem cells to model myogenesis and muscle regeneration. Int. J. Mol. Sci. V. 23. N. 5108. https://doi.org/10.3390/ijms23095108
  35. Stoppelkamp S., Bell H.S., Palacios-Filardo J., Shewan D.A., Riedel G., Platt B. 2011. In vitro modelling of Alzheimer’s disease: degeneration and cell death induced by viral delivery of amyloid and Tau. Exp Neurol. V. 229. P. 226. https://doi.org/10.1016/j.expneurol.2011.01.018
  36. Stewart S.A., Dykxhoorn D.M., Palliser D., Mizuno H., Yu E.Y., An D.S., Sabatini D.M., Chen I.S., Hahn W.C., Sharp P.A., Weinberg R.A., Novina C.D. 2003. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. V. 4. P. 493. https://doi.org/10.1261/rna.2192803.
  37. Szulc J., Wiznerowicz M., Sauvain M.O., Trono D., Aebischer P. 2006. A versatile tool for conditional gene expression and knockdown. Nat. Methods. V. 3. P. 10. https://doi.org/10.1038/nmeth846
  38. Thomas P., Smart T.G. 2005. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. V. 51. P. 187. https://doi.org/10.1016/j.vascn.2004.08.014
  39. Tominaga K., Tominaga N., Williams E.O., Rufibach L., Schöwel V., Spuler S., Viswanathan M., Guarente L.P. 2021. 4-Phenylbutyrate restores localization and membrane repair to human dysferlin mutations. iScience. V. 25. N. 103667. https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.103667
  40. Tumiati LC., Mickle D.A.G., Weisel R.D., Williams W.G., Li R.K. 1994. An in vitro model to study myocardial ischemic injury. J. Tiss. Culture Methods. V. 16. P. 1. https://doi.org/10.1007/BF01404830
  41. Ulman A., Kot M., Skrzypek K., Szewczyk B., Majka M. 2021. Myogenic differentiation of ips cells shows different efficiency in simultaneous comparison of protocols. Cells. V. 10. P. 1671. https://doi.org/10.3390/cells10071671
  42. Umakhanova Z.R., Bardakov S.N., Mavlikeev M.O., Chernova O.N., Magomedova R.M., Akhmedova P.G., Yakovlev I.A., Dalgatov G.D., Fedotov V.P., Isaev A.A., Deev R.V. 2017. Twenty-year clinical progression of dysferlinopathy in patients from Dagestan. Front. Neurol. V. 8. P. 77. https://doi.org/10.3389/fneur.2017.00077
  43. Urtizberea J.A., Bassez G., Leturcq F., Nguyen K., Krahn M., Levy N. 2008. Dysferlinopathies. Neurol. India. V. 3. P. 289. https://doi.org/10.4103/0028-3886.43447
  44. Vunjak Novakovic G., Eschenhagen T., Mummery C. 2014. Myocardial tissue engineering: in vitro models. Cold Spring Harb. Perspect Med. V. 4: a014076. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a014076
  45. Wang H., La Russa M., Qi LS. 2016. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annu. Rev. Biochem. V. 85. P. 227. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-060815-014607
  46. Wang C.H., Lundh M., Fu A., Kriszt R., Huang T.L., Lynes M.D., Leiria L.O., Shamsi F., Darcy J., Greenwood B.P., Narain N.R., Tolstikov V., Smith K.L., Emanuelli B., Chang Y.T., et al. 2020. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Sci. Transl. Med. V. 26: eaaz8664. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aaz8664
  47. Xiong K., Zhou Y., Hyttel P., Bolund L., Freude K.K., Luo Y. 2016. Generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) stably expressing CRISPR-based synergistic activation mediator (SAM). Stem Cell Res. V. 17. P. 665. https://doi.org/10.1016/j.scr.2016.10.011
  48. Zhang Y.S., Oklu R., Albadawi H. 2017. Bioengineered in vitro models of thrombosis: methods and techniques. Cardiovasc. Diagn. Ther. V. 7. P. 329. https://doi.org/10.21037/cdt.2017.08.08
  49. Zorin V.L., Pulin A.A., Eremin I.I., Korsakov I.N., Zorina A.I., Khromova N.V., Sokova O.I., Kotenko K.V., Kopnin P.B. 2017. Myogenic potential of human alveolar mucosa derived cells. Cell Cycle. V. 16. P. 545. https://doi.org/10.1080/15384101.2017.1284714

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Система транскрипционной активации CRISPR/Cas9-SAM.

Скачать (162KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Распределение фибробластов, выделенных из десны пациента с дисферлинопатией, по поверхностным маркерам (иммунофенотипирование). По вертикали – число клеток; по горизонтали – интенсивность свечения зонда, связанного с соответствующим антителом. а – Клетки, негативные по маркерам CD4 5, CD34, CD 1 1b, CD 19 и HLA-DR; б – клетки CD90+ (94.4%), б – клетки CD 10 5+ (90.5%), г – клетки CD73+ (91.5%); д, е – гистограмма распределения клеточной популяции по интенсивности флуоресцентного сигнала GFP соответственно до и после сортировки. Проточная цитометрия.

Скачать (682KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Детекция нокаута p53 в фибробластах. а – Фибробласты пациента с дисферлинопатией, трансдуцированные лентивирусом LVUHshp53-gfp.3. б – Вестерн-блот: КО – иммортализованные фибробласты кожи пациента с дисферлинопатией, полученные путем нокаута гена-онкосупрессора p53 (53 кДа), WT – фибробласты кожи пациента с дисферлинопатией. М – мол. маркер.

Скачать (203KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Детекция мРНК и белка гена DYSF в фибробластах и HEK 293T до (wo TA) и после (TA) транскрипционной активации гена DYSF с помощью CRISPR/dCas9 SAM. а – Относительная экспрессия мРНК дисферлина (ΔΔCT, ОТ-ПЦР) в миобластах человека без мутации в гене DYSF, использованных в качестве контрольных клеток (HMb), фибробластах пациента после транскрипционной активации (ТА) DYSF (HF-mut26-p53_TA) и фибробластах пациента, не несущих компонент системы активации (HF-mut26-p53 wo TA). б – Относительная (ΔΔCT) экспрессия мРНК дисферлина в клетках HEK 293Т до и после ТА DYSF и клетках С 2С 1 2, которые служили положительным контролем. в, г – Соответственно вестерн-блоты с антителами к белку дисферлин и их денситограммы (D – оптическая плотность). а, б: Данные представлены в виде среднего ± стандартная ошибка среднего.

Скачать (277KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024