Establishment and characterization of DU145 and LNCaP cell lines with resistance to abiraterone, cisplatin, doxorubicin and paclitaxel

Full Text

Обоснование

В настоящее время рак предстательной железы (РПЖ) является одним из наиболее распространённых онкологических заболеваний у мужчин. [1]. Существующие методы медикаментозного лечения РПЖ на поздних стадиях способны ненадолго замедлить прогрессирование болезни, но не вылечить пациентов полностью. Причиной этому является стремительно развивающаяся резистентность раковых клеток в отношении используемых препаратов [2]. Механизмов резистентности обнаруженных в клетках РПЖ довольно много: повышенная экспрессия генов множественной лекарственной устойчивости [3], слияние TMPRSS2-ERG [4], мутации и альтернативный сплайсинг андрогенового рецептора (АР) [5], усиление экспрессии изоформы βⅡⅠ-тубулина при прогрессировании РПЖ [6].

Кроме того, опухолевые клетки могут адаптироваться к низкому уровню андрогенов и со временем опухоль начинает вновь прогрессировать [7]. Мутации в гене AR и альтернативный сплайсинг делают опухолевые клетки резистентными к антиандрогенам, при этом опухоль продолжает зависеть от стероидов [8-9]. Однако введение в клиническую практику более эффективных антиандрогенов не привело к значительным успехам, а наоборот, спровоцировало увеличение числа андроген-независимых форм РПЖ. Примерно 15–20% опухолей кастрационно-резистентного РПЖ (КРРПЖ) теряют зависимость от АР и трансформируются в андроген-независимые формы [10].

При лечении метастатического кастрационно-резистентного рака предстательной железы (мКРРПЖ)  остаются востребованными химиотерапевтические препараты. В частности, лечение доцетакселом увеличивает общую выживаемость, но около половины пациентов изначально не отвечают на лечение, а у остальных в течение года вырабатывается резистентность [11]. Среди установленных механизмов резистентности к таксанам описаны сверхэкспрессия Р-гликопротеина [12] и мутации в гене, кодирующем β-тубулин [13].

Одним из инструментов, помогающим понять механизмы адаптации опухоли и разрабатывать усовершенствованные способы терапии, является создание лекарственно устойчивых клеточных линий, на которых, с одной стороны, можно изучать биохимические механизмы сопротивления опухолевых клеток лечению, а с другой стороны — тестировать новые препараты.

В 50-60-е годы прошлого века резистентные клеточные линии получали преимущественно in vivo, а начиная с 70-х годов — in vitro. В лабораторных условиях самым простым способом получения резистентных культур является культивирование  полученных ранее стабильных культур опухолевых клеток в присутствии определенных препаратов in vitro. Методы культивирования можно разделить на непрерывное и импульсное, а полученные модели на клинически значимые и высокоуровневые лабораторные модели [14]. Для клинически значимых моделей необходимо повышение устойчивости к препарату не менее чем в 2-5 раз, что совпадает с устойчивостью моделей, полученных от пациентов после лечения. Данные модели менее стабильны и описать в них биохимические изменения сложнее, но они лучше моделируют прогрессирование заболевания у пациента. Высокоуровневые лабораторные модели получают при культивировании с большими дозами препарата, как правило, путем постоянного увеличения концентрации, что дает существенные и стабильные изменения в метаболизме клеток. Однако полученные таким образом клеточные линии, по мнению некоторых исследователей, хуже моделируют поведение клеток в организме пациента [14].

В прогрессировании РПЖ ключевую роль играют андрогены. Андрогенная депривация часто стимулирует конверсию предшественников стероидных гормонов в раковых клетках [15-17]. Например, клеточная линия LNCaP содержит все ферменты, необходимые для синтеза андрогенов [18], а внутриопухолевые концентрации тестостерона и дигидротестостерона данной линии достаточны для активации АР [7].

Опыты на мышах показывают, что высокие уровни эстрогенов в сочетании с низким уровнем тестостерона могут вызывать предраковые поражения предстательной железы [19].

Через стероидные рецепторы клетки могут перестраивать метаболизм, формируя лекарственную резистентность. Доклинические и клинические исследования показывают, что при РПЖ часто изменяется экспрессия и других ядерных рецепторов [20]. Так, глюкокортикоидный рецептор (ГР) может регулировать многие гены, считающиеся специфичными для  АР [21]. Активация глюкокортикоидных рецепторов (ГР) во время терапии энзалутамидом способствует развитию резистентности к препарату [22]. Это подтверждается как на доклинических моделях, так и на пациентах с резистентностью к энзалутамиду [20-22].

В нашем исследовании мы сосредоточились на изучении резистентности к препаратам разных групп, что позволит проследить перекрестную резистентность и спрогнозировать возможные варианты сочетаний препаратов для её преодоления.

Методы

Культуры клеток

В работе были использованы культуры клеток РПЖ человека DU145 и LNCaP, полученные из биоколлекции Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Клетки культивировали в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) и 1% раствора гентамицина (ПанЭко, Россия) в среде, 5% CO₂ при 37⁰С. Клетки поддерживали в логарифмической фазе роста и снимали с пластика раствором Версена (ПанЭко, Россия) и трипсина (ПанЭко, Россия).

Результаты других опытов in vitro (ИФА, ПЦР) были обработаны в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) и 1% раствора гентамицина (ПанЭко, Россия.)

 

Препараты  

Использовали официальные препараты: паклитаксел (Bristol-Myers Squibb, Италия) 6 мл/мл концентрат для приготовления раствора для инфузий; цисплатин (Тева, Нидерланды), 0,5 мг/мл раствор для внутривенного и внутриполостного введения; доксорубицин (Тева, Нидерланды) 10 мг лиофилизированный порошок для приготовления инъекционного раствора, а также субстанцию абиратерона ацетата (BaojiGuokang Bio-Technology Co., Ltd, Китай).

Препараты паклитаксела и цисплатина представляют собой растворы, доксорубицна и абиратерона – порошки. Доксорубицин разводили в 0,9% растворе хлорида натрия до концентрации 1,7 мМ/л, абиратерона ацетат растворяли в ДМСО до концентрации 10 мМ/л.

Определение цитотоксичности

Цитотоксичность оценивали с помощью МТТ-теста. Для проведения анализа клетки рассевали на 96-луночные планшеты по 5×10³ клеток на лунку в 200 мкл среды и культивировали при 37⁰С и 5% СО₂. После 24 часов инкубации к культуре клеток добавляли препараты в различных концентрациях: цисплатин 0,23–58,2 мкΜ/л, доксорубицин 0,08–20 мкΜ/л, паклитаксел 0,001–20 мкΜ/л, абиратерон 0,4–100 мкΜ/л. Затем клетки инкубировали в течение 72 часов. После окончания инкубации в каждую лунку добавляли 20 мкл МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дидифенил тетразолий бромид, 5 мг/мл)) и инкубировали еще 3,5-4 часа. Затем из лунок планшетов удаляли супернатант и добавляли ДМСО по 200 мкл на лунку для растворения образовавшихся кристаллов формазана. Оптическую плотность определяли с помощью планшетного фотометра Thermo Scentific Multiskan FC (Thermo Scentific, США) при 540 нм.

Получение резистентных культур

Резистентность клеток вырабатывали путем добавления препаратов к среде в концентрации, составляющей 10% от IC₅₀, в течение 20 пассажей при пассировании клеток каждые 3-4 дня. Препараты добавляли на следующий день после прикрепления клеток ко дну флакона путем полной замены исходной среды на среду с препаратом. К клеткам DU145 абиратерон добавляли сразу при пассировании. На 10-м и 20-м пассажах, а также 10-м пассаже после отмены препарата (30-й пассаж от начала исследования) проводили МТТ-тест и рассчитывали IC₅₀. Также после 20-го пассажа определяли перекрестную резистентность ко всем исследуемым препаратам.

Индекс резистентности рассчитывали по  формуле (14):

 

ИФА

Клетки рассевали на 24-луночные планшеты по 50 000 клеток на лунку в 2 мл среды. Клетки культивировали 72 часа, после чего среду отбирали на анализ. Анализ проводили с помощью готовых наборов для ИФА, производства ООО «ХЕМА»: общий ПСА (обПСА, К221), тестостерон (К209), эстрадиол (К208). Исследование выполняли по рекомендациям производителя. Оптическую плотность определяли с помощью планшетного фотометра Thermo Scentific Multiskan FC (Thermo Scentific, США) при 450 нм. Концентрацию вещества в образцах определяли путем построения калибровочного графика на основании измерений калибровочных проб. Предел обнаружения данного набора для обПСА 0,005-30 нг/мл, тестостерона 0,15-100 нмоль/л, эстрадиола 0,025-20 нмоль/л.

Концентрации гормонов определяли в полной питательной среде для установки фонового уровня.

 

ОТ-ПЦР в реальном времени

Тотальную РНК выделяли набором «Лира+» (Биолабмикс, РФ) методом фенольной экстракции с колонным очищением. Синтез первой цепи кДНК осуществляли при помощи набора реактивов MMLV RT kit (РФ «ЗАО Евроген»). Real-time PCR осуществляли с помощью готового набора реактивов qPCRmix-HS SYBR, согласно рекомендациям производителя, с использованием олигонуклеотидов, представленных в таблице 1.

ПЦР проводили на приборе DT prime 5 (ДНК-Технология, РФ). Количество амплификатов определяли по флюоресценции. Калибровку проводили по референсному гену GAPDH. Стандартные кривые эффективности были построены по разведению комплементарной ДНК: 1:40, 1:80, 1:160, 1:320.

 

Таблица 1. Последовательность олигонуклеотидов в праймерах для ПЦР

	Прямой	Обратный	Температура отжига	Источник литературы
CYP17A1	GAGTTTGCTGTGGACAAGGG	CGCTGGATTCAAGAAACGCT	60	[23]
FOLH1	AACTGGACCCCAGGTCTGGA	GAGGATTTTATAAACCACCCGAA	60	[24]
ARFL	ACATCCTGCTCAAGACGCTTCTACC	CACTTGCACAGAGATGATCTCTGCC	60	[25]
GAPDH	GAAGGTGAAGGTCGGAGTC	GAAGATGGTGATGGGATTTC	60	[26]

 

Скретч-тест

Скретч-тест проводили на тонком монослое клеток, выращенных на пластиковых 6-луночных планшетах в 3 мл среды. Царапину создавали с помощью наконечника для автоматических дозаторов объёмом 200 мкл [27]. Образовавшиеся зазоры были сфотографированы сразу после нанесения царапины, через 24 часа и 48 часов. В работе использовался микроскоп Leica DMi1 (Leica Microsystems, Германия). Полученные изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения imagej (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, США), измеряли площадь зазора и ширину царапины. После этого рассчитывали процент закрытия царапины (WC%) и скорость миграции клеток (V мкм/ч). Процент закрытия царапины (WC%) рассчитывали по формуле (S₀-S₁)/S₀*100%, где S₀ — площадь раны сразу после её нанесения, S₁ — площадь раны после 24 и 48 часов культивирования. Скорость миграции клеток рассчитывали за 48 часов культивирования по формуле (S₀-S₁)/t, где t — время, прошедшее между измерениями ширины раны в часах [28].

Оценка туморогенности полученных клеточных линий

В опытах использовали мышей линии Balb c/nude возрастом 6–10 недель и массой тела 20–25 г, собственного разведения лаборатории биохимических основ фармакологии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Опухолевые клетки трансплантировали животным билатерально по 5×10⁶ клеток в 200 мкл питательной среды 199 с солями Хенкса без добавок на бок. Измерения объёма опухолевых узлов проводили раз в неделю в течение 45 суток электронным штангенциркулем.

Объем опухоли определяли по формуле:

 

V=π/6*(L*W*H)

Где L, W и H — три взаимноперпендикулярных измерения опухолевого узла.

Опыты, проведенные на животных, были выполнены в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. Протоколы опытов были утверждены на заседании локального этического комитета ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России номер 2025-4d от 21 октября 2025 года.

Статистические процедуры

Значение концентрации, необходимой для 50% ингибирования роста клеток (IC₅₀), определяли с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 9 (Graphpad Software, США). Модель регрессии представляет собой зависимость ингибирования роста клеток от концентрации используемого агента. Наличие значимых внутригрупповых отличий определяли с помощью анализа One-Way ANOVA (однофакторный дисперсионный анализ) с последующим сравнением групп при помощи Tukey’s multiple comparisons test (Тест множественных сравнений Тьюки).

Объемы опухолей были посчитаны с применением ПО Microsoft Excel  и GraphPad Prism 9 (Graphpad Software, США).

Результаты

Основные результаты исследования

Наработка лекарственной резистентности

DU145 считается андрогеннезависимой клеточной линией, LNCaP, напротив, считается чувствительной к андрогенам, что отражается в более высокой чувствительности LNCaP к абиратерону – основному антиандрогенному препарату (в 2,2 раза). Чувствительность к цисплатину и паклитакселу, напротив, почти в 2 раза ниже у клеток LNCaP в сравнении с клетками DU145, к доксорубицину чувствительность LNCaP выше в 12 раз. Значения IC₅₀, рассчитанные для различных препаратов в процессе наработки резистентности, приведены в табл. 2 и в приложении, рис. 1.

Таблица 2. Значения IC₅₀ для абиратерона, цисплатина, паклитаксела, доксорубицина в процессе выработки резистентности. В таблице представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Препараты	IC50, мкМ/л
	DU145			LNCaP
	0 пассаж	10 пассаж	20 пассаж	0 пассаж	10 пассаж	20 пассаж
Абиратерон	28,60±3,58	43,09±1,89	59,44±1,85	12,64±1,14	7,49±0,4	13,40±0,58
Цисплатин	1,08±0,06	4,37±0,22	4,98±0,32	2,004±0,09	1,04±0,03	0,76±0,02
Паклитаксел	0,01±0,01	0,21±0,05	0,95±0,13	0,03±0,01	ND	ND
Доксорубицин	0,21±0,01	0,18±0,01	1,93±0,25	0,02±0,01	ND	0,07±0,01

* - not determined (не определяли)

 

Чувствительность клеток DU145/AA к абиратерону снизилась в 1,5 раз к 10-му пассажу и почти в 2 раза к 20-му пассажу. У клеток LNCaP/AA снижения чувствительности к препарату после 20 пассажей не наблюдалось.

Чувствительность к цисплатину у клеток DU145/Cis интенсивно снижалась в течение первых 10 пассажей. Так, к 10-му пассажу чувствительность клеток к препарату снизилась в 4 раза, а к 20-му дополнительного снижения не наблюдали. У клеток LNCaP/Cis, наоборот, наблюдалось повышение чувствительности к цисплатину в процессе культивирования клеток с препаратом. Так, к 10-му пассажу чувствительность к цисплатину увеличилась практически в 2 раза, к 20-му пассажу — в 2,6 раз по сравнению с начальным уровнем IC₅₀.

Для клеток DU145/Dox чувствительность к доксорубицину уменьшилась после 20 пассажей в 9 раз. На культуре LNCaP/Dox наблюдалось снижение чувствительности в 4 раза после 20 пассажей с препаратом. Следует отметить, что клетки DU145 изначально плохо росли в присутствии доксорубицина, что выражалось в замедлении роста клеток с каждым пассажем и привело к полной остановке пролиферации к 5-му пассажу в присутствии препарата. Проблему устранили, повысив концентрацию клеток с препаратом при субкультивировании, изменив пересеваемое соотношение с ¼, как было рекомендовано в [29], до ½.

Самый высокий индекс резистентности отмечали у клеток DU145/Ptx. Уже к 10-му пассажу чувствительность к препарату снизилась в 19 раз, а к 20-му — в 86 раз. Клетки LNCaP менее чувствительны к паклитакселу, чем DU145, однако более 5 пассажей с препаратом культура LNCaP не выдерживала, и получить клетки LNCaP, устойчивые к паклитакселу, нам не удалось.

Таким образом, в ходе этих экспериментов удалось получить резистентные культуры DU145/AA, DU145/Cis, DU145/Dox, DU145/Ptx, LNCaP/Dox с индексами резистентности 2; 4,6; 9; 86 и 4, соответственно.

Подтверждение устойчивости достигнутого уровня резистентности.

На культурах клеток DU145/AA, DU145/Cis, DU145/Dox, DU145/Ptx была проведена проверка сохранения резистентности через 10 пассажей после отмены препарата и после заморозки, а также возможности восстановления резистентности при повторном культивировании клеток с препаратом. Размороженные клетки культивировали 3 пассажа, после чего проводили МТТ-тест, затем клетки культивировали с препаратом на протяжении еще трех пассажей (табл. 3 и приложение рис. 2).

Таблица 3. Стабильность уровня резистентности полученных культур DU145 после отмены препарата и заморозки. В таблице представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

	DU145/AA	DU145/Cis	DU145/Dox	DU145/Ptx
	IC50 mean±SEM
Исходная чувствительность к препарату	28,6±3,58	1,08±0,06	0,21±0,011	0,01±0,01
После 20 пассажей с препаратом	59,44±1,85	4,98±0,32	1,93±0,25	0,95±0,13
10 пассажей после отмены препарата	48,53±5,34	1,34±0,09	ND	0,08±0,02
После заморозки	30,3±2,80	2,76±0,22	1,5±0,13	0,02±0,01
3 пассажа с препаратом после заморозки	58,93±11,39	1,73±0,14	2,98±0,23	0,02±0,01

* - not determined (не определяли)

 

Наработанная резистентность ко всем препаратам после прекращения ко-инкубации и/или заморозки снижалась, особенно у клеток DU145/Ptx.

Перекрестная резистентность

У клеток DU145/AA не наблюдалось перекрестной резистентности с другими препаратами, у клеток LNCaP/AA наблюдалось увеличение чувствительности к цисплатину почти в 2 раза (1,7 раз) (см табл. 4 и приложение рис. 3-5). Соответственно, клетки, устойчивые к другим препаратам, не показали перекрестной резистентности к абиратерону, за исключением DU145/Dox, для которых чувствительность к абиратерону снизилась примерно на четверть.

По литературным данным терапия цисплатином позволяет преодолеть резистентность к доксорубицину [30]. В нашем случае наблюдали незначительное снижение IC₅₀ (уменьшение в 1,7 раз) в отношении доксорубицина у культуры DU145/Cis. Таким образом, клетки DU145/Cis оказались более чувствительными к доксорубицину по сравнению с исходной культурой, в то время как у DU145/Dox чувствительность к цисплатину не изменилась. При этом чувствительность LNCaP/Dox к цисплатину увеличилась в 2,2 раза. Культура LNCaP в целом демонстрировала увеличение чувствительности к цисплатину независимо от применяемого препарата. Перекрестная резистентность наблюдалась у культуры LNCaP/Cis к доксорубицину — увеличение IC₅₀ в 5 раз.

Клетки DU145/Cis и клетки DU145/Ptx демонстрировали перекрестную резистентность между цисплатином и паклитакселом. Так, культура DU145/Cis оказалась примерно в два раза менее чувствительной к паклитекселу по сравнению с исходной клеточной линией. Культура DU145/Ptx демонстрировала снижение чувствительности к цисплатину также в 2 раза. Клетки DU145/Ptx показали наличие перекрестной резистентности не только к цисплатину, но и к доксорубицину. Клетки DU145/Dox оказались в 33 раза более устойчивыми к паклитакселу, что можно охарактеризовать как наиболее значимую перекрестную резистентность, установленную в наших экспериментах. Также мы наблюдали увеличение значения IC₅₀ в 2 раза к доксорубицину у клеток DU145/Ptx.

Таблица 4. Перекрестная резистентность у полученных культур. В таблице представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

	Абиратерон	Цисплатин	Доксорубицин	Паклитаксел
Культура	IC50, мкМ/л
DU145	28,60±3,58	1,08±0,06	0,21±0,01	0,01±0,01
DU145/AA	59,44±1,85	0,96±0,045	0,18±0.01	0,02±0,01
DU145/Cis	33,18±4,53	4,98±0,32	0,12±0,01	0,03±0,01
DU145/Dox	39,61±2,10	1,16±0,16	1,93±0,25	0,37±0,1
DU145/Ptx	27,93±7,98	2,12±0,19	0,49±0,04	0,95±0,13
LnCAP	12,64±1,14	2,00±0,09	0,02±0,01	0,03±0,01
LnCAP/AA	13,40±0,58	1,15±0,04	0,10±0,01	ND
LnCAP/Cis	10,12±0,62	0,76±0,02	0,08±0,01	ND
LnCAP/Dox	9,13±0,4	0,87±0,03	0,07±0,01	ND

* - not determined (не определяли)

Скретч-тест

Инвазивность и химиорезистентность опухолевых клеток тесно связаны, что объяснено вовлечением одних и тех же сигнальных путей в регуляцию процессов клеточной миграции и возникновения устойчивости опухолей к терапии. Мигрирующие опухолевые клетки более устойчивы к химио- и лучевой терапии, чем неподвижные [31]. Таким образом, при помощи скретч-теста можно оценить изменения способности опухолевых клеток к инвазии, происходящие в клетках в процессе приобретения устойчивости к препаратам.

При культивировании в среде без сыворотки способность к миграции резистентных клеток DU145 убывает в следующем порядке: DU145/Cis > DU145/AA > DU145 > DU145/Ptx > DU145/Dox (см приложение рис. 6-9, таб. 1). Однако статистический анализ выявил значимые отличия (p=0,0075) только между контролем и DU145/Dox. При культивировании с сывороткой была прослежена та же тенденция — клетки, резистентные к абиратерону и цисплатину, мигрировали интенсивнее, чем клетки исходной культуры, а также клетки, резистентные к паклитакселу и доксорубицину, причем отличия по скорости зарастания раны были статистически значимыми (p<0,0001). Скорость миграции DU145/Cis была статистически достоверно выше, чем DU145/AA (p=0,0144). Клетки, резистентные к паклитакселу и доксорубицину, значимо не отличались по способности к миграции от контрольных клеток, однако процент закрытия царапины при культивировании без сыворотки для клеток DU145/Dox был значительно ниже, чем в контроле.

В бессывороточной среде скорость зарастания раны оказалась достоверно выше у клеток LNCaP/Cis и LNCaP/Dox по сравнению с родительскими клетками (p<0,0001). При этом клетки, резистентные к абиратерону, по этому показателю не отличаются от контрольных (LNCaP). Различий в скорости зарастания раны между LNCaP/Cis и LNCaP/Dox не отмечали. При культивировании клеток в полной среде скорость зарастания раны была выше у LNCaP/AA (p=0,0115) и LNCaP/Cis (p=0,0057), и она достоверно отличалась от контроля. Клетки LNCaP/Dox мигрировали быстрее контрольных, но медленнее LNCaP/AA и LNCaP/Cis, при этом значимо от них не отличаясь. Между LNCaP/AA и LNCaP/Cis статистически значимых различий не было.

В целом можно сделать вывод, что приобретенная резистентность к цисплатину и абиратерону приводит к увеличению миграционной способности клеток обеих культур, причем цисплатин-резистентные клетки во всех вариантах показали более высокую скорость миграции.

Изменение уровня стероидных гормонов и обПСА в процессе наработки резистентности

Изменения в содержании обПСА, тестостерона и эстрадиола приведены в табл. 5.

Таблица 5. Концентрация обПСА, тестостерона и эстрадиола в образцах исходных и резистентных культур DU145  и  LnCAP

Культура	Пассаж	обПСА	Тестостерон	Эстрадиол
		нг/мл	нмоль/л	нмоль/л
DU145		<0,005	2,17	2,53
DU145/AA	10	<0,005	2,06	1,76
	20	<0,005	2,68	3,24
DU145/Cis	10	<0,005	1,64	1,58
	20	<0,005	1,76	0,74
DU145/Dox	10	<0,005	1,91	1,52
	20	<0,005	1,91	1,92
DU145/Ptx	10	<0,005	1,79	1,22
	20	<0,005	1,78	1,30
LnCAP		>30	2,34	1,92
LnCAP/AA	10	28,98	2,55	1,21
	20	9,47	2,45	1,49
LnCAP/Cis	10	>30	2,33	2,53
	20	20,93	1,36	1,27
LnCAP/Dox	10	20,84	1,41	1,91
	20	>30	2,27	1,06
среды		0	1,29-2,26	1,18-1,97

Клетки LNCaP синтезируют не менее 30 нг/мл обПСА за 72 часа роста (верхний порог определения для метода 30 нг/л). Абиратерон существенно снижал выработку обПСА, начиная уже с 10-го пассажа ко-инкубации с препаратом (см приложение рис. 10). В образцах LNCaP/Dox снижение концентрации обПСА наблюдалось только в 10-м пассаже, а затем концентрация восстанавливалась. В клетках LNCaP/Cis обПСА снизился только к 20-му пассажу с препаратом. Уровни тестостерона и эстрадиола колебались в образцах сред, на которых культивировалась культура LNCaP, поэтому оценка их концентрации была проведена с учетом разницы в концентрациях гормона в средах. Повышение концентрации тестостерона наблюдалось в образцах LNCaP/AA 10-го пассажа и уже более заметно в образце LNCaP/AA и LNCaP/Dox 20-го пассажа, а в образцах LNCaP/Dox 10-го пассажа она заметно снижалась. В образце LNCaP/AA 10-го пассажа концентрация эстрадиола была примерно в 1,5 раза ниже, чем в среде. Только после 10 пассажей с цисплатином мы наблюдали активацию синтеза эстрадиола (см приложение рис. 11).

Для культуры клеток DU145 мы наблюдали исходную концентрацию тестостерона на том же уровне, что и в среде (см. приложение рис. 12). Это предсказуемо, поскольку клеточная линия DU145 считается андрогеннезависимой. В процессе ко-инкубации клеток с абиратероном мы наблюдали незначительное увеличение концентрации тестостерона к 20-му пассажу в 1,2 раза. К 20-му пассажу с цисплатином мы наблюдали самое значительное снижение концентрации гормона (в 1,7 раз). В остальных образцах отмечали незначительное снижение концентрации тестостерона (в 1,1–1,3 раза) по сравнению с концентрацией гормона в среде.

В образцах DU145 концентрация эстрадиола почти в 1,3 раза выше, чем в среде для культивирования клеток. К 20-му пассажу с абиратероном клетки демонстрировали синтез гормона, уровень которого был в 1,3 раза выше, чем в контрольных клетках и в 1,9 раз выше, чем уровень гормона в среде. Все резистентные культуры, кроме DU145/AA, демонстрировали падение уровня эстрадиола по сравнению с контролем (DU145).

 

Изменение экспрессии генов CYP17A1, ARFL и FOLH1 в процессе наработки резистентности.

Методом ОТ-ПЦР в реальном времени были определены значения нормированной по отношению к GAPDH экспрессии матричной РНК CYP17A1, ARFL, FOLH1 (приложение рис. 13, таб 2). Ген CYP17A1 кодирует 17α-гидроксилазу — ключевой фермент стероидогенеза, регулирующий синтез глюкокортикоидов и половых гормонов [32]. Экспрессия AR обнаруживается во всех первичных и метастатических РПЖ независимо от стадии заболевания [33], таким образом, сигнализация, опосредованная андрогеновым рецептором играет важную роль на всех стадиях заболевания, в том числе при КРРПЖ [34]. Экспрессия FOLH1 при РПЖ увеличивается с ростом агрессивности заболевания [35].

Исходный уровень экспрессии ARFL и FOLH1 в культурах клеток LNCaP был достоверно выше чем, в культуре DU145 (p<0,001). Уровень экспрессии CYP17A1 в культуре DU145 также был ниже, чем в культуре LNCaP, однако отличия были не достоверными. Полученные результаты соответствуют представлению о том, что культура DU145 считается андрогеннезависимой, в отличие от LNCaP [36].

Уровень экспрессии CYP17A1 более всего связан с приобретенной резистентностью к цисплатину, причем в обеих культурах (рис. 1). Так, для DU145/Cis экспрессия повысилась уже к 10-му пассажу (p<0,05). Однако, для LNCaP/Cis повышение экспрессии наблюдается только после 20 пассажей с препаратом, отличия статистически недостоверны. Для клеток DU145/Dox также наблюдается повышение экспрессии, но без статистической значимости. Абиратерон увеличивал экспрессию CYP17A1 к 10-му пассажу для DU145/АА, но не LNCaP/АА, при этом в обеих культурах наблюдалось падение экспрессии к 20-му пассажу (различия в средних значениях статистически не значимы).

Таблица 6. Уровень экспрессии CYP17A1, ARFL, FOLH1 в резистентных культурах.  В таблице представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

культура	Уровень экспрессии
	CYP17A1		ARFL		FOLH1
	10 пассаж	20 пассаж	10 пассаж	20 пассаж	10 пассаж	20 пассаж
DU145	0,13±0,04		<0,01		<0,01
DU145/AA	4,87±2,45	0,05±0,03	0,01±0,003	<0,01	<0,01	<0,01
DU145/Cis	7,05±1,12	6,35±1,02	0,14±0,01	0,03±0,01	<0,01	<0,01
DU145/Dox	4,57±1,37	2,71±1,08	0,09±0,02	0,02±0,02	<0,01	<0,01
DU145/Ptx	0,10±0,02	0,13±0,02	<0,01	<0,01	<0,01	<0,01
LNCaP	0,58±0,38		5,06±0,30		4,19±0,28
LNCaP/AA	0,54±0,08	0,09±0,00	9,65±0,11	1,93±1,39	8,38±1,61	4,61±0,50
LNCap/Cis	0,12±0,06	4,37±3,98	3,43±0,73	8,29±4,43	6,14±0,82	4,64±2,01
LNCaP/Dox	0,32±0,05	0,22±0,57	2,86±0,30	4,61±0,55	5,15±0,58	5,56±1,53

 

 

Рисунок 1. Уровень экспрессии CYP17A1 в резистентных культурах. На графиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Уровень экспрессии ARFL в культуре клеток DU145 был очень низким как в родительских клетках, так и в резистентных, тем не менее, после 10 пассажей с цисплатином и доксорубицином наблюдалось достоверное повышение экспрессии АР (p<0,01) (рис. 2). Между остальными образцами, как в культуре DU145, так и в культуре LNCaP, достоверных отличий между родительскими и резистентными клетками не отмечали. Однако при ко-инкубации клеток с абиратероном в обеих культурах к 10-му пассажу наблюдалось повышение экспрессии ARFL, которое падало к 20-му пассажу ниже уровня экспрессии в родительских клетках. Несмотря на отсутствие статистической достоверности, эта тенденция наблюдалась как для CYP17A1, так и для ARFL, причем в обеих культурах.

 

Рисунок 2. Экспрессия полноразмерного андрогенового рецептора (ARFL) в резистентных клетках. На графиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Клетки DU145 демонстрировали либо крайне низкую, либо не определимую экспрессию FOLH1 (рис. 3). В культуре LNCaP экспрессия FOLH1 была достоверно выше, чем в культуре DU145 (p<0,01), но резистентные клетки достоверно не отличались от родительских клеток. Тем не менее, в образцах LNCaP/AA 10-го пассажа наблюдали увеличение экспрессии FOLH1 почти в 2 раза по сравнению с родительскими клетками.

 

Рисунок 3. Экспрессия FOLH1 в резистентных клетках. На графиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Туморогенность резистентных культур клеток у мышей Balb/c nude.

Родительские клетки DU145, культивированные in vitro, в целом показывали нестабильный рост после подкожной трансплантации мышам Balb/c nude, демонстрируя значительный разброс в скорости роста ксенографтов. Резистентные клетки DU145/Cis, DU145/Dox и особенно DU145/Ptx демонстрировали повышенные скорости роста опухолей. Для DU145/Ptx на 29–36-е сутки роста средний объем опухолевых узлов статистически значимо превышал объём опухолевых узлов в контроле и DU145/AA (см. рис. 4). Экспрессия CYP17A1 в ксенографтных опухолях DU145, DU145/Dox, DU145/Ptx была на одном уровне, для DU145/Cis снижалась в 2 раза, а в DU145/AA повысилась в 2 раза, но без статистической достоверности (см. приложение рис. 14-15, таб 3-5).

 

Рисунок 4. Динамика роста опухолевых ксенографтов резистентных культур DU145 на мышиных моделях. На графиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Культура клеток LNCaP, как родительская, так и резистентные клоны, в мышах Balb/c nude оказались не туморогенны.

Обсуждение

Создание моделей рака предстательной железы, резистентных к абиратерону и таксанам, необходимо для исследования противоопухолевой активности новых агентов, таких как производные андростанов и прегнанов способные ингибировать активность CYP17A1 [37-38], особенно малых молекул таргетированных на ПСМА и конъюгированных с доцетакселом или абератероном [39-40], с целью поиска вариантов второй или третьей линии терапии резистентных форм РПЖ. Другой целью нашего исследования являлось создание моделей, которые могут быть использованы для изучения молекулярных механизмов развития резистентности, исследования изменения экспрессии клинически значимых генов и перекрестной резистентности.  Следует в целом отметить весьма ограниченный спектр моделей РПЖ, которые могут быть использованы для экспериментального изучения новых лекарственных препаратов. Так новый ингибитор CYP17A1 алсевирон, был эффективнее абиратерона при тестировании препарата на классических клеточных линиях РПЖ - 22Rv1, DU145, LNCaP [41], однако, остается неясным насколько препарат эффективен в качестве аналога при химиорезистентности к абиратерону.

Все выбранные нами препараты для наработки приобретенной резистентности отличаются по механизму действия. Механизм возникновения резистентности к ним, по данным литературы, также различен. Так, механизм резистентности к таксанам вызван либо активацией Р-гликопротеина [42], либо мутациями c заменой аминокислотных остатков в области петли H6-H7 β-тубулина [43-44], к цисплатину — с инактивацией препарата и усилением репарации ДНК [45-46], к абиратерону — с изменениями в активности АР [34], к доксорубицину — с активацией Р-гликопротеина [47].

Использованный нами с целью получения резистентных клеточных линий режим культивирования показал, что таким образом можно получить клетки, IR которых будет близким к моделям, полученным от пациентов после химиотерапии. В клетках, полученных у пациентов после приобретения резистентности, уровень резистентности колебался от 2 до 6 раз, что соответствует результатам, полученным нами (за исключением паклитаксела, где уровень был выше).

Самый высокий индекс резистентности наблюдался на культуре DU145/Ptx, что соотносится с литературными данными, где IR колеблется от 34 до 510 [48-52].

К ограничениям нашего исследования можно отнести обратимость наработанной резистентности. На различных клеточных линиях и препаратах было показано, что для наработки устойчивой резистентности лучшим выбором является непрерывное культивирование в присутствии препарата [14, 53-54], в то время как в нашей работе применяли прерывистое культивирование (кроме абиратерона). На модели рака легкого при непрерывном и периодическом культивировании значения индекса резистентности близки, но устойчивость полученных значений выше при непрерывном культивировании [53-54].

Полученная нами в ходе работы резистентность была относительно неустойчивой и возвращалась к исходному уровню чувствительности  уже через 10 циклов культивирования клеток в отсутствие препаратов. Кроме того, после заморозки IC₅₀ резистентных культур падала, но быстро восстанавливалась при добавлении препаратов. Другие исследователи после получения резистентных культур поддерживали полученный низкий уровень чувствительности путем культивирования клеток с невысокой концентрацией препарата в течение последующих опытов.

В нашем опыте абиратерон не демонстрировал перекрестную резистентность к другим препаратам, за исключением DU145/Dox, где чувствительность к абиратерону снизилась примерно на 25%. Чувствительность к цисплатину возрастала у культуры LNCaP после наработки резистентности ко всем использованным препаратам, в том числе абиратероном. Суммируя наши данные с литературными, мы можем утверждать, что клетки РПЖ, нечувствительные к андрогенам и соответственно к АДТ (андрогенной депривации), могут сохранять чувствительность к цисплатину [55].

Мы наблюдали перекрестную резистентность между цисплатином и паклитакселом в культуре DU145, причем увеличение чувствительности было как у клеток, резистентных к цисплатину, по отношению к паклитакселу, так и наоборот — клетки, резистентные к паклитакселу, менее чувствительны к цисплатину. Перекрестная резистентность между циплатином и паклитакселом ранее была описана на клеточной линии рака яичника и была вызвана повышенной экспрессией P-гликопротеина (Pg). При этом данный белок не влиял на резистентность к цисплатину, что было показано после обработки клеток элакридаром (ингибитором Pg): после подавления Pg клетки сохранили устойчивость к цисплатину. Исследователи объясняют это тем, что продукция белка стимулируется стрессом, вызванным воздействием препарата, но не непосредственно цисплатином [56]. Такая же сильная перекрестная резистентность наблюдалась на цисплатин-резистентных линиях рака мочевого пузыря, которые были более чувствительны к паклитакселу по сравнению с исходными клетками. При этом повышенной чувствительности паклитаксел-резистентных клеточных линий к цисплатину не наблюдалось [57]. На культуре DU145 не наблюдали перекрестной резистентности у паклитакселрезистентной линии DU145-TxR к цисплатину [48].

Перекрестная резистентность к паклитакселу клеток DU145/Dox оказалась самой значимой — чувствительность снижалась в 33 раза. В исследовании [46] культура DU145/Ptx также демонстрировала перекрестную резистентность между паклитакселом и доксорубицином [48].

На клеточной линии 22Rv1, было продемонстрировано, что абиратерон ослабляет, но не останавливает синтез андрогенов полностью [58]. В нашем опыте резистентные к абиратерону клетки LNCaP и DU145 демонстрировали падение экспрессии CYP17A1. Интересно, что статистически значимое повышение экспрессии данного гена наблюдалось только в ответ на цисплатин, а не абиратерон. В [59] показано, что стероидогенез под действием цисплатина может подавляться за счет индукции образования активных форм кислорода (АФК). Препарат снижает связывание с субстратом рецепторов ЛГ в клетках Лейдига на 80% и угнетает активность 17α-гидроксилазы  и цитохрома P-450, что снижает скорость синтеза тестостерона [60]. В опытах на крысах цисплатин снижал уровень тестостерона в плазме крови на 70% [61]. В других экспериментах лечение блеомицином, этопозидом и цисплатином стимулировало транскрипцию CYP17A1 [62].

В DU145/Ptx не наблюдается изменения экспрессии CYP17A1, ARFL и FOLH1 по сравнению с родительскими клетками, уровень стероидных гормонов в образцах также оставался без изменений. Из этого можно сделать вывод, что резистентность к паклитакселу никак не влияет на стероидогенез в раковых клетках.

В клетках DU145, а также DU145/AA концентрация эстрадиола превышает концентрацию тестостерона, в отличие от среды, где тестостерона больше. Это важное наблюдение, поскольку соотношение андрогенов к эстрогенам в клинической практике коррелирует с прогрессированием РПЖ. У больных РПЖ наблюдается повышение концентрации в крови эстрадиола [63]. Высокие уровни эстрадиола, особенно на фоне низкого уровня тестостерона увеличивает риск развития РПЖ. В клинических исследованиях [64] показано, что высокие уровни эстрадиола в крови больных РПЖ, особенно при прогрессировании заболевания, могут указывать на изменения в чувствительности к стероидным гормонам, и рекомендует применять антиэстрогенную терапию [64].

Поскольку инвазивность и химиорезистентность тесно связаны [31], мы также оценили миграционную способность полученных нами резистентных клеток при помощи скретч-теста. Главной задачей скретч-теста является оценка миграционной способности клеток, но нужно учитывать, что клетки в лунке продолжают пролиферировать, что может помешать правильной интерпретации результатов. Самый простой способ подавить пролиферацию клеток — убрать сыворотку из среды для культивирования. С другой стороны, отсутствие сыворотки влияет на метаболизм клеток, что в нашем случае важно, поскольку пролиферация клеток РПЖ зависит от стероидных гормонов, которые определяются в средах с сывороткой. Поэтому мы оценивали миграцию клеток как в среде без сыворотки, так и в полной среде [65]. Полученные результаты при культивировании в полной среде и среде без сыворотки в нашем случае действительно отличались. Так скорость миграции клеток LNCaP/Dox была достоверно выше родительской культуры только в среде без сыворотки, но в полной среде разница была уже недостоверной. Клетки LNCaP/AA, напротив, в полной среде мигрировали активнее родительских клеток. Независимо от культуры и среды для культивирования активнее всего мигрировали клетки, устойчивые к цисплатину. Также для обеих культур скорость миграции увеличивалась в ответ на ко-инкубацию с абиратероном. Доксорубицин немного увеличивал миграцию только LNCaP/Dox. Устойчивость к паклитакселу, наоборот, снижала клеточную миграцию.

Ограничения исследования

Результаты исследований могут зависеть от схемы получения резистентных культур – непрерывное или прерывистое культивирование с препаратом, первоначальная концентрация препарата, длительность работы с культурами.

Заключение

Использованная нами схема получения резистентных культур позволяет получить клеточные модели, уровень резистентности которых соответствует клинически значимым моделям. Обнаружена перекрестная резистентность между цисплатином и паклитакселом, паклитакселом и доксорубицином, доксорубицином и цисплатином. На клетках LNCaP/AA наблюдали перекрестная резистентность к цисплатину. Культивирование клеток с препаратами либо снижает синтез стероидных гормонов, либо не оказывает существенное влияние, за исключение воздействия абиратерона. Резистентность к абиратерону и цисплатину может усиливать инвазивность опухолевых клеток.

 

 

Таблицы

Таблица 1. Скорость миграции клеток. В таблице представлены средние значения со стандартные ошибки средних значений (SEM)

культура	Скорость миграции клеток, V, мкм/ч
	Бессывороточная среда	Полная среда
DU145	1,56±0,09	1,95±0,07
DU145/AA	1,60±0,20	3,87±0,18
DU145/Cis	2,00±0,08	4,60±0,00
DU145/Dox	0,26±0,15	2,17±0,17
DU145/Ptx	0,88±0,15	1,65±0,07
LNCaP	0,92±0,06	1,22±0,11
LNCaP/AA	0,95±0,01	2,07±0,08
LNCaP/Cis	1,33±0,01	2,18±0,23
LNCaP/Dox	1,40±0,03	1,50±0,07

Таблица 2. Уровень экспрессии CYP17A1, PSMA, ARFL культур DU145 и LNCaP. В таблице представлены средние значения со стандартной ошибкой (SEM)

Культура/ген	CYP17A1	ARFL	FOLH1
DU145	0,13±0,04	0,002±0,003	<0,01
LNCaP	0,59±0,38	5,06±0,30	4,19±0,28

Таблица 3. Вес опухолевых узлов ксенотрансплантантов резистентных клеток DU145. В таблице представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

культура	DU145	DU145/AA	DU145/Cis	DU145/Dox	DU145/Ptx
Средний вес опухолевых узлов, г	0,11±0,05	0,04±0,00	0,26±0,02	0,42±0,22	0,26±0,06

Таблица 4. Средний объём опухолевых узлов ксенотрансплантантов резистентных клеток DU145. В таблице представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

	Средний объём опухолевых узлов, мм³
Сутки роста	2	7	15	22	29	36	48
DU145	46,55±14,39	24,62±8,09	2,16±1,32	2,22±2,09	4,43±3,44	9,77±7,34	64,23±34,82
DU145/AA	30,15±10,17	8,52±2,58	1,41±1,41	0,00±0,00	0,13±0,13	0,13±0,13	1,84±1,84
DU145/Cis	62,18±29,11	25,79±11,09	3,71±3,71	2,35±2,35	24,39±10,23	97,57±2,78	402,80±11,99
DU145/Dox	25,81±2,30	19,64±2,66	2,61±1,82	5,20±2,86	21,37±11,10	50,89±27,07	307,00±167,90
DU145/Ptx	34,42±8,35	18,74±3,22	20,93±4,24	32,97±6,32	47,91±8,82	127,20±29,65	324,80±96,13

Таблица 5. Экспрессия CYP17A1 у ксенографтов DU145. В таблице представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

	DU145	DU145/AA	DU145/Cis	DU145/Dox	DU145/Ptx
CYP17A1	0,94±0,51	2,05±0,00	0,47±0,10	1,01±0,65	0,93±0,62

 

 

Рисунки

Рисунок 1. Изменение чувствительности клеток DU145 и LNCaP к препаратам в процессе выработки резистентности

Рисунок 2. Стабильность уровня резистентности полученных культур DU145 после отмены препарата и заморозки

Рисунок 3. Перекрестная резистентность DU145/AA и DU145/Cis к другим исследуемым препаратам

Рисунок 4. Перекрестная резистентность DU145/Dox и DU145/Ptx к другим препаратам

Рисунок 5. Графики перекрестной резистентности у LNCaP/AA, LNCaP/Cis, LNCaP/Dox

Рисунок 6. Результаты скретч-тестов для исходных и резистентных культур DU145 и LNCaP. На графиках указан процент закрытия раны (WC%), который рассчитывается по формуле (S0-S1)/S0*100%, где S0 – площадь раны сразу после ее нанесения, S1 – площадь раны по истечению 24 или 48 часов культивирования

Рисунок 7. Скорость миграции клеток. На графике представлены средние значения со стандартными ошибками средних значений (SEM). Средняя скорость миграции клеток за 48 часов культивирования рассчитывается по формуле (S0-S1)/t, где S0 – площадь раны сразу после ее нанесения

Рисунок 8. Скретч-тест DU145. Фото царапин

Рисунок 9. Скретч-тест LNCaP. Фото царапин

Рисунок 10. Концентрация обПСА в образцах культуры LNCaP. Значения выше 30 нг/л приблизительные, поскольку верхний предел определяемых концентраций для данного набора ИФА 30 нг/л. На графиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Рисунок 11. Концентрация тестостерона и эстрадиола в образцах культуры LNCaP. На грфиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Рисунок 12. Концентрация тестостерона и эстрадиола в образцах культуры DU145. На графиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Рисунок 13. Уровень экспрессии CYP17A1, ARFL, FOLH1 культур DU145 и LNCaP. На графиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Рисунок 14. Вес опухолевых узлов ксенотрансплантантов резистентных клеток DU145. На графиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

Рисунок 15. Средний объём опухолевых узлов cо 2 по 48 день после имплантации ксенотрансплантантов резистентных клеток DU145. На графиках представлены средние и стандартные ошибки средних значений (SEM)

About the authors

Elena A. Demidova

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: badjito@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6511-3423
SPIN-code: 5969-2210
Scopus Author ID: 58497761100
ResearcherId: HLH-7186-2023

Research Assistant

Russian Federation, 24 Kashirskoe shosse, Moskow 115478

Irina I. Khan

Blokhin National Medical Research Center of Oncology; RUDN University

Email: irinchek05@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2948-0872
SPIN-code: 6826-7694
Scopus Author ID: 57220811478

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, 24 Kashirskoe shosse, Moskow 115478; Moscow

Daria A. Popova

RUDN University

Email: darypo9826@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-7723-8653
Moscow

Tatyana S. Spirina

Patrice Lumumba Peoples' Friendship University of Russia; N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: spirtatjana@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7631-3116
SPIN-code: 8373-1284
Scopus Author ID: 6603720118
ResearcherId: W-4832-2019
Russian Federation, Moscow; Moscow

Darina V. Sokolova

RUDN University; Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: d.v.sokolova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3972-2425
SPIN-code: 2960-4800
Scopus Author ID: 57217869250

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Vadim S. Pokrovsky

RUDN University; Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: v.pokrovsky@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0003-4006-9320
SPIN-code: 4552-1226
Scopus Author ID: 57193753209

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files