Carbonic Anhydrases as Therapeutic Targets in Cancer: Pathogenetic Mechanisms and Prospects for Inhibitor Development

Full Text

ВВЕДЕНИЕ
На сегодняшний день проблема диссеминирования злокачественных новообразований (ЗНО) остаётся одной из ключевых в онкологии. Метастатический процесс напрямую влияет на прогноз заболевания и продолжительность жизни пациента. Современные исследования всё чаще сосредотачиваются на молекулярных механизмах выживания раковых клеток, в том числе в условиях гипоксии и ацидоза. В частности, в центре внимания находятся ферменты, участвующие в регуляции pH, среди которых важную роль играют карбоновые ангидразы IX и XII (CA IX и CA XII) [1–3] . На ранних этапах опухолевого роста клетки, испытывая дефицит кислорода, растут без нормального кровоснабжения. Это сопровождается накоплением кислых продуктов обмена, являющихся результатом усиленного гликолиза и слабого сосудистого оттока [1, 2]. В таких условиях увеличивается расстояние между клетками, затрудняется доставка кислорода, и гипоксия только усиливается. Чтобы выжить, опухоль активирует ангиогенез, формируя новые, хоть и не всегда полноценные, сосуды. Это помогает клеткам расти и распространяться, повышая риск метастазов. Известно, что в ответ на гипоксию и ацидоз опухолевые клетки начинают активно экспрессировать CA IX и CA XII — ферменты, которые помогают им поддерживать внутреннюю среду и выживать в агрессивных условиях [1, 3]. При этом CA IX преимущественно ассоциирована с гипоксическими и агрессивными регионами опухоли (в частности, в центре опухоли). CA XII часто ко-экспрессируется с CA IX и участвует в pH-регуляции в различных компартментах опухоли, включая инвазивный фронт [1].
БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ КАРБОАНГИДРАЗ
Буферная система CO₂/HCO₃⁻ играет важную роль в поддержании кислотно-щелочного равновесия, особенно в условиях клеточного метаболизма за счет обеспечения стабильного уровня pH и удаления избытка CO₂ [2]. Однако эффективность этой системы может быть ограничена медленной кинетикой некатализируемой гидратации CO₂ и дегидратации HCO₃⁻. Без катализатора медленный обмен между CO₂ и HCO₃⁻ может затруднить транспорт H⁺ как внутри клетки, так и через мембрану [4].
     В организме человека эту регуляцию во многом обеспечивают ферменты семейства α-карбоангидраз — цинк-зависимые металлоэнзимы, катализирующие обратимое превращение углекислого газа в бикарбонат [4].  У человека обнаружено 15 различных изоформ CA, из которых можно выделить цитозольные изоферменты (CA I, CA II, CA III, CA VII, CA XIII), митохондриальные изоферменты (CA VA и CA VB), мембранно-связанные изоферменты (CA IV, CA IX, CA XII, CA XIV) и секретируемый изофермент (CA VI) [4]. Кроме этих функциональных изоферментов существуют три некаталитических представителя (CA VIII, CA X, CA XI), которые не содержат Zn²⁺ и чья роль в организме до конца неизвестна. 
Каталитический домен CA состоит из β-слоя, состоящего из 10 цепочек, окруженных семью α-спиралями. Активный сайт представляет собой конусовидную полость, в основании которой находится атом цинка, координированный тремя остатками гистидина (His94, His96 и His119) и  молекулой воды/гидроксида [5]. Каталитический активный центр CA разделен на гидрофобную и гидрофильную зоны, что критически важно для эффективного связывания нейтрального субстрата CO₂ и последующего высвобождения заряженного продукта реакции – иона HCO₃⁻.  Остаток треонина (Thr199) участвует в переносе протона в активном центре, а остаток глутамата (Glu106) обеспечивает стабилизацию и механизм катализа. 
Механизм действия CA проходит в несколько этапов:
1.    Нуклеофильная атака молекулы CO₂, гидроксид-ионом, связанным с Zn²⁺ в области гидрофобного кармана;
2.    Образование промежуточного комплекса и его перестройка в бикарбонат-ион, слабо координированный c ионом цинка Zn²⁺;
3.    Вытеснение иона – HCO₃ молекулой воды;
4.    Перенос протона от молекулы воды от молекулы воды, связанной с цинком, на буферную систему раствора (при участии остатка Thr199 и других переносчиков протона), что восстанавливает активную форму фермента; [3]
     Благодаря участию в этой фундаментальной реакции, CA играют центральную роль в разнообразных физиологических процессах, включая транспорт дыхательных газов, процессы секреции и реабсорбции в почках, продукцию цереброспинальной и внутриглазной жидкости, секреции кислоты остеокластами при резорбции кости, а также в трансэпителиальном транспорте ионов и жидкости. Регулируя внутри- и внеклеточный pH,  CA опосредованно влияют на такие метаболические пути, как глюконеогенез, уреогенез и липогенез, что подчеркивает их важность для обеспечения гомеостаза и практически каждой клеточной функции [3].
CA IX И CA XII В ПАТОГЕНЕЗЕ ОПУХОЛИ: ОТ ГИПОКСИИ К НАРУШЕНИЮ КИСЛОТНО-ЩЕЛОЧНОГО ГОМЕОСТАЗА
Гипоксия — это состояние, характеризующееся снижением напряжения кислорода в тканях, её наличие является одним из ключевых признаков начала опухолевого процесса [6]. В ответ на недостаток кислорода в клетке активизируется комплекс HIF-1 (от англ. Hypoxia-Inducible Factor 1) — основной регулятор кислотного-щелочного гомеостаза в условиях гипоксии [1, 6]. HIF-1 представляет собой гетеродимер, состоящий из кислород-чувствительной субъединицы (HIF-1α) и конститутивно экспрессируемой субъединицы HIF-1β (ARNT).  В норме HIF-1α быстро разрушается под действием пролилгидроксилаз (PHD) и фактора, ингибирующего HIF (FIH). В условиях гипоксии этот процесс подавляется, что приводит к накоплению HIF-1α, его димеризации с HIF-1β в ядре и образованию активного транскрипционного фактора. Связываясь с элементами ответа на гипоксию (HRE) в ДНК, HIF-1 активирует экспрессию генов, способствующих выживанию в условиях нехватки кислорода: факторов ангиогенеза (VEGF), гликолитических ферментов (LDH, HK2) и транспортеров глюкозы (GLUT-1, GLUT-3) [6]. 
Этот метаболический сдвиг, известный как «эффект Варбурга», заключается в переходе на кислород-независимый гликолиз даже при наличии кислорода [7]. Это приводит к повышенной продукции лактата и протонов (H⁺), что угрожает закислением внутриклеточного pH (pHi)  и нарушением жизненно важных функций клетки [2]. Для поддержания нормального pHi опухолевые клетки активируют мощные системы регуляции pH, которые работают по двум направлениям: 1) экспорт лактата и протонов и 2) импорт бикарбоната (HCO₃⁻) [3, 4]. Ключевыми игроками в экспорте кислот являются протон-связанные монокарбоксилатные транспортеры (MCT4 и MCT1), обменник Na⁺/H⁺ (NHE1) и вакуолярная H⁺-АТФаза [4]. Импорт бикарбоната осуществляется с помощью анионных обменников (AE), натрий-бикарбонатных ко-транспортеров (NBCe1, NBCn1) и  других молекул [4]. 
Центральным элементом этой системы pH-контроля, индуцируемым непосредственно HIF-1, является CA IX [1]. В отличие от практически повсеместно экспрессируемой CA XII, которая регулируется в основном эстрогенами и в меньшей степени гипоксией, CA IX является высокоспецифичным маркером гипоксии и агрессивных опухолей. Несмотря на различия в регуляции и экспрессии, обе изоформы выполняют критически важную функцию в опухоли, работая в метаболоне с транспортерами. Внеклеточный каталитический домен CA IX (и CA XII) гидратирует CO₂ с образованием протонов (H⁺) и ионов бикарбоната (HCO₃⁻) прямо у клеточной мембраны [1]. Протоны остаются во внеклеточном матриксе, усугубляя его закисление (pHe), что способствует инвазии, метастазированию и подавлению иммунного ответа [6]. Ионы бикарбоната импортируются в клетку с помощью ко-транспортеров (NBCe1, NBCn1), где они нейтрализуют внутриклеточные протоны, превращаясь в CO₂, который покидает клетку путем диффузии [3]. Этот цикл, известный как цикл Якоба-Стюарта, в котором CA IX действует в трех ключевых точках: он генерирует внеклеточные протоны (для снижения pHe), обеспечивает ионы бикарбоната для транспорта и внутриклеточного потребления протонов (для повышения pHi) и облегчает диффузию CO₂ (для поддержания градиента pHi>pHe) (рис. 1) [1, 3] . 
CA XII действует подобно CA IX и имеет значение в патофизиологии опухолей, однако между этими ферментами существуют принципиальные различия, представленные в таблице №1 (по данным [1], с дополнениями из [6] и [4]).
СТРАТЕГИИ В ИНГИБИРОВАНИИ CA IX/XII 
ПРЯМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ 
Учитывая ключевую роль CA IX и XII в выживании и прогрессии опухолевых клеток, они представляют собой привлекательные мишени для терапии. Ингибиторы CA, в частности сульфаниламиды и их производные, ранее применявшиеся как противоглаукомные препараты, исследуются в качестве потенциальных противоопухолевых агентов. Сульфаниламиды в анионной форме непосредственно координируют ион Zn²⁺ в активном центре фермента именно за счет сульфамидной группы (ZBG, от англ. Zinc Binding Group), которая выступает в роли лиганда [8]. Кроме того, ZBG также взаимодействует с остатками Thr199 и Glu106, стабилизируя комплекс [5]. 
Основным недостатком этого класса является отсутствие селективности, так как они  ингибируют все каталитически активные изоформы карбоангидраз, что приводит к многочисленным побочным эффектам [4, 8]. Для решения этой проблемы был разработан «трёххвостовый» (TTI, от англ. Three-Tails Approach) подход к синтезу ингибиторов (рис. 2) [9]. Его суть заключается в присоединении к каркасу ингибитора трех «хвостов», предназначенных для взаимодействия с вариабельными остатками в средней и внешней частях активного центра различных изоформ (рис. 3). Это позволяет придать соединению водорастворимость и, главное, высокую комплементарность к активному центру конкретной мишени, обеспечивая селективное ингибирование. В качестве примера, в работе Bonardi et al. было показано, что «трёххвостовые» бензолсульфонамидные ингибиторы CA по TTI-подходу обладают высокой селективностью в отношении опухолеассоциированных изоформ CA IX и XII по сравнению с нецелевыми изоформами CA I и II (рис. 4) [9].
НЕПРЯМОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ 
Связывание ингибиторов CA на воде/гидроксид-анионе, координированном цинком 
В отличие от сульфаниламидов, ингибиторы этого класса не координируют ион цинка напрямую, а взаимодействуют с молекулой воды или гидроксид-ионом, координированным с ним в активном центре (рис. 5). Их структура обычно состоит из  анкерной группы (AG), которая крепится к молекулярному каркасу [10, 11]. Этот каркас может нести дополнительные заместители («хвосты»), предназначенные для взаимодействия с гидрофильной и гидрофобной зонами активного центра, что повышает сродство и, главное,  селективность связывания. 
Анкерные группы представлены разнообразными функциональными группами, включая фенольный гидроксил (-OH), первичную аминогруппу (-NH₂), карбоксильную группу (-COOH), сложный эфир (-COOMe) и сульфогруппу (-SO₃H). Каркасы этих соединений могут быть ароматическими, алифатическими, гетероциклическими или сахароподобными [10]. 
К этому классу ингибиторов относятся:
• Фенолы и полифенолы: их гидроксильные группы образуют водородные связи с водой/гидроксид-ионом у цинка, а гидрофобное ароматическое кольцо вступает в ван-дер-ваальсовы взаимодействия с гидрофобной стенкой активного центра [10].
• Полиамины (например, спермин и спермидин): связываются через водородные связи с участием терминальных протонированных аминогрупп (аммониевых ионов) [4, 10].
• Карбоксилаты — могут ингибировать CA несколькими путями: вытесняя воду/гидроксид-ион, образуя водородные связи с ними или связываясь в кармане у входа в активный центр [10].
• Гидролизованные сульфокумарины и 2-тиокумарины: Сульфокумарины гидролизуются эстеразной активностью КА, а образующийся продукт, содержащий сульфогруппу, и связывается с водой/гидроксид-ионом у цинка [11]. 2-Тиокумарины действуют аналогично гидролизуясь до тиольных производных.
Ингибиторы карбоангидразы, действующие за счет окклюзии входа в активный сайт
Область входа в активный сайт карбоангидраз (CA) отличается высокой вариабельностью среди различных изоформ, в отличие от более консервативного каталитического ядра [11]. Это позволяет создавать селективные ингибиторы, которые с помощью «липких групп» (SG) или дополнительных гидрофобных «хвостов» связываются с вариабельными аминокислотными остатками у входа в активный центр, стерически блокируя доступ субстратов и ионов (механизм окклюзии) (рис. 6). 
Классическим примером ингибиторов такого типа являются кумарины и их производные. Их механизм действия уникален: под действием эстеразной активности CA лактонное кольцо кумарина гидролизуется с образованием  2-гидроксициннамовых кислот [11]. Эти продукты могут существовать в виде цис- и транс-изомеров, что критически влияет на их активность [12]. 
• В цис-изомере заместители R и R’ расположены по одну сторону от двойной связи, что создает выраженное стерическое препятствие для глубокого проникновения в активный сайт. Однако эта же особенность способствует повышению селективности, так как изогнутая конформация способствует оптимальному взаимодействию с «липкими» участками у входа в активный центр [11, 12].
• В транс-изомере заместители R и R’ располагаются по разные стороны от двойной связи, что делает молекулу плоской и позволяет ей глубже проникать в область активного сайта, повышая аффинность [12].
     В серии работ Alfonso Maresca были исследованы разнообразно замещённые производные кумарина и тиокумарина, продемонстрировавшие выраженную селективность в отношении различных изоформ карбоангидразы, включая CA IX, XII, XIII, XIV [11]. Наибольшую аффинность к опухолеассоциированной изоформе CA IX проявляли соединения с определёнными заместителями в положениях 7 и 8 кумаринового кольца. Результаты показали, что именно эти позиции играют ключевую роль в формировании «липких» взаимодействий с вариабельной областью входа в активный центр, что делает их важными с точки зрения дальнейшего дизайна противоопухолевых агентов. CA XII также эффективно ингибировалась этими соединениями, хотя и менее избирательно по сравнению с CA IX.
Аллостерическое ингибирование: блокирование протонного транспорта
Остаток гистидина-64 (His64) играет ключевую роль в механизме гидратации CO₂, катализируемой CA, выполняя функцию переносчика протонов между активным центром и буферной системой раствора [13]. Этот процесс осуществляется благодаря способности His64 переходить между двумя конформациями [14]. Во внутренней (in) конформации His64 захватывает протон от молекулы воды, связанной с ионом цинка (Zn²⁺-H₂O), превращая её в гидроксид-ион (Zn²⁺-OH⁻). Затем, переходя во внешнюю (out) конформацию, остаток отдаёт протон в окружающую среду, подготавливаясь к новому циклу.
В качестве примера ингибирования, нацеленного на этот процесс, 2-(бензолсульфонил)бензойная кислота демонстрирует новый механизм действия (рис. 7). Она связывается в области входа в активный сайт и образует водородные связи с His64, фиксируя его в стабильной out-конформации. Это блокирует возврат остатка для захвата следующего протона, тем самым нарушая протонный транспорт и каталитический цикл фермента[15]. 
В исследовании Katia D’Ambrosio было показано, что данное соединение является мощным ингибитором hCA II (Kᵢ = 0,15 мкМ) и эффективно подавляет активность hCA IX (Kᵢ в низком микромолярном диапазоне), но при этом слабо действует на hCA I и hCA XII [15]. Такая избирательность подтверждает перспективность направленного воздействия на систему протонного шаттла для создания селективных ингибиторов.
ПОСЛЕДНИЕ ДОСТИЖЕНИЯ В ИНГИБИРОВАНИИ CA IX И CA XII В ОПУХОЛЯХ
SLC-0111 (4-[(4-фторфенил)карбамоил]аминобензолсульфонамид) —селективный ингибитор CA IX, представляющий собой бензолсульфонамид с уреидным заместителем, который демонстрирует высокую селективность и потенциал для лечения гипоксических опухолей (рис. 8) [16]. Химическая структура SLC-0111 включает ключевые фармакофоры, необходимые для разработки новых соединений, селективно ингибирующих CA IX. Его структура включает ключевые фармакофоры: 1) сульфамидную группу для координации с цинком; 2) уреидный фрагмент для оптимального позиционирования; и 3) гидрофобный "хвост" (4-фторфенил) для взаимодействия с гидрофобной частью активного центра. 
SLC-0111 проявляет высокую селективность в ингибировании CA IX и CA XII. В доклинических моделях он замедляет рост опухоли и повышает эффективность химиотерапии в комбинации с темозоломидом [8]. В клеточных линиях SLC-0111 повышал эффективность дакарбазина, темозоломида, доксорубицина и 5-фторурацила против в клеточных линиях меланомы, рака молочной железы и колоректального рака. Ингибирование CA IX способствует нормализации опухолевой микросреды, уменьшая гипоксию и ацидоз. Это, в свою очередь, может повысить восприимчивость опухоли к иммунной атаке, в том числе к терапии анти-PD-1/PD-L1, за счёт снижения иммуносупрессивного микроокружения и восстановления функции T-клеток [17]. Препарат SLC-0111 успешно прошёл I фазу клинических испытаний у пациентов с распространенными (метастатическими) солидными опухолями различной локализации, продемонстрировав приемлемый профиль безопасности и фармакокинетики. Была установлена рекомендуемая доза для дальнейших исследований — 1000 мг/сут [16]. Исследование Ib/II фазы по оценке эффективности комбинации SLC-0111 с гемцитабином у пациентов с метастатическим раком поджелудочной железы, экспрессирующим CA IX, было завершено досрочно (NCT03450018).
Для повышения селективности аналогов SLC-0111 широко применяется подход биоизостерической замены. Арильный фрагмент молекулы модифицируют, заменяя бензольное кольцо на бензофураны, гетероароматические системы, содержащие атомы азота и серы, а также конденсированные гетероциклы. Уреидную группу заменяют на другие функциональные фрагменты, такие как тиоуреиды, энаминоны или сульфонилзамещённые амиды, что позволяет тонко настраивать взаимодействие молекулы с активным центром целевой изоформы фермента [18]. Полученные аналоги SLC-0111 демонстрируют повышенную ингибирующую активность в отношении CA IX [16, 18].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Экспрессия определенных изоформ карбоангидразы коррелирует с ключевыми звеньями патогенеза опухолевой прогрессии: CA IX преимущественно ассоциирована с биологической агрессивностью опухоли, CA XII — с выживаемостью опухолевых клеток и их адаптацией к неблагоприятным условиям микроокружения [1, 6]. Это обосновывает необходимость разработки высокоселективных ингибиторов CA IX и CA XII с учётом профиля экспрессии изоформ в конкретной опухоли.
Таргетинг CA IX и CA XII представляет собой не просто ингибирование ферментов, а многоуровневую стратегию репрограммирования опухолевой микросреды. Блокада этих изоформ позволяет нормализовать pH-баланс, уменьшить степень гипоксии и ацидоза, снизить иммуносупрессию, повысить чувствительность опухолевых клеток к стандартной терапии и иммунотерапии, а также подавить ключевые процессы инвазии и метастазирования [16, 17]. Таким образом, ингибиторы CA IX/XII открывают перспективы для персонализированной терапии гипоксических и резистентных опухолей, сочетаясь с химиотерапией, иммунотерапией и другими таргетными подходами.

About the authors

Daria Kutsebko

S.M. Kirov Military Medical Academy
National Medical Research Center of Oncology named after N.N. Petrov

Author for correspondence.
Email: heyiamdi@gmail.com
ORCID iD: 0009-0009-5838-6202
Russian Federation, Saint Petersburg, Russia

Ruslan I. Glushakov

Kirov Military Medical Academy; Saint Petersburg State Medical Pediatric University

Email: glushakoffruslan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0161-5977
SPIN-code: 6860-8990

MD, Dr. Sci. (Medicine), Assistant Professor

Russian Federation, Saint Petersburg; Saint Petersburg

References

Supplementary files