ANTITUMOR POTENTIAL OF USNIC ACID FROM THE LICHEN USNEA BARBATA

Full Text

Обоснование

Усниновая кислота – один из наиболее распространённых среди лишайников вторичных метаболитов. В природе существует в виде двух стереоизомеров (+) и (–). Известно о высокой биологической активности усниновой кислоты, в частности о цитотоксичности в отношении различных линий опухолевых клеток in vitro в диапазоне значений IC₅₀ от 30 мкМ для линии HCT116 до 45 мкМ для лини SW480, что обуславливает высокий интерес к данному соединению [1, 2]. Однако точных данных о возможных механизмах, лежащих за высокой цитотоксичностью усниновой кислоты до сих по не было получено. 

Цель

Цель работы — оценка цитотоксического действия (+)-усниновой кислоты на линиях PANC-1 (аденокарциномы поджелудочной железы человека) и SK-MEL-2 (иния клеток злокачественной меланомы кожи человека) in vitro, а также проведение молекулярного докинга и молекулярно-динамического моделирования её взаимодействия с белками Akt и PI3Kα в качестве потенциальных молекулярных мишеней.

Методы

Разделение метаболитов U. barbata проводили методом препаративной флеш-хроматографии на приборе Intepure-F100 (Hanbon, Китай). Идентификацию проводили методами ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Регистрацию спектров ¹H, ¹³C ЯМР проводили на спектрометре Bruker Avance (400 МГц, Германия). Выделенные вещества исследовали методом масс-спектрометрии с использованием тройного квадрупольного масс-селективного детектора LCMS-8030 Shimadzu (Япония) с электрораспылительной ионизацией (ESI) в отрицательном режиме. МС/МС спектры получали методом диссоциации, индуцированной соударением, предшественников ионов с энергией 30 эВ [3]. ИК-спектры регистрировались в диапазоне 3500–450 см^–1 на ИК Фурье-спектрометре FSM-2202 (Infraspec, Россия). Измерения угла вращения плоскости поляризации усниновой кислоты проводили на автоматическом поляриметре А1-ЕПЛ (Россия).

Клетки MCF‑7 (15 000 в 100 мкл) и A549 (10 000 в 100 мкл) помещали в 96‑луночный планшет и инкубировали 12 ч в среде DMEM (глюкоза 4,5 г/л) с гентамицином и 5% ЭТС. Затем добавляли среду с различными концентрациями усниновой кислоты, растворенной в ДМСО (конечная концентрация ДМСО не превышала 5%), и инкубировали 48 ч при 37 °C в атмосфере 5% CO₂. После этого вносили 0,1 мл среды и 0,02 мл МТТ‑реагента (5 мг/мл), инкубировали 1–3 ч. Супернатант удаляли, кристаллы формазана растворяли в 0,1 мл DMSO и измеряли оптическую плотность при 540 нм (фон при 690 нм). Процент жизнеспособных клеток рассчитывали относительно контроля (без препарата). Для каждой линии определяли IC₅₀.

Был проведён in silico анализ потенциальных молекулярных взаимодействий усниновой кислоты с белками AKT1 и PI3Kα. Ингибирование AKT1 рассматривается как стратегически важный подход для прерывания сигнального каскада, особенно при активации PI3K мутациями. Оценку связывания выполняли для двух сайтов AKT1: АТФ-конкурентного и аллостерического [4]. Все этапы моделирования, включая подготовку белков в модуле Protein Preparation Workflow [5], докинг по протоколу Induced-Fit Docking, молекулярную динамику и расчёты, проводили в пакете Schrödinger (версия 2021-1). Структуры белков минимизировали с использованием силового поля OPLS4, отсутствующие фрагменты достраивали в Prime, состояния протонирования генерировали в EPIK при pH 7.0 ± 2.0 [6]. Лиганд усниновой кислоты подготовили в LigPrep с оптимизацией геометрии, учётом ионизации, таутомерии и генерацией до 32 конформеров. Докинг выполняли с последующим уточнением комплекса в Prime, после чего проводили повторный докинг в Glide XP. Энергию связывания рассчитывали методом MM/GBSA по уравнению ΔG_bind = E_Complex − E_Ligand − E_Receptor с использованием модели VSGB [7, 8]. Лучшие позы отбирали по минимальным значениям ΔG_bind и XP GScore, визуализировали в Maestro и анализировали с помощью панелей Interaction Fingerprints и Ligand Interaction Diagram в пределах 4 Å вокруг лиганда.

Результаты

Данные идентификации усниновой кислоты, полученные с использованием методов ИК, ЯМР и масс-спектрометрии представлены ниже.

(+)-Усниновая кислота. R_t = 26 мин, Выход: 129 мг (1.3%), желтый порошок. [α] +420 (CHCI3, c 0.2). ¹H ЯМР (400 МГц, DMSO-d6) δ 12,04 (с, 1H, OH), 10,68 (с, 1H, OH), 7,37 (с, 1H, ArH), 5,66 (с, 1H, =CH–), 2,50 (с, 3H, CH₃–C=O), 2,37 (с, 3H, CH₃–Ar), 2,16 (с, 3H, CH₃–C=O), 1,51 (с, 3H, CH₃). ¹³C ЯМР (101 МГц, DMSO-d6) δ 203,5 (C=O), 200,1 (C=O), 197,7 (C=O), 191,6 (C=O), 179,1 (C=O), 162,8 (C-O), 157,3 (C-O), 155,4 (C-O), 106,7 (CAr), 106,0 (CAr), 103,8 (CAr), 101,3 (CAr), 98,4 (CH), 58,9 (CH₂), 32,8 (CH₃), 30,1 (CH₃), 8,8 (CH₃). Представленные спектральные данные однозначно свидетельствуют в пользу сложной полициклической структуры, а именно 2,6-диацетил-7,9-дигидрокси-8,9b-диметил-1,3(2H,9bH)-дибензофурандиона. Анализ протонного спектра ЯМР при 400 МГц в DMSO-d6 показывает присутствие двух сильно дезэкранированных гидроксильных протонов с синглетами при 12,04 и 10,68 м. д., что характерно для фенольных OH-групп, участвующих в образовании внутримолекулярных водородных связей с соседними карбонильными группами. Синглет ароматического протона при 7,37 м. д. подтверждает наличие только одного незамещенного положения в ароматическом кольце, тогда как олефиновый протон при 5,66 м.д. принадлежит винильной группе =CH–, входящей в состав лактонного или енонового фрагмента. Четыре метильные группы, наблюдаемые как синглеты при 2,50, 2,37, 2,16 и 1,51 м. д., соответствуют двум метильным группам при карбонильных центрах (CH₃–C=O), одному ароматическому метилу (CH₃–Ar) и одному третичному метилу (CH₃), связанному с четвертичным углеродом. Данные углеродного ЯМР при 101 МГц демонстрируют наличие шести карбонильных углеродов в области от 203,5 до 179,1 м.д., из которых сигналы при 203,5, 200,1 и 197,7 м.д. относятся к кетонным группам, а сигнал при 191,6 м. д. вместе с сигналом при 179,1 м. д. могут указывать на лактонные или хиноидные карбонилы. Три сигнала в области 162,8–155,4 м.д. характерны для фенольных C–O связей, а ароматические углероды проявляются в интервале 106,7–101,3 м. д. и при 98,4 м. д., причем сигнал при 98,4 м. д. соответствует метиновому олефиновому углероду =CH–. Следует отметить наличие метиленового углерода при 58,9 м. д., который относится к положению 2 в дигидрофурановом кольце, а метильные углероды при 32,8, 30,1 и 8,8 м.д. подтверждают присоединение двух ацетильных групп, ароматического метила и четвертичного метила при C9b. В совокупности эти данные формируют структуру дибензофурандионового каркаса, содержащего два ацетильных заместителя, две гидроксильные группы в положениях 7 и 9, метильные группы в положениях 8 и 9b, причем наличие четырех карбонильных групп (две из которых входят в состав ацетильных фрагментов) и двух лактонных карбонилов полностью согласуется с литературными данными. МС (ESI), m/z: 344,12 [M­–H]^– (расчетные значения: 344,09) (Рис. 1).

ИК-спектр усниновой кислоты содержит следующие характерные полосы (Рис. 2): 3110 (ν O–H), 2921 (νCH₃ асимметричный), 1701 (νC=O), 1619 (νC=C), 1554 (νC=C ароматическое), 1471 (δ CH₃), 1365 (δCH₃ симметричное), 1283 (νC–O), 1135 (ν C–O–C), 1071 (νC–O), 959 (δ =C–H), 858 (δ =C–H).

Обсуждение

 

В результате проведенного МТТ-теста установлено, что IC₅₀ усниновой кислоты для клеток линии PANC-1 составляет 7.5 мкМ (Рис. 3), а для клеток линии SK-MEL-2 — 46 мкМ. Клетки линии PANC-1 (аденокарцинома поджелудочной железы) проявляют значительно более высокую чувствительность к усниновой кислоте, чем клетки линии SK-MEL-2 (меланома).

 

 

Рисунок 3. Влияние различных концентраций усниновой кислоты на жизнеспособность клеточной линии PANC-1.

Согласно результатам молекулярного докинга, усниновая кислота занимает единственное положение в сайтах связывания каждого из двух белков — AKT и PI3Kα. На основании значений энергии связывания ΔG, рассчитанных методом MM-GBSA, усниновая кислота лучше всего взаимодействует с белком PI3Kα, тогда как с белком AKT связывание происходит менее эффективно. Для пары усниновая кислота –PI3Kα значение ΔG _binding составляет -61,27 ккал/моль, а для пары усниновая кислота–AKT — -43,19 ккал/моль. При этом XP GScore для усниновой кислоты в комплексе с AKT равен -8,64 ккал/моль, а с PI3Kα — -12,71 ккал/моль. Визуализация связей усниновой кислоты показала, что в сайте PI3Kα лиганд образует прочные водородные связи с остатками Lys802, Val851, Glu849 и Tyr836, а также π-π-стэкинг с Trp780 (Рис. 4). В случае белка AKT для усниновой кислоты наблюдаются водородные связи с Asn53, Leu213, Asp292 и π-π-стэкинг с Trp780. Анализ отпечатков взаимодействий выявил полный спектр аминокислотных остатков в непосредственной близости от усниновой кислоты: для AKT это Ser56, Val83, Phe252, Ile257, Val258, Ser259, Ala260, Asp325, Ala329, Asp331, Trp333; для PI3Kα — Met772, Ser774, Trp780, Ile800, Lys802, Asp810, Tyr836, Ile848, Glu849, Val850, Val851, Ser854, Met922, Phe930, Ile932. Таким образом, хотя усниновая кислота связывается с обоими белками, взаимодействие с PI3Kα является более выраженным благодаря сочетанию множественных водородных связей и отсутствию значительных стерических или энергетических препятствий (Рис. 5), что может указывать на то, что она потенциально способна выступать ингибитором PI3Kα тем самым подавляя активность сигнального каскада PI3K/AKT/mTOR

 

 

Заключение

В работе была выделена и охарактеризована усниновая кислота из лишайника U. Barbata. Полученные данные свидетельствуют о том, что усниновая кислота обладает селективным дозозависимым цитотоксическим действием, преимущественно в отношении клеток линии PANC-1 (IC₅₀ = 7.5 мкМ). Такой профиль чувствительности открывает перспективы дальнейшего изучения усниновой кислоты как потенциального противоопухолевого агента. Исследование молекулярного докинга показало, что (+)-Усниновая кислота, выделенная из лишайника U. barbata занимает единственное положение в сайтах связывания каждого из двух белков — AKT и PI3Kα. Однако взаимодействие с PI3Kα является более выраженным благодаря сочетанию множественных водородных связей и отсутствию значительных стерических или энергетических препятствий.

About the authors

Ilya Prokopiev

Ботанический институт им. В. Л. Комарова РАН, 197022, Россия, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, д. 2

Author for correspondence.
Email: ilya.a.prokopiev@gmail.com
Russian Federation

Olga Shemchuk

ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, РНЦРХТ им. Гранова

Email: olja.shemchuk17@gmail.com

Научный сотрудник

Vladimir V. Sharoyko

Институт экспериментальной медицины, 197022, Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12Д

Email: sharoyko@gmail.com
Russian Federation

Oleg E. Molchanov

Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies

Email: molchanovo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3882-1720
SPIN-code: 5557-6484

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files