Effect of uPA Gene Knockout on the Oxidative Status of Skin and Melanoma Cell Mitochondria in Female Mice



Cite item

Full Text

Open Access Open Access
Restricted Access Access granted
Restricted Access Subscription or Fee Access

Abstract

The axis of the urokinase-type plasminogen activator (uPA–uPAR) exhibits pleiotropic effects at various stages of cancer. The uPA/uPAR system is particularly significant in melanoma – one of the most aggressive forms of skin cancer with a high mutational burden and a tendency toward resistance to anticancer therapy. Mitochondrial metabolism is an important active process necessary for tumor growth.

Purpose. To conduct a comparative study of the levels of free-radical oxidation products in mitochondria of melanoma and skin cells in female C57BL/6 and C57BL/6-Plautm1.1Bug — ThisPlauGFDhu/GFDhu mice during the growth stages of experimental B16/F10 melanoma.

Material and methods. The study was performed on 8-week-old female mice of the C57BL/6 line (n=63) and the C57BL/6-Plautm1.1Bug — ThisPlauGFDhu/GFDhu line (uPA gene knockout) (n=63), with an initial body weight of 21–22 g. Animals from each line were randomly assigned to the following experimental groups: an intact group (n=21) and a group with standard subcutaneous transplantation of B16/F10 melanoma (n=42). The tumor model was B16/F10 melanoma. Decapitation was performed at 1 and 3 weeks of the experiment. Mitochondria were isolated by differential centrifugation. Mitochondrial levels of AOPP (µmol/g protein), MDA (µmol/g protein), and Fe(II) (µmol/g protein) were determined using ELISA. Statistical analysis was performed using Statistica 10.0.

Results. In melanoma cell mitochondria during tumor development in female mice of different genotypes, the following features were observed: at week 1 of melanoma growth, AOPP levels in tumor mitochondria of uPA-knockout animals were 11.3-fold higher than in tumor mitochondria of mice with the normal genotype (C57BL/6). The direction of the identified differences in AOPP levels in melanoma mitochondria of female mice at week 1 persisted by the tumor development time of 3 weeks. Specifically, AOPP levels in melanoma mitochondria of uPA-knockout females were 8.6-fold higher. At this time point, MDA levels were found to be 2.7-fold higher compared to the corresponding values in tumor mitochondria of animals with the normal genotype (C57BL/6).

Conclusion. uPA knockout leads to pathological remodeling of the redox status: in skin mitochondria, this manifests as a tendency toward lipoperoxidative stress, while in melanoma mitochondria, it manifests as oxidative stress to proteins.

Full Text

Влияние  нокаута гена uPA на окислительный статус митохондрий клеток кожи и меланомы у мышей-самок

 

И.В. Нескубина1, Е.М. Франциянц1, А.И. Шихлярова1, В.А. Бандовкина1, Л.К. Трепитаки1, Е.И. Сурикова1, Л.А. Немашкалова1, Г.Г. Белошапкина1, Н.Д. Ушакова1, И.М. Попова2, А.Е. Шумарин2, В.А. Енгибарян2, А.Д. Гусарев3, Д.А. Швырев1

1Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Россия, 344037, Ростовская обл., г. Ростов-на-Дону, ул. 14 линия, 63  2Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Российская Федерация, 344022 Ростовская обл., г. Ростов-на-Дону, переулок Нахичеванский, дом 29

3Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), Россия, 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, 8/2

Обоснование. Исследования последних десятилетий показали, что ось активатора плазминогена урокиназного типа (uPA–uPAR) обладает плейотропным эффектом на разных стадиях рака [1]. Активатор плазминогена (uPA) – внеклеточный протеолитический фермент известен своим участием в ремоделировании микроокружения опухоли и прогрессировании злокачественного процесса [2]. Нарушения уровней компонентов оси uPA–uPAR часто наблюдаются при ряде злокачественных новообразований, было определено, что данная ось является путем, способствующим росту опухолей и метастазированию, что дает возможность рассматривать ее в качестве мишени прогнозирования течения рака, диагностики и терапевтических вмешательств [1]. Известно, что uPA, разрушает клеточный матрикс и является одним из маркеров рака, поскольку чрезмерно экспрессируется при раке молочной железы, раке предстательной железы, раке шейки матки и меланоме. Особое значение система uPA/uPAR имеет при меланоме – одной из наиболее агрессивных форм рака кожи с высокой мутационной нагрузкой и склонностью к резистентности на противоопухолевое лечение [2].

Митохондриальный метаболизм является важным активным процессом, необходимым для роста опухоли [3]. Митохондрии не только обеспечивают энергетические потребности растущей опухоли, но и выступают важными регуляторами клеточного редокс-гомеостаза, апоптоза и сигнальных путей [4]. В исследованиях было показано, что метаболическое перепрограммирование в опухоли является динамическим процессом на протяжении всего процесса онкогенеза, а метаболическая гибкость служит потребностям опухоли на каждом этапе, от зарождения до метастазирования [5]. Понимание роли перепрограммированного метаболизма в динамике роста опухоли, и определение ключевых условий в модификации биологических процессов наиболее важны с точки зрения прогноза течения заболевания и определения терапевтических рисков [6]. Усовершенствованные модели на животных, воспроизводящие ключевые события в развитии рака у человека, помогают выявить наиболее важные метаболические уязвимости [5, 7-10]. Поскольку, известно участие uPA в прогрессии меланомы [2], то использование усовершенствованной экспериментальной модели, которую можно применять для изучения влияния uPA на прогрессию меланомы, является линия мышей C57BL/6-Plautm1.1Bug — ThisPlauGFDhu/GFDhu, обусловленная генетической детерминацией uPA. Ранее был установлен факт замедленного роста меланомы В16/F10 у мышей-самок с измененным генотипом (uPA-/-), который проявлялся в меньшем объеме первичного узла опухоли и количестве метастазов, большей продолжительности жизни животных по сравнению с соответствующими характеристиками у мышей с неизмененным генотипом [11, 12]. Данная модель замедленного опухолевого роста, является удобной для изучения патогенетических характеристик на субклеточном уровне и воспроизводит важные черты медленно прогрессирующих злокачественных новообразований у человека, таких как карциноидные опухоли из клеток APUD-системы, светлоклеточная папиллярная почечно-клеточная карцинома (СКППКК), рак предстательной железы, базалиома кожи, нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы [13]. Эти опухоли обладают метаболическими признаками, указывающими на окислительный стресс, подавленный антиокислительный метаболизм и истощение запасов митохондриальной ДНК и РНК.  Предполагают, что в опухолях с низкой скоростью роста имеет место хроническая митохондриальная дисфункция, приводящая к накоплению метаболитов в условиях дисфункциональных митохондрий [14]. Полагаем, что изучение митохондриального гомеостаза меланомы и органа-мишени кожи на модели нокаутных животных по гену урокиназы – uPA на разных этапах опухолевой прогрессии позволит определить патогенетические особенности развития замедленного злокачественного процесса с выявлением влияния нокаута uPA на интенсивность свободнорадикального окисления в митохондриях.

Цель. В сравнительном аспекте изучить интенсивность свободнорадикального окисления в митохондриях клеток меланомы и кожи у мышей-самок линии С57ВL/6 и C57BL/6-Plautm1.1Bug — ThisPlauGFDhu/GFDhu на этапах роста экспериментальной меланомы В16/F10.

Материалы и методы.

Исследование выполнено на мышах-самках линии С57ВL/6 (n=63) и линии C57BL/6-Plautm1.1Bug — ThisPlauGFDhu/GFDhu (нокаут по гену uPA) (n=63), 8-недельного возраста с начальной массой 21-22 г. Животные каждой линии были распределены методом случайной выборки на следующие экспериментальные группы: интактная группа (n=21) и группа со стандартной подкожной трансплантацией меланомы В16/F10 (n=42). Мыши линии С57ВL/6 были получены из ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА» (филиал «Андреевка», Московская область). Мыши линии C57BL/6-Plautm1.1Bug — ThisPlauGFDhu/GFDhu были получены из питомника лабораторных животных «Пущино» Филиала Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Пущино, Московская область). Характеристика животных: C57BL/6‑Plautm1.1BugThisPlauGFDhu/GFDhu (окраска шерсти: черные, метод модификации — нокаут uPA); животные выведены целевой мутацией с получением белка, неспособного связываться с рецептором активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR); животные-мутанты могут использоваться в исследованиях процессов воспаления, онкогенеза, механизмов фибринолиза, онкогенеза и роста сосудов в опухоли и ткани. Для всех линий мышей использовали штамм мышиной меланомы В16/F10, полученный из ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» МЗ России.

Комиссией по биоэтике ФГБУ «НМИЦ онкологии» Минздрава России были ободрены ряд протоколов: №1 от 20.03.2018 г.; № 2 от 31.05.2018 г.; №4 от 20.06.2018 г.; №14/74 от 18.11.2019 г.; №16/76 от 24.12.2019 г.; №2/201 от 17.01.2022 г.

Животные содержались при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Исследования на животных проводились с соблюдением принципов гуманности, которые изложены в Директиве Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинкской декларации, а также в соответствии с "Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных" и приказом Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 г. № 708Н "Об утверждении правил лабораторной практики". Все животные содержались в одинаковых условиях в стандартных пластиковых клетках по 5 особей при естественном освещении, температуре воздуха 22-26°С и свободным доступом к пище и воде. Животные ежедневно получали стандартный кормовой рацион и воду, проводили постоянное наблюдение с регулярным осмотром и взвешиванием.

Меланому В16/F10 животным трансплантировали путем стандартного подкожного введения опухолевой взвеси под правую лопатку в объеме по 0,5 мл взвеси клеток в разведении 1:10 в физиологическом растворе, содержащим 2,5-3,5х106 клеток (подсчет опухолевых клеток производился на клеточном анализаторе ADAMIILS (Nano Entek, Korea). Манипуляции с животными производили в боксе с соблюдением общепринятых правил асептики и антисептики.

Декапитация животных и последующая их диссекция проводились на льду. Животных декапитировали на гильотине, в группах с ростом меланомы B16/F10 в сроки: 1-я неделя роста меланомы и 3-я неделя роста меланомы. После декапитации у животных иссекали кожу и опухоль. Условно здоровую кожу иссекали на максимально удаленном расстоянии от опухолевого узла. Митохондрии из клеток тканей опухоли и кожи выделяли с применением дифференциального центрифугирования на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге Avanti J-E, BECMAN COULTER, USA по методу Егоровой М.В. и Афанасьева  С.А. 2011; Гуреев А.П., Кокина А.В., 2015 [15, 16]. Для разрушения межклетoчных связей, клетoчной стенки и плазматических мембран применяли механическую обработку тканей с измельчением нoжницами и гомoгенизацией в стекляннoм гoмoгенизаторе с тефлонoвым пестикoм (гомогенизатoр Пoттера-Эльвегейма). На каждый грамм ткани дoбавляли по 10 мл стерильнoй среды выделения (0,22 М маннитoл, 0,3 М сахарoза, 1мМ ЭДТА, 2 мМ TRIS-HCL, 10мМ HEPES, pH 7,4). Ткани гoмoгенизировали и центрифугирoвали первый раз 10 мин при скорости 1000 g, температура 0-2°С, втoрое и третье центрифугирoвание oсуществляли при 20000 g, 20 мин, температура 0-2°С. Между центрифугирoванием провoдили прoцедуру ресуспендирoвания oсадка митохoндрий в среде выделения. Митохондрии допoлнительно очищали от лизoсом, перoксисом, меланoсом и т.п., центрифугируя в 23% градиенте Перкoлла. Суспензию субклеточных структур наслаивали на градиент Перкoлла, центрифугировали 15 мин при 21000 g, после этого наблюдали разделение на 3 фазы, oставляли нижний слoй митохoндрий и ресуспендирoвали средoй выделения. Следующую «прoмывку» митoхондрий осуществляли путем центрифугирoвания в течение 10 мин при 15000 g, температура 0-2°С. Митохондриальные образцы (концентрация белка 4-6 г/л) до анализа хранили при -80ºС в среде выделения. В митохондриальных образцах с помощью тест-систем на ИФА-анализаторе (Infinite F50 Tecan, Austria) определяли концентрацию продуктов окисления белков – АОРР (мкмоль/г белка) (Immun Diagnostic, Germany); малонового диальдегида – МДА (мкмоль/г белка) (BlueGene Biotech, China); Fe(II) (мкмоль/г белка); биохимическим методом определяли концентрацию белка (мг/мл) - биуретовым методом, Fe(II) (мкмоль/г белка) (Ольвекс Диагностикум, Россия) на спектрофотометре (Hitachi U-2900 Japan).

Статистический анализ результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 10.0. Полученные данные подвергали анализу на соответствие распределения признаков нормальному закону распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка (для малых выборок). Сравнение количественных данных в группах (независимые выборки) проводили с использованием критерий  Стьюдента и Манна-Уитни. Для корректировки достигнутого уровня значимости на множественные сравнения применяли поправку Бонферрони. Данные таблиц представлены в виде M ± m, где M – среднее арифметическое значение, m – стандартная ошибка среднего, за уровень статистической значимости в случае трех сравниваемых групп принимали р<0,017, а для четырех групп р<0,0083. Полученные результаты статистически обрабатывали с соблюдением общих рекомендаций для медицинских исследований.

 

Результаты

Результаты эксперимента по изучению уровня АОРР, МДА и Fe(II) в митохондриях клеток условно здоровой коже на этапах (1 и 3 недели) роста меланомы В16/F10 у мышей-самок линии С57ВL/6 и линии C57BL/6-PlautmI.IBug-ThisPlau6FDhu/GFDhu и мышей-самок линии С57ВL/6 представлены в таблице 1.

Таблица 1. Динамика уровня АОРР, МДА и Fe(II) в митохондриях клеток кожи самок мышей при росте меланомы В16/F10

 

Table 1. Dynamics of AOPP, MDA, and Fe(II) levels in skin cell mitochondria of female mice during B16/F10 melanoma growth

 

 

Показатели

АОРР

мкмоль/г белка

МДА

мкмоль/мг белка

Fe(II)

мкмоль/г белка

Интактные

митохондрии кожи мышей-самок С57ВL/6

n=21

6,11±0,25

2,73±0,08

6,60±0,29

1 неделя роста В16/F10 у мышей-самок С57ВL/6

n=21

5,38±0,17

2,55±0,07

6,52±0,29

3 неделя роста В16/F10 у мышей-самок С57ВL/6

n=21

13,76±0,47

р1=0,0000

р5=0,0000

2,83±0,07

7,091±0,17

Интактные 

митохондрии кожи

мышей-самок с нокаутом по гену uPA

n=21

4,54±0,24

р2=0,0010

4,72±0,20

р2=0,0000

15,006±0,41

р2=0,0000

1 неделя роста В16/F10 у  мышей-самок

с нокаутом по гену uPA

n=21

14,08±0,53

р1=0,0001

р3=0,0001

4,36±0,16

р3=0,0000

11,359±0,36

р3=0,0000

3 неделя роста В16/F10

у  мышей-самок с нокаутом по гену uPA n=21

5,04±0,19

р4=0,0000

р5=0,0000

8,64±0,34

р1=0,0000

р4=0,0000

р5=0,0170

15,436±0,29

р4=0,0000

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ППримечание: статистически значимые различия 1 – по сравнению с интактными значениями; 2 – статистически значимо по сравнению с интактными значениями в митохондриях у мышей-самок линии С57ВL/6; 3 – статистически значимо по сравнению со значениями в митохондриях у мышей-самок линии С57ВL/6 на 1 неделе роста В16/F10; 4 – статистически значимо по сравнению со значениями в митохондриях у мышей-самок линии С57ВL/6 на 3 неделе роста В16/F10; 5 – по отношению к уровню на предыдущем сроке исследования. Уровень статистической значимости при сравнении трех групп – 0,017; при сравнении четырех групп – 0,0083.

Прежде чем приступить к анализу дисфункциональных митохондриальных признаков при росте опухоли у мышей-самок разных линий, считаем необходимым рассмотреть степень влияния нокаута по гену uPA на содержание АОРР, МДА и Fe(II) в интактных митохондриях кожи. Установлено, что в норме в митохондриях клеток кожи уровень АОРР у самок линии C57BL/6 был выше, чем в митохондриях у нокаутных самок по гену uPA в 1,4 раза (р<0,05). При этом уровень МДА и Fe(II) у нокаутных самок был выше в 1,7 раза (р<0,05) и 2,3 раза по сравнению со значениями в митохондриях кожи у животных с нормальным генотипом (C57BL/6).

На этапе 1 недели роста меланомы у мышей-самок линии C57BL/6 в митохондриях клеток кожи не зафиксировано статистически значимых изменений содержания АОРР, МДА и Fe(II) по сравнению со значениями в интактных митохондриях кожи. Через 3 недели роста меланомы определили значимые изменения лишь для АОРР, что проявилось в повышении показателя как по сравнению с интактными величинами в 2,2 раза, так и со значениями в митохондриях кожи на 1 недели роста меланомы в 2,5 раза.

У мышей-самок линии C57BL/6-PlautmI.IBug-ThisPlau6FDhu/GFDhu в митохондриях клеток кожи через 1 неделю развития опухоли было установлено статистически значимое повышение АОРР в 3,1 раза по сравнению с соответствующими величинами в интактных митохондриях кожи. Через 3 недели роста меланомы статистически значимые изменения были зафиксированы для МДА, их уровни увеличились в 1,8 раза (р<0,05) по сравнению с интактными величинами и в 2,0 раза и 1,7 раза (р<0,05) относительно значений в митохондриях кожи на 1 неделе роста опухоли. Уровень Fe(II) в митохондриях клеток кожи у нокаутных мышей-самок на всех этапах роста меланомы был в пределах интактных значений (таблица 1).

Далее сравнили редокс-баланс в митохондриях клеток кожи на этапах роста меланомы между используемыми линиями мышей. Установили, что, на начальном этапе роста меланомы (1 неделя) уровень АОРР, МДА и Fe(II) в митохондриях кожи у нокаутных по uPA самок был выше в 2,7 раза, 1,7 раза (р<0,05) и 1,7 раза (р<0,05) по сравнению со значениями в митохондриях кожи у животных C57BL/6. Через три недели опухолевого роста перераспределение окисленных эквивалентов и Fe(II) в митохондриях клеток кожи было следующее: Fe(II) было в высоких величинах – в 2,2 раза, содержание АОРР уменьшилось в 2,7 раза, а концентрация МДА увеличилась в 3,0 раза в митохондриях кожи нокаутных животных по сравнению с их содержанием на данном сроке исследования в митохондриях у мышей C57BL/6.

Следующим этапом данного анализа является оценка редокс-баланса митохондрий клеток меланомы на 1 и 3 неделях роста опухоли в зависимости от генотипа мышей-самок. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2. Динамика уровня АОРР, МДА и Fe(II) в митохондриях клеток опухоли самок мышей при росте меланомы В16/F10

Table 2. Dynamics of AOPP, MDA, and Fe(II) levels in tumor cell mitochondria of female mice during B16/F10 melanoma growth

 

Показатели

АОРР

мкмоль/г белка

МДА

мкмоль/мг белка

Fe(II)

мкмоль/г белка

Интактные

митохондрии кожи мышей-самок С57ВL/6

n=21

6,1±0,25

2,73±0,08

6,60±0,29

1 неделя роста В16/F10 у мышей-самок С57ВL/6

n=21

4,41±0,13

р1=0,0000

 

2,53±0,18

7,742±0,16

3 неделя роста В16/F10 у мышей-самок С57ВL/6

n=21

8,03±0,28

р1=0,0002

р4=0,0000

2,4±0,22

8,265±0,25

р1=0,0029

Интактные 

митохондрии кожи

мышей-самок с нокаутом по гену uPA

n=21

4,54±0,24

 

4,723±0,20

15,006±0,41

 

1 неделя роста В16/F10 у  мышей-самок

с нокаутом по гену uPA

n=21

49,84±2,61

р1=0,0000

р2=0,0000

2,63±0,22

р1=0,0001

31,327±1,74

р1=0,0000

р2=0,0000

3 неделя роста В16/F10

у  мышей-самок с нокаутом по гену uPA n=21

69,28±3,05

р1=0,0000

р3=0,0000

р4=0,0012

6,49±0,23

р1=0,0004

р3=0,0000

р4=0,0000

52,671±1,45

р3=0,0000

р4=0,0000

 

 

 

П

 

 

П

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Примечание: статистически значимые различия 1 – по сравнению с интактными значениями; 2 – статистически значимо по сравнению со значениями в митохондриях у мышей-самок линии С57ВL/6 на 1 неделе роста В16/F10; 3 –  статистически значимо по сравнению со значениями в митохондриях у мышей-самок линии С57ВL/6 на 3 неделе роста В16/F10; 4 – по отношению к уровню на предыдущем сроке исследования. Уровень статистической значимости при сравнении трех групп – 0,017; при сравнении четырех групп – 0,0083.

 

В митохондриях клеток меланомы у мышей-самок с нормальным генотипом (C57BL/6) через 1 неделю роста опухоли выявили статистически значимое снижение уровня АОРР в 1,4 раза (р<0,05) по сравнению со значениями в интактных митохондриях клеток кожи. Через 3 недели опухолевого роста у мышей-самок фиксировали накопление окисленных белковых эквивалентов – содержание АОРР превысило интактные величины в митохондриях кожи в 1,3 раза (р<0,05), а по сравнению со значениями в митохондриях опухоли на предыдущем сроке роста опухоли – в 1,8 раза (р<0,05). Уровень МДА в митохондриях клеток меланомы на всех этапах опухолевой прогрессии у мышей-самок с неизмененным генотипом по uPA находился в пределах интактных значений митохондрии клеток кожи.

У нокаутных мышей-самок по гену uPA через 1 неделю развития опухоли зафиксирован колоссальный рост уровня АОРР в митохондриях клеток меланомы, который превышал соответствующие значения в интактных митохондриях клеток кожи в 11,0 раз. При этом уровень Fe(II) увеличился в 2,1 раза. В то же время установили падение уровня МДА в 1,8 раза (р<0,05). Через 3 недели роста меланомы продолжалось прогрессивное увеличение окисленных белков, что выразилось в росте уровня АОРР в 15,4 раза по сравнению с величинами в интактных митохондриях кожи и статистически значимым превышением содержания АОРР в митохондриях опухоли на предыдущем этапе роста меланомы в 1,4 раза (р<0,05). Уровень МДА в митохондриях опухоли на данном сроке развития меланомы (3 недели) значимо увеличился относительно значений на предыдущем этапе роста опухоли в 2,5 раза и был выше величин в интактных митохондриях кожи в 1,4 раза (р<0,05). При этом уровень Fe(II) на данном сроке роста опухоли был в 3,5 раза выше значений в интактных митохондриях кожи и в 1,7 раза (р<0,05) выше величин в митохондриях опухоли на предыдущем сроке исследования (1 неделя).

При сравнении исследуемых показателей (АОРР и МДА) в митохондриях клеток меланомы на этапах ее развития у мышей-самок с разным генотипом установили следующие особенности: на 1 неделе роста меланомы уровень АОРР в митохондриях опухоли нокаутных по uPA животных оказался в 11,3 раза выше, чем в митохондриях опухоли у мышей с нормальным генотипом (C57BL/6). Направленность выявленных различий в уровне АОРР в митохондриях меланомы у мышей-самок на 1 неделе сохранилась и к сроку развития опухоли – 3 недели. Так, уровень АОРР в митохондриях меланомы нокаутных самок по uPA был выше в 8,6 раза. На данном сроке исследования установили более высокий уровень МДА – в 2,7 раза по сравнению с соответствующими значениями в митохондриях опухоли у животных с нормальным генотипом (C57BL/6). Содержание Fe(II) на всех изучаемых этапах роста опухоли в митохондриях клеток меланомы у нокаутных по uPA животных статистически значимо превышало значения на соответствующих этапах исследования в митохондриях меланомы у мышей-самок с нормальным генотипом. Так, через 1 неделю развития опухоли уровень Fe(II) был в 4,0 раза, а через 3 недели в 6,4 раза выше соответствующих величин в митохондриях меланомы у животных с нормальным генотипом.

Обсуждение

Одним из ключевых результатов данного исследования явилось установление различий в митохондриальном редокс-гомеостазе клеток интактной кожи у животными с нормальной экспрессией uPA по сравнению с животными с нокаутом по uPA. Если в митохондриях клеток кожи у мышей-самок линии C57BL/6 преобладала фракция окисленных белков – АОРР, то у мышей-самок, нокаутных по uPA доминировало окисление фосфолипидной составляющей – МДА. Известно, что физиологические уровни оксидантов также модулируют клеточные функции через гомеостатические редокс-чувствительные клеточные сигнальные каскады. Эндогенные оксиданты в физиологических концентрациях выступают в качестве важных регуляторных молекул, модулирующих клеточные функции через гомеостатические сигнальные каскады, чувствительные к изменению редокс-статуса [17, 18].

Интересно, что уровень Fe(II) был выше в интактных митохондриях клеток кожи у самок с нокаутом по uPA. Известно, что ионы Fe выполняют значительную роль в таких физиологических процессах, как функционирование электронно-транспортной цепи, распределение кислорода по всему организму гемоглобином, а также в качестве кофактора во многих ферментативных реакциях. Несмотря на свою важность, избыток железа может быть токсичен для клетки и нанести серьезный вред, окисляя липиды, расщепляя белки и повреждая ДНК и РНК [19].

Сравнение редокс-статуса митохондрий клеток не затронутой опухолью кожи у мышей-самок с разным генотипом на этапах роста меланомы позволило выявить роль дефицита uPA, который проявлялся в качественно ином дисфункциональном протекании оксидативного стресса. В раннем периоде развития меланомы у uPA-нокаутных мышей наблюдался диссоциированный оксидативный ответ, проявляющийся в значительном повышение уровня окисленных форм белков и стабильном состоянии перекисного окисления липидов – уровень МДА находился в пределах интактных значений. Через 3 недели роста меланомы фиксировали противоположный вектор оксидативного стресса и теперь уже произошло радикальное перераспределение мишеней свободнорадикального окисления – выраженный рост МДА и нормализация АОРР. По всей видимости, в митохондриях кожи, не затронутой опухолью на терминальном этапе роста меланомы истощалась антиоксидантная составляющая, направленная на защиту мембран, и по росту уровня МДА можно полагать, что мембраны дестабилизированы. Данное предположение согласуется с концепцией, о том, что хроническое нарушение редокс-сигналинга (вызванное в данном случае дефицитом uPA) делает ткань уязвимой к пролонгированному стрессу, индуцированному растущей опухолью [20].

Известно, что uPAR конкурирует с uPA за участие во многих не протеолитических биологических процессах, таких как миграция, адгезия, пролиферация клеток и ангиогенез [21]. В исследованиях с использованием интактных uPA-дефицитных мышей был установлен факт замещения функции uPA посредством  растворимого рецептора uPAR, содержание и активность которого возрастали [22]. В отсутствие основного лиганда, uPAR переключается на альтернативные партнеры (интегрины, хемокиновые рецепторы), активируя те же конечные сигнальные пути (PI3K/Akt, MAPK, FAK/Src), которые обычно запускаются uPA-зависимым образом [23, 24]. Возможно, делеция uPA может ослаблять этот защитный путь, что на поздних стадиях приводит к неспособности митохондрий клеток кожи нейтрализовать нарастающую окислительную нагрузку.

Сравнительный анализ показателей окислительного стресса в митохондриях опухолевых клеток у мышей с разным генотипом выявил выраженные различия, указывающие на разные формы редокс-гомеостаза в меланоме в присутствии и в отсутствие uPA. Глубина этих расхождений (кратность изменений в разы) подчеркивает ключевую роль системы uPA/uPAR в установлении окислительного фенотипа опухоли.

Наиболее значимым результатом настоящего исследования является формирование в митохондриях опухоли мышей с нокаутом по uPA, характеризующегося сочетанием активного окисления белков (увеличение АОРР) и умеренной супрессии перекисного окисления липидов (ПОЛ) – низкий МДА на 1 неделе и в пределах интактных величин в митохондриях опухоли на 3 неделе роста меланомы. Данный факт может быть связан или являться следствием глубокого метаболического перепрограммирования, индуцированного нокаутом uPA. В пользу этого свидетельствуют работы последних лет, в которых установлено, что система uPA/uPAR участвует в регуляции анаэробного гликолиза в клетках меланомы и контролирует ее инвазивный и гликолитический фенотип, а подавление компонентов этой системы приводит к сдвигу энергетического метаболизма опухолевых клеток от гликолиза («эффект Варбурга») к окислительному фосфорилированию (OXPHOS) [24]. В состоянии повышенного OXPHOS митохондрии считаются мощным источником супероксида и обладают этой особенностью митохондрии, находящиеся в гиперактивном состоянии [3]. Вероятно, этот факт влияет на значительный рост количества АОРР.

Другим возможным объяснением выявленного редокс-диссонанса может быть тот факт, что uPAR инициирует гликолитический фенотип в клетках меланомы, запуская фенотип «Варбурга», опосредованный комплексом α5β1-интегрин-uPAR-EGFR и, по всей видимости, эти метаболические изменения отражаются в нарушенном биогенезе митохондрий [25]. При этом было показано, что уровень uPAR в разных линиях клеток меланомы (метастазирующая форма и не метастазирующая) значительно повышен и сверх экспрессия uPAR в клетках меланомы контролирует инвазивный и гликолитический фенотип в зависимости от связи uPAR с рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), опосредованный альфа5-бета1-интегрином. В результате авторы продемонстрировали на двух линиях клеток меланомы идентичность ультраструктурной морфологии митохондрий, а при метастатической форме меланомы наблюдали большее количество митохондрий, что, возможно, отражает повышенный метаболизм митохондрий [25].

Отдельно хотелось бы остановиться на роли Fe(II) в митохондриальном гомеостазе меланомы. Полагаем, что избыток железа в митохондриях меланомы у мышей-самок с дефицитом uPA может способствовать неконтролируемому свободнорадикальному повреждению биологических субстратов. Не исключено, что рост уровня МДА и железа является митохондриальной составляющей ферроптотического каскада и клетки меланомы у нокаутных по uPA животных, по всей видимости, на 3 неделе роста опухоли подвергаются ферроптозному давлению/влиянию. В пользу настоящего предположения был установлен рядом авторов факт увеличенного пула железа в цитозоле раковых клеток, что делало их восприимчивых к ферроптозу. Авторы предложили использовать ферроптоз для уничножения субпопуляций опухолевых клеток, ответственных за рецидив рака, а для усиления противоопухолевого эффекта ферроптоз можно сочетать с химиотерапией, лучевой терапией, фотодинамической терапией и иммунотерапией [26].

Дефицит uPA у мышей-самок, по-видимому, индуцирует эндогенный митохондриальный стресс в опухолевых клетках, который выражается не в классическом липопероксидном повреждении, а в чрезмерном накоплении окисленных белков, что позволяет предположить «запуск» митохондриальной дисфункции, направленной на повреждение белков. Вероятно, данный факт – усиление окисления белковых эквивалентов митохондрий, можно рассматривать как один из аутогенных факторов, сдерживающих активный рост меланомы, переключающий ее фенотип из агрессивно прогрессирующих, в медленно растущие опухоли. Вместе с этим, возможно еще одной составляющей медленно развивающейся опухоли является ферроптоз, признаки которого обнаружены в митохондриях меланомы.

Заключение

В митохондриях клеток опухоли и кожи, как органа-мишени, обнаружены существенные дисфункциональные различия в редокс-статусе у животных дикого типа и при нокауте uPA у мышей-самок на этапах прогрессии опухоли. Полученные данные позволяют полагать, что uPA является ключевым детерминантом, определяющим редокс-фенотип митохондрий клеток, кожи, как органа-мишени, так и меланомы. Нокаут uPA приводит к патологическому ремоделированию редокс-статуса: в митохондриях кожи это проявляется склонностью к липопероксидному стрессу, а в митохондриях меланомы — к окислительному стрессу белков и чувствительностью к ферроптозу. Полученные результаты расширяют понимание роли системы uPA/uPAR в канцерогенезе и уточняют её вклад в митохондриальный редокс-гомеостаз. Выявленные особенности митохондриального редокс-гомеостаза открывают новые перспективы для изучения uPA как мишени воздействия, а также разработки терапевтических стратегий, направленных на факторы уязвимости опухолевого митохондриального метаболизма.

×

References

  1. Frantsiyants EM, Kaplieva IV, Surikova EI, Neskubina IV, Bandovkina VA, Trepitaki LK, Lesovaya NS, Cheryarina ND, Pogorelova YuA, Nemashkalova LA. Effect of urokinase gene-knockout on growth of melanoma in experiment. Siberian Scientific Medical Journal. 2019; 39 (4): 62–70. [In Russian]. doi: 10.15372/SSMJ20190408 EDN: PLXEYI
  2. Micalet A, Tappouni LJ, Peszko K, Karagianni D, Lam A, Counsell JR, Quezada SA, Moeendarbary E, Cheema U. Urokinase-type plasminogen activator (uPA) regulates invasion and matrix remodelling in colorectal cancer. Matrix Biol Plus. 2023;19-20:100137. doi: 10.1016/j.mbplus.2023.100137
  3. Vasan K, Werner M, Chandel NS. Mitochondrial metabolism as a target for cancer therapy. Cell Metab. 2020;32(3):341-352. doi: 10.1016/j.cmet.2020.06.019 EDN: RERRJY
  4. Frantsiyants EM, Neskubina IV, Surikova EI, Shikhlyarova AI, Kaplieva IV, Nemashkalova LA, Trepitaki LK. The state of apoptosis factor system in mitochondria of skin and tumor cells in standard and stimulated growth of B16/F10 melanoma in female C57BL/6 mice. Research and Practical Medicine Journal. 2021;8(1):8-19 [In Russian]. doi: 10.17709/2409-2231-2021-8-1-1
  5. Faubert B, Solmonson A, De Berardinis RJ. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 2020;368: 1–10. doi: 10.1126/science.aaw5473
  6. Dodokhova MA, Safronenko AV, Kotieva IM, Milaeva ER, Shpakovsky DB, Trepel VG, Alkhuseyn-Kulyaginova MS, Kotieva VM. Mitochondrial dysfunction as a mechanism of antitumor and antimetastatic action of hybrid organotin compounds. Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. 2021;24(11):28-33 [In Russian]. doi: 10.29296/25877313-2021-11-05
  7. Frantsiyants EM, Kaplieva IV, Bondovkina VA, Surikova EI, Neskubina IV, Trepitaki LK, Pogorelova YuA, Cheryarina ND, Sheiko EA, Kotieva IM, Shumarin KA. Modeling of multiple primary malignant tumors in experiment. South Russian Journal of Cancer. 2022; 3(2): 14-21. [In Russian]. doi: 10.37748/2686-9039-2022-3-2-2
  8. Frantsiyants EM, Neskubina IV, Cheryarina ND, Surikova EI, Nemashkalova LA. Influence of B16/F10 melanoma growth variant on the level of cytochrome C in mitochondria in various organs of female mice. The Scientific Notes of Pavlov University. 2020;27(4):46–52. [In Russian]. doi: 10.24884/1607-4181-2020-27-4-46-52
  9. Kit OI, Frantsiyants EM, Kaplieva IV, Trepitaki LK, Kotieva IM. Method of the melanoma B 16 malignant growth in mice modification with chronic pain. Patent RF №2650587; published 16.04.2018. [In Russian].
  10. Dodokhova MA, Akimenko MA, Voronova OV. et al. Comparative analysis of the use of B16 melanoma and epidermoid Lewis lung carcinoma models for preclinical studies of compounds with a putative antitumor effect. Ural Medical Journal. 2023;22(5):67–77. [In Russian]. doi: 10.52420/2071-5943-2023-22-5-67-76
  11. Frantsiyants EM, Kaplieva IV, Surikova EI, Neskubina IV, Bandovkina VA, Trepitaki LK, Lesovaya NS, Cheryarina ND, Pogorelova Yu., Nemashkalova LA. Effect of urokinase gene-knockout on growth of melanoma in experiment. Siberian Scientific Medical Journal. 2019; 39 (4): 62–70. [In Russian]. doi: 10.15372/SSMJ20190408 EDN: PLXEYI
  12. Bandovkina VA, Frantsiants EM, Kit OI. Neuroendocrine and Metabolic Aspects of Melanoma Pathogenesis (Experimental and Clinical Study). Monograph M.: Credo, 2023. 328 p. [In Russian]. ISBN: 978-5-91375-156-0 EDN: XSVYBQ
  13. Robertson RG, Geiger WJ, Davis NB. Carcinoid tumors. Am Fam Physician. 2006;74(3):429-34
  14. Xu J, Reznik E, Lee HJ, et al. Abnormal oxidative metabolism in a quiet genomic background underlies clear cell papillary renal cell carcinoma. Elife. 2019;1;8:e38986. doi: 10.7554/eLife.38986
  15. Egorova MV, Afanas'ev SA. Vydelenie mitohondrij iz kletok i tkanej zhivotnyh i cheloveka: Sovremennye metodicheskie priemy. Sibirskij medicinskij zhurnal. 2011;26(1-1):22-28. [In Russian]. EDN: NHHOZX
  16. Gureev AP, Kokina AV, Syromyatnikov MYu, Popov VN. Optimization of methods for the mitochondria isolation from different mice tissues. Proceedings of Voronezh State University. Series: Chemistry. Biology. Pharmacy. 2015;4:61–65. [In Russian]. EDN: VWNFBH
  17. Radi R. Oxygen radicals, nitric oxide, and peroxynitrite: Redox pathways in molecular medicine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018;5;115(23):5839-5848. doi: 10.1073/pnas.1804932115
  18. Nakamura H, Takada K. Reactive oxygen species in cancer: Current findings and future directions. Cancer Sci. 2021;112(10):3945-3952. doi: 10.1111/cas.15068
  19. Worthen CA, Enns CA. The role of hepatic transferrin receptor 2 in the regulation of iron homeostasis in the body. Front Pharmacol. 2014;6;5:34. doi: 10.3389/fphar.2014.00034
  20. Sies H, Jones DP. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(7):363-383. doi: 10.1038/s41580-020-0230-3
  21. Chen J S, Chang L–C, Wu C Z, Tseng T L, Lin J A, Lin Y F, Cheng C W. Significance of the urokinase-type plasminogen activator and its receptor in the progression of focal segmental glomerulosclerosis in clinical and mouse models. J Biomed Sci. 2016;23(1):24. doi: 10.1186/s12929–016–0242–7
  22. Frantsiyants EM, Surikova EI, Kaplieva IV, Neskubina IV, Kozlova LS, Bandovkina VA, Trepitaki LK, Pozdnyakova VV. System of plasminogen regulators in the skin of intact uPA gene-knockout C57BL/6-PlautmI.IBug-This Plau6FDhu/GFDhu mice and in a model of chronic neurogenic pain. Research and Practical Medicine Journal. 2019; 6(4): 24-33. doi: 10.17709/2409-2231-2019-6-4-2
  23. Alfano D, Franco P, Stoppelli MP. Modulation of Cellular Function by the Urokinase Receptor Signalling: A Mechanistic View. Front. Cell Dev. Biol. 2022;10:818616. doi: 10.3389/fcell.2022.818616
  24. Laurenzana A, Chillà A, Luciani C, Peppicelli S, Biagioni A, Bianchini F, Tenedini E, Torre E, Mocali A, Calorini L, Margheri F, Fibbi G, Del Rosso M. uPA/uPAR system activation drives a glycolytic phenotype in melanoma cells. Int J Cancer. 2017;15;141(6):1190-1200. doi: 10.1002/ijc.30817
  25. Biagioni A, Laurenzana A, Menicacci B, Peppicelli S, Andreucci E, Bianchini F, Guasti D, Paoli P, Serratì S, Mocali A, Calorini L, Del Rosso M, Fibbi G, Chillà A, Margheri F. uPAR-expressing melanoma exosomes promote angiogenesis by VE-Cadherin, EGFR and uPAR overexpression and rise of ERK1,2 signaling in endothelial cells. Cell Mol Life Sci. 2021;78(6):3057-3072. doi: 10.1007/s00018-020-03707-4
  26. Žalytė E. Ferroptosis, Metabolic Rewiring, and Endometrial Cancer. Int J Mol Sci. 2023;20;25(1):75. doi: 10.3390/ijms25010075

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) Eco-Vector

License URL: https://eco-vector.com/for_authors.php#07
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС 77 - 86496 от 11.12.2023 г. 
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ЭЛ № ФС 77 - 80673 от 23.03.2021 г.