BACKGROUND: Nasal cancer is one of the most challenging cancers for dosimetric planning in radiotherapy. The RPMI-2650 cell line is the most available for modeling in this squamous cell carcinoma. However, there are few published studies on the biological effects of irradiation in RPMI-2650-based models.
AIM: The work aimed to examine changes in tumor-associated gene expression when switching from a 2D to 3D human model of nasal septal squamous cell carcinoma and assess the response of tumor cells to a single neutron exposure.
METHODS: The phenotype of RPMI-2650 cells was assessed by immunocytochemical staining. 3D spheroids were formed using ultra-low attachment plates. An NG-14 neutron generator was used for neutron exposure of 2D and 3D models. The expression of tumor-associated genes was assessed using real-time reverse transcription polymerase chain reaction.
RESULTS: The RPMI-2650 cell line had a keratin 17+ vimentin+ phenotype, which is typical of cell lines isolated from primary tumor metastases. There was a 6.9-fold increase in keratin 17 and keratin 10 gene silencing, along with an increase in the relative expression of CDH1 by 4.9 times, CD44 by 4.4 times, VIM by 12.4 times, TP63 by 3.2 times, PIK3CA by 2.7 times, TGFB1 by 3.8 times, MMP2 by 13.1 times, and TIMP2 by 35 times. CDKN2A expression increased in both 2D and 3D models 24 hours after neutron exposure (4.7 and 6.7 times, respectively). Furthermore, KRT10 and TIMP1 expression increased (5 and 4.5 times, respectively; spheroids only), as did TIMP2, TP63, and CD44 expression (6.8, 6.5, and 9.3 times, respectively; monolayer culture only). Vimentin gene expression increased 22 times in the exposed 2D model and reduced 7 times in the cancer 3D model.
CONCLUSION: Switching from 2D to 3D RPMI-2650 models was associated with decreased expression of genes encoding tumor cell resistance to therapy, with a simultaneous increase in the expression of genes responsible for progression, metastasis, and drug resistance in squamous cell carcinoma of head and neck. A single neutron exposure in a monolayer culture increased the expression of genes associated with an unfavorable outcome. In the 3D model, neutron exposure induced a more complex response, including cell cycle regulation, fibrosis, and specific cytoskeleton remodeling.
Обоснование. Опухоли полости носа считаются одной из наиболее сложных локализаций с точки зрения дозиметрического планирования в лучевой терапии. Для моделирования этого типа плоскоклеточного рака наиболее доступна линия RPMI-2650, при этом опубликовано крайне мало работ по изучению биологических эффектов, вызванных облучением моделей на основе этих клеток.
Цель. Оценить изменение профиля экспрессии опухоль-ассоциированных генов при переходе от 2D- к 3D-модели плоскоклеточного рака носовой перегородки человека и сравнить ответ опухолевых клеток в составе моделей на однократное облучение нейтронами.
Методы. Фенотипическую характеристику клеток RPMI-2650 проводили с помощью иммуноцитохимического окрашивания. Формирование 3D-сфероидов проводили в культуральной посуде с ультранизкой адгезией. Для облучения 2D- и 3D-моделей использовали генератор нейтронов НГ-14. Оценку экспрессии опухоль-ассоциированных генов проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией.
Результаты. Клетки линии RPMI-2650 имели кератин 17+ виментин+ фенотип, характерный для линий, выделенных из метастаза первичной опухоли. Наблюдали подавление генов кератинов 17 и 10 в 6,9 раза, а также повышение уровня относительной экспрессии генов CDH1 в 4,9 раза, CD44 в 4,4 раза, VIM в 12,4 раза, TP63 в 3,2 раза, PIK3CA в 2,7 раза, TGFB1 в 3,8 раза, MMP2 в 13,1 раза и TIMP2 в 35 раз. Через 24 часа после облучения нейтронами были выявлены повышение CDKN2A в 2D- и 3D-моделях (в 4,7 и 6,7 раза соответственно), рост экспрессии KRT10 в 5 раз и TIMP1 в 4,5 раза только в сфероидах, а также рост TIMP2 в 6,8 раза, TP63 в 6,5 раза и CD44 в 9,3 раза только в монослойной культуре. Экспрессия гена виментина возрастала в 22 раза в облучённой 2D-модели и снижалась в 7 раз в опухолевой 3D-модели.
Заключение. Переход от 2D- к 3D-модели RPMI-2650 сопровождался снижением уровня генов, влияющих на устойчивость опухолевых клеток к терапии, и одновременным повышением экспрессии генов, обеспечивающих прогрессирование, метастазирование и лекарственную устойчивость плоскоклеточного рака головы и шеи. Однократное облучение нейтронами монослойной культуры приводило к росту экспрессии генов, ассоциированных с неблагоприятным исходом заболевания, в то время как в 3D-модели нейтроны вызывали более сложный ответ, включающий регулирование клеточного цикла, развитие фиброза и специфическую перестройку цитоскелета.