Clinical value of KI-67 index in tumor tissue in patients with stage I and II ovarian cancer

Full Text

Прогноз больных раком яичников (РЯ) зависит от ряда клинических, морфологических, иммунологических и молекулярно-биологических факторов. Ведущими клиническими факторами являются стадия заболевания и стратегия лечения больных. Наряду с этим прогноз заболевания сопряжен с особенностями биологических свойств опухоли [1-8]. Различными исследованиями доказано важное прогностическое значение гистологической формы и степени дифференцировки опухоли [2, 4, 5, 8]. Достижения генетики, иммунологии и молекулярной биологии последних десятилетий оказали огромное влияние на понимание процессов канцерогенеза и прогрессирования опухоли, а также биологических особенностей злокачественных опухолей. Известно, что злокачественные опухоли человека возникают вследствие генетических нарушений клетки, приводящих к неконтролируемому росту новообразования. При этом установлена роль двух важных систем, определяющих деление клетки: еистемы протоонкогенов и генов-супрессоров. Эти гены формируют сложный механизм контроля темпов деления клеток, роста и их дифференциации. Протоонкогены - это нормальные гены клетки, оказывающие стимулирующее влияние на процессы клеточного деления, посредством специфических белков, продуктов их экспрессии. Превращение протоонкогена в онкоген - ген, определяющий опухолевые свойства клеток, является одним из механизмов возникновения клеток злокачественной опухоли [9, 10]. Гены-супрессоры имеют противоположную про- тонкогенам функцию. Они ответственны за подавление деления клетки [9, 10]. Мутация генетического кода протоонкогена с изменением структуры специфического белка, продукта экспрессии гена, либо повышение уровня экспрессии протоонкогена сопровождается образованием онкогенов и активацией механизмов деления клетки. С другой стороны, активация механизмов деления клетки может произойти вследствие инактивации генов-супрессоров. Таким образом, выявленные нарушения в геноме клетки позволили расширить знания о канцерогенезе и в то же время определить их клиническое значение для диагностики и прогнозирования течения онкологических заболеваний, а также использовать их в качестве специфических молекулярных маркеров [9, 10]. Большое внимание уделяется изучению молекулярно-биологических маркеров, характеризующих апоптоз, пролиферацию клетки и ангиогенез, таких как p53, Bcl-2, Bax, Fasl, Ki-67, VEGF, Her2/neu [1, 2, 5, 11-14]. Изучение диагностической и прогностической значимости этих и ряда других субстратов клеток злокачественных опухолей широко изучается с помощью иммуногистохимического метода, основной принцип которого был предложен J. Marrack [15] в 1934 г. Авторами метода по праву считается группа исследователей под руководством A. Coons [16, 17], которая в 1942 г. впервые с помощью антител, меченных изоцианатом, выявила антигены пневмококков в инфицированных тканях. Одним из наиболее информативных молекулярных маркеров биологических свойств опухоли, в частности, ее пролиферативной активности, является антиген Ki-67 [9, 18-20]. Ген, кодирующий белок Ki-67, расположен на длинном плече 10-q хромосомы. Ki-67-ядерный антиген, относится к регуляторным белкам. Его появление совпадает с вступлением клетки в митоз, вырабатывается в пролиферативной фазе клеточного цикла (фазы G1, S, G2, M) и не определяется в клетках, находящихся в состоянии покоя (в фазе G0). Это позволяет использовать его в качестве универсального маркера пролиферации при оценке роста злокачественных опухолей. Уровень его экспрессии можно определить в срезах из парафиновых блоков с помощью моноклональных антител MIB-1 [11]. Установлена корреляция между количеством клеток, экспрессирующих Ki-67, и степенью злокачественности опухоли, а также митотическим индексом. Процентное соотношение числа положительных к антигену Ki-67 клеток опухоли в поле зрения исследуемой иммуногистохимическим методом, с теми клетками, в которых этот антиген не определяется, получило название индекса Ki-67 [19]. Ре- ференсное значение индекса Ki-67 рассматривается по-разному, в зависимости от приоритетов конкретно взятой лаборатории. Так, например, одни исследователи принимают за точку отсчета наличие 10% Ki-67-положительных клеток, другие - 20%, третьи - 30%. Есть сообщения о том, что у больных саркомами мягких тканей [21] референсным считается индекс Ki-67, равный 50% . Индекс Ki-67 позволяет оценить степень злокачественности опухоли и прогнозировать течение заболевания в совокупности с другими факторами. Показано, что высокий уровень индекса Ki-67 сопряжен с неблагоприятным прогнозом. В частности, при высоком уровне Ki-67 отмечается ухудшение показателей безрецидивной и общей выживаемости больных раком молочной железы, яичников, толстой кишки, мочевого пузыря, саркомах мягких тканей и др. [8, 12, 14, 22, 23]. Индекс Ki-67 является независимым показателем прогноза рецидивов злокачественных опухолей и выживаемости у больных раком предстательной железы. Установлена прямая коррелятивная зависимость между количеством опухолевых клеток, экспрессирующих Ki-67, и стадией этого заболевания [24-27]. Экспрессия Ki-67 при РЯ выявляется в 71 - 98% случаев [27]. Среднее значение индекса пролиферации составляет 41,7% . Индекс Ki-67 при разных гистологических формах РЯ неодинаков. Сообщается о высоком индексе Ki-67 в ткани серозной аденокарциномы (43%). В ткани эндометриоидной карциномы этот показатель составляет 12,2%. Самый низкий показатель отмечен в ткани муцинозной карциномы - 5,7% [27, 28]. При этом индекс Ki-67 в определенной степени коррелирует со степенью дифференцировки опухоли. Высокодифференцированные опухоли имеют более низкую пролиферативную активность [5]. Показана более высокая экспрессия Ki-67 при РЯ в сравнении с доброкачественными и пограничными опухолями яичников. Высокая экспрессия этого белка тесно коррелирует с низким показателем 5-летней выживаемости [29]. Имеются сообщения о худшей выживаемости больных при высоком индексе Ki-67 в ткани серозной цистаденокарциномы яичников [19, 30]. При этом, согласно данным, полученным в РОНЦ РАМН им. Н.Н. Блохина уровень этого показателя одинаков у больных как с III, так и с IV стадией (44,2 и 38,5 соответственно), [11]. При этом в настоящее время нет исчерпывающей точки зрения о диагностической и прогностической значимости этого маркера при начальных стадиях РЯ. Материал и методы Нами проведено клинико-экспериментальное исследование, посвященное изучению индекса Ki-67 в ткани опухоли 48 больных гистологически верифицированным РЯ I-II стадии, которые находились на лечении в отделении гинекологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН с 1999 по 2004 г. Исследования проводились совместно с лабораторией экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН. Экспрессию Ki-67 определяли иммуногистохи- мическим методом на срезах с парафиновых блоков опухолей, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Для оценки пролиферативной активности (ПА) опухоли подсчитывали количество Ki-67-положи- тельных опухолевых клеток, приходящиеся на 200300 опухолевых клеток. Индекс Ki-67 определяли по формуле: па = число Ki-67 положительных клеток ^ Ю0 = общее количество клеток ' 10°. Результаты иммуногистохимического исследования сопоставляли с клинико-морфологическими параметрами, характеризующими степень распространенности опухолевого процесса. Больные обследовались в соответствии с алгоритмом диагностических методов этой категории больных. Стадирование РЯ, лечение, а также оценка результатов лечения проводились в соответствии с принятыми стандартами FIGO. С целью оценки результатов лечения был создан кодификатор, включающий в себя 214 изучаемых параметров. Математический анализ всех данных и полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ Statistica для Windows и SPSS. При сравнении клинико-лабораторных показателей использовали t-критерий Стьюдента, медианный тест Крускала-Уоллиса, тест корреляции рангов Спирмена. Расчет выживаемости проводили методом Каплана-Мейера. Многофакторный анализ проводился с использованием модели пропорционального риска Кокса. Достоверность различий средних значений оценивали по t-критерию Стьюдента и с помощью непараметрического критерия подобранных пар Вилкок- сона, частот распределения - по критерию ci. Корреляционные зависимости оценивали методом простой линейной корреляции Пирсона (r) и с помощью непараметрических критериев: корреляции рангов Спирмена (R) и медианного теста Крускала-Уолли- са. Во всех случаях различия считали достоверными прир < 0,05. Результаты и обсуждение Из числа 48 обследованных больных у 31 установлена I, а у 17 - II стадия РЯ. По гистологической структуре из 48 изученных образцов в 26 наблюдениях опухоль имела строение серозной циста- денокарциномы (СЦАК), в 16 - эндометриоидной (ЭЦАК), в 6 - муцинозной цистаденокарциномы (МЦАК). Маркер Ki-67 выявлен во всех 48 образцах и его значения колебались от 1 до 90%. При этом уровень экспрессии Ki-67-положительных клеток при СЦАК был достоверно выше, чем при ЭЦАК и МЦАК (45% против 12,5% соответственно, р = 0,04). У больных СЦАК яичников показатель Ki-67 был минимальный при высокой степени дифференци- ровки опухоли (G1) и достоверно выше при умеренной (G2) и низкой (G3) степени дифференцировки опухоли (р = 0,049) (табл. 1). При эндометриоидной форме рака наблюдалась обратная тенденция: доля Ki-67 положительных клеток при высокой и умеренной степени дифференцировки опухоли составила в среднем 30-33%, при низкой степени дифференци- ровки - всего 5,5%. Сравнительно высокое содержание Ki-67 обнаружено в ткани опухолей тех больных, которые имели как минимум одни роды в анамнезе (38,2 ± 5,4% по сравнению с 28,6 ± 9,4% у нерожавших больных, р > 0,05). Таблица 1 Экспрессия Ki-67 в опухоли у больных РЯ I-II стадии в зависимости от степени дифференцировки опухоли Гистологическая форма опухоли Степень диф- ференцировки опухоли Число больных Число Ki-67+, % Медиана Ki-67, % Высокая 4 7,5 ± 2,5 7,5 СЦАК Умеренная 8 49,2 ± 8,8 50 Низкая 14 51,8 ± 8,9 55 Высокая 7 33,7 ± 11,0 40 ЭЦАК Умеренная 5 30,0 ± 9,6 30 Низкая 4 5,5 ± 2,6 5,5 Высокая 5 26,3 ± 21,3 5 МЦАК Умеренная 0 - - Низкая 1 30* - Примечание. * - одна больная (абсолютное значение). Таблица 2 Экспрессия Ki-67 в опухоли у больных РЯ I-II стадии в зависимости от наличия миомы матки Гистологическая форма опухоли Наличие миомы Число больных Количество Ki-67,% Медиана Ki-67,% СЦАК Нет 14 39,1 ± 8,4 40 Да 12 49,2 ± 8,4 55 ЭЦАК Нет 13 17,9 ± 5,7 10 Да 3 53,3 ± 6,7 60 МЦАК Нет 4 10,0 ± 5,0 5 Да 2 5 и 90** 47,5 Примечание. Различия достоверны (р = 0,01);* - двое больных (абсолютные значения). Независимо от гистологического строения новообразования, количество Ki-67-положительных клеток в опухоли оказалось выше у тех пациенток, у которых помимо РЯ имелась миома матки (49,7 ± 7,0%, медиана 60%, против 27,3 ± 5,1%, медиана 15%, р = 0,01). В среднем медианы различались в 4 раза, однако у больных эндометриоидной и муцинозной формой цистаденокарциномы медианы различались в 6 и 9,5 раза соответственно, а у больных СЦАК всего в 1,4 раза (табл. 2). В группе больных СЦАК яичников, при наличии отягощенного онкологического семейного анамнеза наблюдалась явная тенденция к превосходству степени экспрессии Ki-67 по сравнению с таковым у больных спорадической формой рака (60,0 ± 4,7% против 35,2 ± 8,0%). Отмечен сравнительно высокий уровень экспрессии Ki-67 у больных с асцитической формой РЯ. Так, у больных СЦАК без асцита медиана экспрессии белка Ki-67 равнялась 30%, а при наличии асцита - 50%, у больных ЭЦАК соответственно - 5 и 40%. Установлено, что у больных РЯ I-II стадий при наличии клеток опухоли в смывах из брюшной полости независимо от гистологической формы опухоли медиана экспрессии белка Ki-67 несколько выше, чем при отсутствии таковых (30 и 10% соответственно; р > 0,005). Зависимости содержания белка Ki-67 в опухоли от стадии заболевания нами не выявлено (табл. 3). В то же время, выявлена достоверная корреляция между уровнем экспрессии белка Ki-67 в ткани СЦАК и возрастом больных. Экспрессия белка Ki-67 в ткани опухоли была сравнительно низкая у больных молодого возраста и более выраженная у лиц в возрасте 62 года и старше (г = 0,44; р = 0,026). Подобной закономерности у больных эндометриоидной и муцинозной аденокарциномой не наблюдалась. Отмечена взаимосвязь между уровнем экспрессии белка Ki-67 и индексом массы тела у больных ЭЦАК яичников. Содержание белка Ki-67 в ткани опухоли было высоким у больных с низким индексом массы тела и, наоборот, низкое при высоком индексе массы тела (r = -0,8; р = 0,001). Как уже было отмечено выше, пациентки с ЭЦАК яичников имели наиболее высокие значения индекса массы тела, при этом содержание Ki-67-положительных клеток у них не превышало 20%. Подобной зависимости у больных серозной и муцинозной формами РЯ не отмечено. Таблица 3 Экспрессия Ki-67 в опухоли у больных РЯ в зависимости от стадии заболевания Гистологическая форма опухоли Стадия (FIGO) Число больных Количество Ki-67, % Медиана Ki-67, % СЦАК Ia+Ib 11 46,6 ± 9,0 45 к 5 53,2 ± 18,9 70 Па+IIb 2 70 и 70* 70 Пс 8 32,6 ± 8,3 35 ЭЦАК k+Ib 8 25,3 ± 10,3 10 к 4 35 ± 10,4 35 Па+IIb 3 14,0 ± 13,0 1 Пс 1 15* МЦАК k+Ib 5 27,0±16,5 5 Па+IIb 1 20* Примечание. Все различия недостоверны (р > 0,05); * - одна больная (абсолютное значение). У больных СЦАК выявлена слабая зависимость между числом Ki-67-экспрессирующих клеток в опухоли и максимальным размером опухоли, которая становилась более очевидной при 11с стадии РЯ (г = 0,7; р = 0,052). Проведенный нами анализ с целью определения возможной связи между уровнем опухолевого маркера СА-125 в крови и экспрессией белка Ki-67 в опухоли не выявил каких-либо закономерностей при серозной цистаденокарциноме (г = 0). У больных ЭЦАК высокому уровню экспрессии белка Ki-67 соответствовали меньшие значения СА-125. При этом зависимость была недостоверной (г = -0,38; р = 0,17). Эта корреляция становилась достоверной у пациенток с высокой степенью дифференцировки опухоли (г = -0,9; р = 0,005). При умеренной и низкой степени дифференцировки опухоли высокий уровень СА-125 сопровождается высокой экспрессией белка Ki-67 (г = 0,31; р = 0,5). Для оценки выживаемости больных в зависимости от экспрессии белка Ki-67, всех пациентов разделили на 2 группы по содержанию белка в опухоли. При этом в процессе работы разделение больных проводилось в зависимости от нескольких уровней референсного значения маркера (10, 20, 30, 40 и 50%). При сравнении выживаемости больных с уровнем индекса Ki-67 менее 10% и более 10% не обнаружено никаких закономерностей. В связи с этим мы стали сравнивать выживаемость больных в зависимости от референсного значения Ki-67 - 20, 30, 40 и 50%. Оказалось, что более отчетливая зависимость выживаемости в зависимости от индекса Ki-67 в ткани опухоли проявлялась только тогда, когда за референсное значение индекса Ki-67 принято 50% содержание опухолевых клеток. Из 48 обследованных у 14 больных индекс Ki-67 составил менее 50%, у 34 больных - более 50% (табл.4). Выявлена тенденция снижения отдаленных результатов лечения больных РЯ в группе больных с индексом Ki-67 более 50% (р = 0,1) (см. табл. 4). Так, при значениях белка Ki-67 в опухоли от 50% и более только треть пациенток пережили 10-летний срок, а медиана длительности жизни достигала 69 мес, тогда как при Ю-67 менее 50% общая 10-летняя выживаемость больных РЯ составила 85,7%. Оценка безрецидивной выживаемости больных РЯ I-II стадии по предложенному пороговому значению белка Ю-67 также не выявила значимых различий (р = 0,4). 5-летняя безрецидивная выживаемость при низких значениях показателя составила 65,1 ± 10,9%, медиана длительности жизни до прогрессирования не достигнута, а в группе больных с высокими значениями белка Ю-67 5-летняя безрецидив- ная выживаемость составила - 58,4 ± 16,3%, а медиана - 69 ± 26,6 мес. Заключение Таким образом, проведенные клинико-молекулярные исследования показали, что экспрессия Ki- 67 установлена во всех исследованных образцах опухоли у больных РЯ I и II стадии, и что индекс Ki-67 был достоверно выше у больных СЦАК яичников (45%) и одинаково низок в ткани эндометри- оидной (12,5%) и муцинозной аденокарциномы (12,5%), (р = 0,04). Более наглядные закономерности отмечены при изучении взаимосвязи индекса Ki-67 с клинико-морфологическими параметрами серозной аденокарциномы. В частности, обращает на себя внимание то, что индекс Ki-67 и, следовательно, пролиферативная активность опухоли сравнительно низкая у больных молодого возраста, высокая у лиц в возрасте 62 года и старше. Отмечена тенденция к повышению индекса Ki-67 по мере увеличения размеров самой опухоли СЦАК, и эта тенденция становилась явной у больных со IIc стадией заболевания. При этом индекс Ki-67 был примерно одинаков у больных I и II стадии РЯ, (2735%). В то же время, при наличии в смывах клеток рака независимо от гистологической формы опухоли медиана содержания белка Ki-67 в ткани опухоли оказалась несколько выше, чем при отсутствии таковых (30 и 10% соответственно). Значения экспрессии белка достоверно повышались у больных с наличием миомы матки. При умеренной и низкой степени дифференцировки опухоли высокий уровень СА-125 в сыворотке крови сопровождался повышенной экспрессией белка Ki-67. Взаимосвязь между пролиферативной активностью опухоли и выживаемостью больных РЯ I и II стадии имеет характер тенденции. При значениях белка Ю-67 в опухоли от 50% и более, только треть пациенток пережили 10-летний срок, тогда как при Ю-67 менее 50% 10-летний срок пережили большинство больных РЯ (85,7%). Таким образом, полученные данные указывают на то, что Ю-67 характерен для самой агрессивной формы РЯ - СЦАК яичников, и, что с высоким индексом Ю-67 в ткани опухоли сопряжен неблагоприятный прогноз заболевания даже при I и II стадии болезни, т. е. белок Ю-67 может быть рассмотрен в качестве неблагоприятного молекулярного фактора прогноза РЯ начальных стадий. Таблица 4 Отдаленные результаты лечения больных РЯ I-II стадии в зависимости от экспрессии Ki-67 в ткани опухоли Уровень Число, абс. Медиана, мес Общая выживаемость, годы экспрессии Ю-67 3 5 10 р > 50% 34 не дост. 95,2 ± 4,5 85,7±9,7 85,7 ± 9,7 > 0,05 > 50% 14 69,0 ± 15,8 88,9 ± 10,5 71,1 ± 17,0 35,6 ± 26,7

About the authors

Seda O. Nikogosyan

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

Email: vikakarapetyan@mail.ru
MD, PhD, Dsi 115478, Moscow, Russian Federation

A. Yu Baryshnikov

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

115478, Moscow, Russian Federation

E. V Stepanova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

115478, Moscow, Russian Federation

V. V Kuznetsov

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

115478, Moscow, Russian Federation

V. L Karapetyan

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

115478, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files