SENSITIVITY OF THE TRANSPLANTED HUMAN NEUROBLASTOMA TO ONCOLYTIC СOXSACKIE A7 VIRUS



Cite item

Full Text

Abstract

Oncolytic viral therapy is a promising approach to targeted therapy of malignant tumors. In this article we consider the therapeutic potential of a non-pathogenic Coxsackie A7 virus (CA7V) with neurotropic properties on a model of human neuroblastoma. Purpose to study in vitro/in vivo sensitivity of human neuroblastoma HNB (from cell line JMR-32) to Coxsackie virus A7 (CA7V). Objectives: еvaluation of cytolytic activity in vitro on NB cells verified by cytomorphology and assessment of dynamics of the growth of subcutaneous neuroblastoma xenografts in Balb/c nude male mice exposed to CA7V multiple i.v. injections. Material and methods. CA7V was produced in the cells of line-producer С-33А. Cell culture and the strain of transplanted NB (JMR-32) were obtained from the Collection of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center. Cytomorphologic verification of neuroblastoma and CA7V cytolytic activity were executed with the use of standard cultural methods, TCID50 and IC50 criteria. Experiments «in vivo» were performed on immunodeficient Balb/c nude male mice bred and reared in the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center. The experiments were made at day 6 when neuroblastoma subcutaneous xenografts developed to the Vmean = 79-82 mm3 by day 6. The treatment with CA7V at the i.v. single dose of 1×108 cells per mouse was performed 3 times with 72-hours intervals; evaluation of the efficacy was made according to standard criterion Т/С ≤ 42%; and control of the tumor growth rate (Vt/V0) in the dynamics. Statistical assessment was made with the software Excel for Windows 2007 with the use of T-test under p ≤ 0.05. Results. Cytolytic effect of CA7V on neuroblastoma cells was registered similar to basic parameters of the original line-producer С-33А: TCID50 = 0.99×10-4 pfu/cell, and IC50 = 1.11×10-4 pfu/cell; 48 and 72 hours after virus reproduction in NB cells the rate was 2.0 and 1.5-fold higher than in the line-producer cells. СA7V inhibiting effect on the growth of large subcutaneous neuroblstoma xenografts is registered after the first i.v. injection at the minimal level of T/C = 67% (criterion ≤ 42%) with the 1.5-fold decrease of the tumor growth rate and cancellation of early mice death by day 22 vs day 15 in the control group of untreated mice (n = 8). Conclusion. The obtained results allow to consider human neuroblastoma (JMR-32) to possess the low sensitivity to oncolytic effect of in vitro/in vivo. In order to obtain significant effect in vivo the treatment should be started in mice with 2-fold smaller tumors and a higher initial dose of the oncolytic agent.

Full Text

Нейробластома (НБ) - одна из наиболее распространенных солидных опухолей у детей. Лечение больных НБ группы высокого риска имеет ограниченную эффективность и неблагоприятный прогноз [1]. Это обусловливает необходимость разработки новых стратегий лечения НБ. В последние годы идет активная разработка различных подходов таргетной терапии опухолевых заболеваний. Один из таких подходов - онколитическая виротерапия (ОВТ), которая использует различные репликативно-компетентные вирусы, способные напрямую лизировать опухолевые клетки и в некоторых случаях активировать иммунную систему. В качестве перспективных кандидатов для ОВТ НБ изучают как ДНК-, так и РНК-содержащие вирусы [2-5]. Использование РНК-содержащих вирусов имеет несколько терапевтических преимуществ: отсутствие генотоксичности, так как эти вирусы реплицируются в цитоплазме; кроме этого, в ходе инфицирования клеток они сразу индуцируют стойкие цитолитические изменения, также они не несут онкогены, которые могут привести к онкогенезу и быть легко генетически изменены с помощью методов обратной генетики [6]. В качестве перспективных кандидатов для противоопухолевой терапии рассматривают мелкие РНК-содержащие одноцепочечные энтеровирусы (Enterovirus) с высоким онколитическим потенциалом, например вакцинные и рекомбинантные штаммы полиовирусов, Coxsackie А21 и В3, ECHO 1 и 7 [2, 7-11]. Вирус Коксаки А7 (Human coxsackievirus A7 strain Parker, GenBank AY421765, CVA7) (вид Enterovirus A, семейство Picornoviridae) in vivo проявляет миотропные и нейротропные свойства, а при инфицировании человека вызывает полиомиелитоподобные симптомы [12, 13]. В СССР в 1960- 1970-х годах выделен непатогенный штамм CVA7, на его основе получена одна из живых энтеровирусных вакцин (ЖЭВ-8), которая в дальнейшем была апробирована для профилактики респираторных и энтеровирусных заболеваний более чем у полумиллиона человек. Также для нее была исследована возможность лизиса злокачественных клеток у ряда онкологических больных с исчерпанными возможностями лечения [7, 14, 15]. Проведенные исследования позволяют считать CVA7 из ЖЭВ-8 одним из перспективных энтеровирусов для изучения на модели НБ человека в качестве нового безопасного авирулентного онколитического таргетного средства с естественной нейротропностью. Соответственно сформулированы цель и задачи исследования. Цель исследования - изучение чувствительности in vitro/in vivo НБ (из линии клеток JMR-32) к действию вируса Коксаки А7 (CVA7). Задачи исследования - определение цитолитической активности CVA7 на верифицированных цитоморфологически клетках НБ в тесте in vitro и оценка динамики роста подкожных (п/к) ксенографтов НБ у мышей-самцов Balb/c nude под действием CVA7 при многократном внутривенном введении (в/в). Материал и методы Тестируемый агент. Вирус CVA7 нарабатывали в клетках HPV-негативной карциномы шейки матки человека С-33А (ATCC, HTB-31). После микроскопической констатации 100% гибели клетки вместе с вируссодержащей средой лизировали трехкратным замораживанием-оттаиванием и осветляли центрифугированием, полученный супернатант использовали в тесте in vitro. Для экспериментов in vivo в течение 2 ч проводили концентрирование вирусного препарата на ультрацентрифуге при 45 000 об/мин (ротор угловой, TLA-100.3, BeckmanCoulter, USA), супернатант удаляли, осадок растворяли ресуспендированием в стерильном физиологическом растворе («ПанЭко», Россия). Вирусный титр определяли стандартным методом бляшек и выражали в БОЕ/мл (бляшкообразующие единицы). Полученный стоковый раствор вируса хранили при -20 °C. В день введения животным стоковые растворы размораживали и готовили аликвоты для внутривенного (в/в) введения (1•108 БОЕ/200 мкл физиологического раствора) с помощью индивидуальных стерильных пластиковых шприцов. Введение CVA7 после трансплантации опухоли выполняли трехкратно с интервалом 72 ч (6-е, 9-е и 12-е сутки) в разовой дозе 1•108 БОЕ/200 мкл физраствора, курсовая доза 3•108 БОЕ/мышь. Опухолевая модель. Линия клеток эстроген- и андроген-независимой перевиваемой НБ (JMR-32) и опухолевый штамм для п/к трансплантации получены из коллекции опухолевых штаммов РОНЦ им. Н.Н. Блохина [16]. Для культурального теста клетки НБ размораживали при 37 °C в водяной бане 3-5 мин, осаждали центрифугированием при 1000 об/мин 5-7 мин и переносили во флаконы площадью 25 см2 с ростовыми средами RPMI-1640 и DMEM, содержащими 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), а также в смесь этих сред в соотношении 1:1 с целью выбора оптимальных условий для наращивания клеточной массы. Клетки культивировали в инкубаторе при 37 °C в атмосфере 5% CO2. Заменяли среду на свежую на следующие сутки после размораживания и далее в процессе роста клеток через каждые 3 сут. Пересев культуры осуществляли при достижении клетками плотного монослоя один раз в 3 дня. Получение донорского опухолевого материала НБ выполняли на мышах-самцах Balb/c nude на мышь (n = 2) разведения РОНЦ им. Н.Н. Блохина при трехкратном пассировании: 0 пассаж 5•106 клеток, 1-й и 2-й пассажи - по 50 мг взвеси опухолевой ткани на мышь. Оценка результатов in vitro. Для анализа вирусной репликации монослой клеток в 24-луночных планшетах инфицировали вирусом в дозе 0,001 БОЕ/кл и инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Несвязавшийся вирус удаляли, клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером и содержали в ростовой среде с 2% ЭТС. Через 0; 24; 48 и 72 ч клетки в ростовой среде лизировали с помощью 3 циклов замораживания-оттаивания. Жидкость с лизированными клетками очищали низкоскоростным центрифугированием и использовали для определения стандартного показателя 50% тканевой цитотоксической дозы (ТЦД50/мл) на линии-продуценте С-33А методом Рида-Менча. Уровень вирусной репродукции в клетках определяли каждые 24 ч в течение 72 ч. Определение чувствительности клеток к CVA7 in vitro проводили в диапазоне концентраций от 1•107 до 1•101 БОЕ/мл с помощью Cell Titer 96 A Queous One Solution Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS-тест, Promega), как описано ранее [17]. Результаты представляли в процентах от неинфицированного контроля. Поскольку тестированный вирусный материал рассматривали в качестве потенциального противоопухолевого средства, чувствительность клеток к CVA7 определяли по концентрации, способной уменьшить пролиферацию клеток на 50% (50% ингибирующая концентрация, IC50), используемой для противоопухолевых агентов. Показатель рассчитывали методом регрессионного анализа (данные MTS-теста и графика «доза-ответ»). Оценка результатов in vivo. Лечение в группе ОВТ вирусом CVA7 проводили трехкратно, на 6-е, 9-е и 12-е сутки после трансплантации опухоли; в группе КРО мыши получали физраствор в те же сроки. Исходный объем опухоли составил V0 = 79 ± 46 мм3. Начало введения (48 ч после трансплантации опухоли) связано с завершением аваскулярной стадии ангиогенеза и обеспечением биодоступности агента к клеткам, в том числе при внутривенной терапии. В обеих группах измеряли опухолевые узлы трехкратно до проведения инъекции и на 3-и сутки после окончания трехкратного курса ОВТ. Для измерений использовали штангенциркуль (Mitutoyo, Япония), соединенный USB-портом со статистической программой Exel. С помощью нее рассчитывали индивидуальные и средние объемы (средняя арифметическая V0, Vt1-3), стандартное отклонение (standard deviation, s. d.) и Ttest. По полученным данным определяли стандартный показатель эффективности T/C% (treatment/control) как соотношение средних объемов опухолей в сравнении с группой контроля роста опухоли (КРО), критерий T/C ≤ 42% [18]. Кроме того, рассчитывали скорость роста опухолей в каждой группе как соотношение Vt1-3/V0 и Ttest в сравниваемых группах. Сформированная таким образом база данных была первичным документом эксперимента. В таблицах приведено стандартное отклонение, при построении графиков - разброс с учетом доверительного интервала средней арифметической величины. Результаты исследований in vitro/in vivo статистически обработали с оценкой достоверности различий при p ≤ 0,05. Завершение эксперимента на животных. После окончания опыта выживших на 23-е сутки опыта мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза. Трупы павших и умерщвленных мышей подвергали аутопсии и кремировали в специализированном подразделении с учетом международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изложенных в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей», ЕЭС, Страсбург (1985) [19, 20]. Результаты Цитологическая верификация нейробластомы человека HB (JMR-32). При цитоморфологическом исследовании показано, что клетки НБ человека (IMR-32) 9-го пассажа имеют большие размеры, округлую или неправильную форму. Контуры клеток неровные - от тела клетки распространяются многочисленные псевдоподии и мелкие выросты. Ядра округлые, овальные или бобовидной формы с вдавлениями. В некоторых клетках наблюдают нарушение целостности ядерных мембран. У отдельных клеток ядра фрагментированы. Содержимое ядер неоднородное. В них на фоне эухроматина выявляют плотные глыбки хроматина разной величины, неправильной формы и округлые образования, похожие на ядрышки. Глыбки хроматина иногда выходят за пределы ядра. Заметно разделение цитоплазмы на участки, прилегающие к ядру (эндоплазма), и периферические зоны (эктоплазма). Эндоплазма более базофильная, эктоплазма светлая, вуалевидная. Характер и эндо- и эктоплазмы неоднородный - вакуолизированный (рис. 1, см. 4-ю полосу вклейки). Тестирование in vitro. Результаты MTS-теста представлены на рис. 2. Видно, что для CVA7 ТЦД50 = 0,99•10-4 БОЕ/кл, а IC50 = 1,11•10-4 БОЕ/кл. Это свидетельствует о высокой и сравнимой чувствительности к вирусу клеток НБ и исходной линии-продуцента С-33А в тестах in vitro. Способность CVА7 реплицироваться в чувствительных клетках представлена на рис. 3. Как видно, CVA7 способен размножаться в клетках НБ (JMR-32), так же как и в клетках линии-продуцента, в течение 72 ч, причем уровень репродукции вируса в клетках НБ через 48-72 ч на 2 и 1,5 порядка соответственно выше, чем в клетках линии-продуцента. Таким образом, в экспериментах in vitro вирус CVA7 показал активность в отношении клеток НБ (JMR-32), превышающую уровень активности в клетках, используемых для его наработки. Тестирование in vivo. Показано, что п/к ксенографты НБ без лечения (группа КРО) растут чрезвычайно быстро: от 6 до 15 сут после трансплантации опухолевые узлы увеличились от V0 = 79 ± 46 до Vt3 = 1629 ± 1224 мм3, Vt3/V0 = 20,6. Это свидетельствует об агрессивном характере модели. На 9-15-е сутки после трансплантации скорость роста соответствовала кинетике штамма: Vt1-3 = 4,3-20,6 соответственно. Гибель мышей от опухоли зарегистрирована, начиная с 15-х сут опыта (табл. 1). В группе ОВТ, получавшей CVA7 п/к ксенографты НБ росли от 6-х до 22-х суток опыта с такой же скоростью и увеличились от V0 = 82 ± 39 до Vt5 = 6692 ± 2126 мм3, Vt5/V0 = 81,2. Оценка эффективности ингибирования роста опухоли в группе ОВТ в динамике показала, что слабый недостоверный эффект на уровне Т/С = 67% (Ttest = 0,28) наступал только после 1-й инъекции (рис. 4), а после 2-й и 3-й инъекций эффект практически отсутствовал, Т/С = 94-107 (Ttest = 0,83-0,98). Анализ скорости роста в группе ОВТ показал, что после первой инъекции на 9-е сутки скорость роста ксенографтов (Vt1/V0) была в 1,5 раза ниже, чем в контроле: 2,8 и 4,3 соответственно (рис. 5). Начало гибели мышей от опухоли зарегистрировано на 5 дней позже - 22-е сутки после трансплантации (табл. 2). Заключение Проведенные исследования показали, что вирус CVA7 проявляет определенный цитолитический эффект по отношению к клеткам НБ (JMR-32), ТЦД50 = 0,99•10-4 БОЕ/кл, IC50 = 1,11•10-4 БОЕ/кл. При этом уровень репродукции вируса в опухолевых клетках через 48 и 72 ч на 2 и 1,5 порядка выше, чем в клетках линии-продуцента. Ингибирующее действие CVA7 на рост развившихся п/к ксенографтов НБ реализуется после введения в/в первой дозы на минимальном уровне Т/С = 67% (критерий ≤ 42%) на фоне уменьшения скорости роста опухоли в 1,5 раза и отмены ранней гибели мышей - на 22-е и 15-е сутки в группе нелеченного контроля соответственно (n = 8). Полученные данные позволяют считать НБ (JMR-32) in vitro/in vivo слабочувствительной к онколитическому действию CVA7. Для получения значимого результата in vivo следует начинать лечение при двукратно меньших опухолях и увеличенной первой дозой онколитического препарата.
×

About the authors

Anastasiia O. Sosnovtceva

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: aososnovtceva@gmail.com
MD, PhD-student of the Department of Medical Nanobiotechnology of the Medical Biological Faculty of the N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow, 117997, Russian Federation Moscow, 117997, Russian Federation

S. Sh Karshieva

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 119034, Russian Federation

G. B Smirnova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 119034, Russian Federation

Yu. A Borisova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 119034, Russian Federation

O. V Lebedinskaya

V.P. Serbsky Federal Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology

Moscow, 115478, Russian Federation

I. Zh Shubina

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 119034, Russian Federation

H. M Treshalina

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 119034, Russian Federation

P. M Chumakov

Engelhardt Institute of Molecular Biology of Russian Academy of Sciences

Moscow, 119991, Russian Federation

V. P Chekhonin

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University; E.A. Wagner Perm State Medical Academy

Moscow, 117997, Russian Federation; Perm, 614990, Russian Federation

References

  1. Weinstein J.L., Katzenstein H.M., Cohn S.L. Advances in the diagnosis and treatment of neuroblastoma. Oncologist. 2003; 8(3): 278-92.
  2. Toyoda H., Yin J, Mueller S, Wimmer E., Cello J. Oncolytic treatment and cure of neuroblastoma by a novel attenuated poliovirus in a novel poliovirus-susceptible animal model. Cancer Res. 2007; 67(6): 2857-64.
  3. Parikh N.S., Currier M.A., Mahller Y.Y., Adams L.C., Di Pasquale B., Collins M.H. Oncolytic herpes simplex virus mutants are more efficacious than wild-type adenovirus Type 5 for the treatment of high-risk neuroblastomas in preclinical models. Pediatr. Blood Cancer. 2005; 44(5): 469-78.
  4. Pesonen S., Helin H., Nokisalmi P., Escutenaire S., Ribacka C., Sarkioja M., Cerullo V. Oncolytic adenovirus treatment of a patient with refractory neuroblastoma. Acta Oncol. 2010; 49(1): 120-2.
  5. Garcia-Castro J., Alemany R., Cascalló M., Martínez-Quintanilla J., Arriero Mdel M., Lassaletta A. Treatment of metastatic neuroblastoma with systemic oncolytic virotherapy delivered by autologous mesenchymal stem cells: an exploratory study. Cancer Gene Ther. 2010; 17(7): 476-83.
  6. Miyamoto S., Inoue H., Nakamura T., Yamada M., Sakamoto C., Urata Y., Okazaki T. Coxsackievirus B3 is an oncolytic virus with immunostimulatory properties that is active against lung adenocarcinoma. Cancer Res. 2012; 72(10): 2609-21.
  7. Чумаков П.М., Морозова В.В., Бабкин И.В., Байков И.К., Нетесов С.В., Тикунова Н.В. Онколитические энтеровирусы. Молекулярная биология. 2012; 46(5): 712-25.
  8. Skelding K.A., Barry R.D., Shafren D.R. Systemic targeting of metastatic human breast tumor xenografts by Coxsackievirus A21. Breast Cancer Res. Treat. 2009; 113(1): 21-30.
  9. Haley E.S., Au G.G., Carlton B.R., Barry R.D., Shafren D.R. Regional administration of oncolytic Echovirus 1 as a novel therapy for the peritoneal dissemination of gastric cancer. J. Mol. Med. 2009; 87(4): 385-99.
  10. Shafren D.R., Sylvester D., Johansson E.S., Campbell I.G., Barry R.D. Oncolysis of human ovarian cancers by echovirus type 1. Int. J. Cancer. 2005; 115(2): 320-8.
  11. Doniņa S., Strēle I., Proboka G., Auziņš J., Alberts P., Jonsson B. Adapted ECHO-7 virus Rigvir immunotherapy (oncolytic virotherapy) prolongs survival in melanoma patients after surgical excision of the tumour in a retrospective study. Melanoma Res. 2015; 25(5): 421.
  12. Seitsonen J.J., Shakeel S., Susi P., Pandurangan A.P., Sinkovits R.S., Hyvönen H. Structural analysis of coxsackievirus A7 reveals conformational changes associated with uncoating. J. Virol. 2012; 86(13): 7207-15.
  13. Mahy B.W. J. The Dictionary of Virology. Atlanta: Academic Press; 2009.
  14. Нетёсов С.В., Кочнева Г.В., Локтев В.Б., Святченко В.А., Сергеев А.Н., Терновой В.А. и др. Онколитические вирусы: достижения и проблемы. Эпидемиология и санитария. 2011;(3): 10-7.
  15. Сейбиль В.Б., Малышкина Л.П. Проблема ликвидации полиомиелита как инфекции требует иного решения. В кн.: Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН. Медицинская вирусология. М.; 2014; 28(1): 30-6.
  16. Трещалина, Е.М. Коллекция штаммов опухолей человека / Под ред. М.И. Давыдова. М.: Практическая медицина; 2009: 88-90.
  17. Сосновцева А.О., Липатова А.В., Гриненко Н.Ф., Баклаушев В.П., Чумаков П.М., Чехонин В.П. Чувствительность клеток глиомы С6, несущих полиовирусный рецептор человека к онколитическим полиовирусам. Бюл. экспер. биол. 2016; 161(6): 780-4.
  18. Трещалина Е.М. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. М.: Гриф и К.; 2012; Ч. 1.: 642-57.
  19. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей, ЕЭС, Страсбург. 1985. Ланималогия. 1993; (1): 29.
  20. Большаков О.П., Незнанов Н.Г., Бабаханян Р.В. Дидактические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. ВОЗ. 2000. Рекомендации комитетам по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований. Качественная клиническая практика. 2002; (9): 24-8.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2017 Eco-Vector


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС 77 - 86496 от 11.12.2023 г. 
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ЭЛ № ФС 77 - 80673 от 23.03.2021 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies