TOPOISOMERASES: FEATURES OF THE ACTION, CLASSIFICATION, CELL FUNCTIONS, INHIBITION, ANTHRAFURANDION

Full Text

Топоизомеразы: механизм действия и классификация ДНК-топоизомеразы - это ферменты, ответственные за регуляцию тoпологии ДНК. Они вносят в структуру ДНК разрывы, а после релаксации суперспирали повторно их лигируют [1, 2]. В тексте арабские цифры использованы для обозначения фермента, римские - для обозначения его типа. Существует два типа топоизомераз ДНК: тип I и тип II. Недавний обзор J. Delgado посвящён детальному анализу каталитического механизма и функций топоизомераз [3]. Топоизомеразы I типа разрывают одну из цепочек дуплексной ДНК, тем самым давая возможность либо прохождению другой цепи ДНК через разрыв, либо вращению нижестоящего дуплекса ДНК вокруг разрыва с последующим «зашиванием». В результате они изменяют степень спирализации на 1 шаг [1-4]. Известны три подтипа топоизомераз I типа: IA, IB и IC. Для топоизомераз подтипа IA требуется «ник» (одноцепочечный разрыв) для связывания с ДНК. Они расщепляют одну из нитей дуплексной ДНК, ковалентно присоединяются тирозином активного центра к 5’-фосфорильной группе и используют механизм «нитевого прохода» для изменения топологии ДНК. Топоизомеразы типа IB и IC расщеп-ляют одну нить дуплексной ДНК, ковалентно присоединяются тирозином активного центра к 3’-фосфорильной группе и используют «вращающийся» механизм для релаксации суперспиралей ДНК. Бактериальные топоизомераза 1 (Тор1) и топоизомераза 3 (Тор3) относятся к топоизомеразам типа IA. Когда топоизомеразы II типа расщепляют две цепи ДНК, они образуют фосфотирозильные связи между двумя тирозинами активного сайта и парой 5’-фосфатов для обеспечения целостности ДНК. Существует два подтипа топоизомераз II типа: IIA и IIB. Топоизомераза 6 относится к подтипу IIB, тогда как остальные известные топоизомеразы II типа относятся к подтипу IIA. Каждый подтип топоизомеразы структурно и функционально консервативен и образует одно семейство белков [1]. После открытия ДНК-гиразы она была идентифицирована как клеточная мишень кумариновых и хинолоновых антибактериальных препаратов. С этого момента топоизомеразы ДНК, особенно топоизомеразы типа IIA, признаны в качестве терапевтических мишеней многих противоопухолевых и антибактериальных препаратов [5, 6]. Для нескольких антибактериальных препаратов, включая фторхинолоны, мишенью являются топоизомеразы бактерий типа IIA, ДНК-гираза и топоизомераза 4 (Тор4). Как Top1 (hTop1), так и две изоформы топоизомеразы 2 (hTop2) человека являются клеточными мишенями клинически значимых противоопухолевых препаратов. Большое количество малых молекул идентифицировано как ингибиторы hTop1 или hTop2. Многие из них были протестированы в клинических испытаниях, но лишь некоторые из них показали клинический успех. Манипулирование ферментативной активностью для достижения терапевтического эффекта осуществляется тремя путями: 1) подавлением активности фермента каталитическими ингибиторами; 2) повышением активности фермента в отношении разрыва ДНК; 3) превращением фермента в агент, токсичный для клеток. Многие клинически успешные ингибиторы hTop1 и hTop2, а также ингибиторы топоизомеразы бактериального типа IIA используют 3-й механизм, который часто называют топоизомеразным отравлением [6]. Эти «топоизомеразные яды» превращают топоизомеразу в клеточный яд путём связывания с образующимся в процессе катализа промежуточным соединением топоизомераза-ДНК (топоизомераза присоединяется к ДНК ковалентно) с образованием тройного комплекса топоизомераза/лекарственное вещество/ДНК. «Отравление» топоизомеразы часто вызвано ингибированием реакции повторного лигирования фермент успевает разорвать ДНК, но не может её повторно связать, что подтверждается структурными исследованиями тройных комплексов топоизомераза/лекарственное вещество/ДНК [3]. Однако некоторые топоизомеразные яды, включая спонтанно повреждающие ДНК фторхинолоны, стимулируют реакцию разрыва цепи. Таким образом, 2-й механизм, по-видимому, используется некоторыми ингибиторами топоизомеразы для превращения своей мишени в токсин (отравление). Формирование тройного комплекса вызывает цитотоксические события, которые включают торможение репликации ДНК, генерацию двунитевых разрывов (double-strand breaks, DSB) и последующую гибель клеток [6]. Каталитические ингибиторы, инактивировавшие hTop1 либо hTop2 по механизму 1, не имели большого успеха в клинических исследованиях. Одно из возможных объяснений заключается в том, что повышенные уровни топоизомераз в опухолевых клетках снижают эффективность ингибиторов ферментов. Вместе с тем высокие уровни топоизомераз повышают эффективность топоизомеразных ядов. Недавно были обнаружены новые хинолоны, которые ингибируют одновременно как hTop1, так и hTop2, не «отравляя» их [7]. Эти соединения продемонстрировали многообещающую противоопухолевую активность in vitro и in vivo. Таким образом, каталитические ингибиторы, способные ингибировать множественные топоизомеразы человека, могут иметь перспективу мощных противоопухолевых лекарственных средств. Разработка модуляторов активности ферментов выигрывает от детального понимания каталитических механизмов целевых ферментов. Структурная биология топоизомераз оказалась особенно полезной для выяснения не только каталитических механизмов ферментов, но и проверки действия клинически важных лекарств, для которых эти эссенциальные ферменты являются специфическими мишенями [8, 9]. В дополнение к α- и β-формам hTop2, топоизомеразам типа IIA и двум топоизомеразам типа IB, обнаруженным в ядре (hTop1) и митохондриях (mTop1), клетки человека также имеют две изоформы Top3 (hTop3α и hTop3β), топоизомеразы типа IA [1]. Однако о существовании ингибиторов Top3 пока сведений нет. Клеточные функции топоизомераз Топоизомеразы типа IB Шарнирная функция эукариотической Тор1 имеет большое значение для удаления сверхспирального напряжения ДНК (репликация и транскрипция) [9]. Интересно, что присутствие Top1 (но не её каталитическая активность) необходимо для активации транскрипции; однако в случае Top2β для транскрипции необходима её топоизомеразная активность. В клетках человека активность hTop1 и РНК-полимеразы II взаимосвязаны [10]. Исследования влияния камп-тотецина, яда Top1, показали, что для эффективной экспрессии длинных генов необходимы как Top1, так и Top2β. mTop1 - единственная топоизомераза, встречающаяся исключительно в митохондриях [11, 12]. Однако в митохондриях обнаружена также длинная изоформа Тор3α, синтезируемая в результате альтернативной трансляции с вышерасположенным сайтом инициации, а также Top2α и Top2β. mTop1 играет важную роль в транскрипции и репликации кольцевой митохондриальной ДНК [13]. Хотя клеткам удаётся выживать в отсутствие mTop1, потеря её сильно влияет на целостность митохондрий и энергетический обмен [14, 15]; однако присутствие Top3α в митохондриях, вероятно, способствует этому выживанию. Топоизомеразы типа IIA ДНК-гираза является единственной топоизомеразой, способной вводить отрицательные суперспирали [16], в то время как Тор4 ответственна в первую очередь за декартирование (отсоединение) дочерних хромосом. Бактериальная хромосома поддерживается в виде определённой отрицательной суперспирали за счёт баланса между релаксационной активностью Top1 и сверхспирализующей активностью ДНК-гиразы. Низшие эукариоты имеют только топоизомеразу типа IIA - Тор2, структура и функция которой аналогичны таковым Top4 (Top4 и Top2 отличаются по своим C-терминальным доменам). Одно явное различие между топоизомеразами бактериальных и эукариотических типов IIA заключается в том, что бактериальные ферменты являются гетеротетрамерами A2B2, тогда как эукариотические ферменты являются гомодимерами. Показано, что топоизомеразы бактериального типа IIA сохраняют активность, когда две субъединицы соединены в один пептид. Доказано, что гетеротетрамерная топоизомераза типа II может быть превращена в гомоизомерную топоизомеразу типа II путём слияния генов. В отличие от низших эукариот, млекопитающие имеют две изоформы Top2: Top2α и Top2β. Эти изоформы имеют примерно 70% сходства аминокислотной последовательности и проявляют сходную каталитическую активность, но выполняют различные клеточные функции. Top2α требуется для репликации ДНК и сегрегации хромосом, и её экспрессия значительно повышается, в том числе в опухолевых клетках. Считается, что hTop2α служит биомаркёром для некоторых опухолей, а Top2β играет критическую роль в транскрипции всех видов клеток, в том числе нейронных. Структурные исследования топоизомераз Топоизомеразы типа IB По сравнению с релаксированной ДНК, которая находится в энергетически низшей конформации, положительно или отрицательно свёрнутые молекулы ДНК находятся в более высоких энергетических состояниях из-за существования торсионных деформаций в этих структурах. В простом трёхэтапном процессе, который не требует дополнительной энергии, топоизомеразы типа IB эффективно накапливают свободную энергию, хранящуюся в виде суперспиралей ДНК, необходимую для того, чтобы вернуть эти энергетически напряжённые молекулы ДНК в их расслабленные формы. Доказано, что эта реакция релаксации начинается с каталитической тирозин-опосредованной нуклеофильной атаки на химически неустойчивую фосфодиэфирную связь в дуплексе ДНК, что приводит к образованию переходного одноцепочечного разрыва, состоящего из 3’-связанной фосфотирозильной связи и свободного 5’-OH конца. Напряжение, возникающее в результате сверхспирализации ДНК, может рассеиваться посредством вращения молекулы ДНК вокруг разрыва (рис. 1, см. 2-ю полосу вклейки). Существует много доказанных и предположительных объяснений действия топоизомераз. Например, расщеплённая фосфодиэфирная связь восстанавливается, и тирозин каталитического центра регенерирует, возвращая фермент в исходное состояние для следующей реакции релаксации. Структурный анализ hTop1 в ковалентных и нековалентных комплексах с ДНК позволяет предположить, что постулированное вращение ДНК во время каталитического цикла, вероятно, достигается с помощью «механизма управляемого вращения». Каталитическое ядро топоизомераз типа IB состоит из домена Cap и каталитического (CAT) домена, который был впервые обнаружен в тирозиновых рекомбиназах, и эти два домена зажимают ДНК-дуплекс выше сайта расщепления. ДНК, находящаяся выше одноцепочечного разрыва (перед ним), крепко связана посредством ДНК-белковых взаимодействий в нескольких сайтах между ядром Top1 и ДНК - прежде всего, фосфатным скелетом ДНК, и, следовательно, не может вращаться. Напротив, ДНК, расположенная ниже сайта разрыва (нисходящая), слабо удерживается головной частью Cap-домена и линкерных областей домена CAT. По-видимому, это слабое поверхностное соприкосновение белок-ДНК может быть легко разрушено сохраняющимся суперспиральным натяжением, и нижерасположенная ДНК может затем вращаться вокруг места расщепления одним или несколькими витками, пока все торсионные напряжения не будут ослаблены или разрыв не будет повторно закрыт. Учитывая ограниченное количество ДНК-взаимодействующих аминокислотных остатков, можно подумать, что фермент не способен захватывать нисходящую ДНК в присутствии высокого сверхспирального напряжения. Тем не менее этот интерфейс может быть восстановлен при более низкой суперспиральной плотности, которая останавливает вращающуюся ДНК и помещает 5’-ОН в благоприятное положение для участия в реакции повторного лигирования. Вращение и ориентация нисходящей ДНК контролируются ферментом, в отличие от случайного вращения, что усложняло бы повторное лигирование. Топоизомеразы типов IA, IB и IIA имеют различную потребность в ионах Mg2+ для реализации их каталитической активности. Топоизомеразы типа IB не нуждаются в двухвалентном катионе для проявления своей активности, и объяснить это помог структурный анализ ковалентного комплекса фермент-ДНК. Известно, что реакция переэтерификации, катализируемая топоизомеразами, протекает через высокоэнергетическое бипирамидное переходное состояние, в котором два оксианиона присоединены к пятивалентному фосфору. Топоизомеразы типа IA и IIA используют Mg2+ в качестве важного кофактора для электростатической стабилизации переходного состояния, тогда как топоизомеразы типа IB и члены семейства тирозин-рекомбиназы используют для этой цели положительно заряженные остатки Arg и Lys. Типоизомеразы типа IIA Ещё до того, как появилась первая кристаллографическая визуализация топоизомераз типа IIA, в серии изящных биохимических исследований было установлено, что топоизомеразы типа II изменяют степень спирализации ДНК через механизм «двойных ворот». Каталитический цикл топоизомераз типа IIA начинается со связывания фермента с G-сегментом ДНК - процесс, соответствующий сборке так называемых «ворот» ДНК [3]. Известна динамика таких процессов. Формирование, например, бинарного комплекса топоизомераза-ДНК позволяет обеим цепям G-сегмента расщепляться в Mg2+-зависимой реакции переэтерификации, происходящей между остатками тирозина и фосфодиэфирными связями ДНК-цепи, что создаёт обратимый двухцепочечный разрыв (DSB) в G-сегменте. Подходящий Т-сегмент приближается к «воротам» ДНК, проходя через вход, расположенный на одном конце топоизомеразы типа IIA (N-терминальный конец эукариотической Тор2), и двигаясь вдоль «пути для ДНК» для достижения своей поверхности связывания. Пройдя через «входные ворота» ДНК, Т-сегмент направляется к «выходным воротам» на другом конце топоизомеразы (C-концевой конец для эукариотической Тор2) и в конечном счёте выходит сквозь них [1]. Этот режим однонаправленного переноса ДНК называется «двухзатворным», или механизмом «двойных ворот», поскольку вход и выход Т-сегмента опосредуется через два отдельных белковых затвора топоизомеразы типа IIA. Данный процесс является АТФ-зависимым, что обеспечивается наличием АТФазного домена в структуре топоизомераз типа II [17]. Механизмы блокирования топоизомеразы типа IB hTop1 представляет собой клеточную мишень хинолинового алкалоида камптотецина и его клинически активных производных - топотекана и иринотекана. Подобно Top2-ядам, они захватывают ковалентный комплекс Top1-ДНК и превращают фермент в цитотоксический ковалентно связанный аддукт белка и ДНК, что вызывает ингибирование репликации ДНК и генерацию двунитевых разрывов (DSB). Кристаллические структуры камптотецин- и топотекан-связанных ковалентных комплексов фермент-ДНК выявили интеркаляцию молекулы лекарственного вещества между расщеплёнными концами ДНК. В частности, A-D-кольца их пентациклической структуры укладываются против пары оснований, на конце сайта разрыва цепи, и азот хинолина B-кольца и полярные/заряженные группы E-кольца образуют водородные связи или солевые мостики с соседними аминокислотными остатками. Реакция Тор1-катализируемой релаксации также нарушена, поскольку взаимодействия между связанным лекарственным средством и парой 5’-оснований вокруг расщепляющегося фосфата будут увеличивать энергетический порог для вращения ДНК [17]. Некамптотециновые ингибиторы топоизомераз Противоопухолевые агенты индолокарбазолы и инденоизохинолины также действуют как hTop1-яды [16]. Вместе с тем ветвящиеся группы образуют отличные от камптотецина химиотипически спе-цифичные взаимодействия с белком. В совокупности наблюдаемые изменения структуры белка и взаимодействующих с различными лекарственными веществами аминокислотных остатков показали ландшафт и эластичность карманов, связывающихся с лекарственным веществом. Данная информация должна способствовать разработке новых ингибиторов топоизомеразы типа IB. Интересно, что до сих пор не сообщалось о каталитическом ингибиторе топоизомераз типа IB. Структура hTop1 в комплексе с ДНК-дуплексом, содержащим 8-оксогуаниновое повреждение, предполагает, что фермент может принимать неактивную конформацию, в которой каталитический тирозин оказывается вне активного сайта. Любые соединения, которые связывают и стабилизируют это конформационное состояние hTop1, могут действовать как эффективные каталитические ингибиторы. Однако клиническую значимость разработки таких ингибиторов hTop1 ещё предстоит выяснить. Поиски некамптотециновых ингибиторов как для hTop1, так и для hTop2 ведутся среди самых разнообразных химических структур. В настоящее время анализ литературы позволяет выявить следующие тенденции в поиске новых химических структур ингибиторов: фторхинолоны, индолохинолины, нафтохиноны, хальконы (в том числе растительного происхождения), бензальдегиды, имидазопиридины, гетероциклические конденсированные азотсодержащие соединения. Последние включают уже известные активно использующиеся производные фенантролина, для которых, таким образом, был уточнён механизм действия, а также нуклеозидные ингибиторы топоизомеразы, производные бензотиазола, антрафурандионы. Приведённый перечень основных химических групп является далеко не полным, однако полный охват имеющейся литературы выходит за рамки данного обзора, поэтому мы приносим извинения тем авторам, чьим работам мы не смогли уделить достаточно внимания. Фторхинолоны В работе T. Kloskowski и соавт. для известного антибиотика ципрофлоксацина был выявлен цитостатический эффект, однако только против клеточной линии рака лёгкого человека A549. При этом клеточный цикл A549 останавливался в фазе G2/M, что указывает на механизм действия, связанный с ингибированием топоизомеразы II. Выявленные биологические эффекты ципрофлоксацина подтверждают гипотезу о том, что этот препарат может использоваться в адъювантной терапии для лечения рака лёгких благодаря его способности ингибировать топо-изомеразы II типа [18]. В работе Y.-C. Ma и соавт. сообщается об агенте HMNE3 - новом бис-фторхинолоновом хальконподобном производном, которое оказывает двоякое ингибирующее действие в отношении не только топоизомеразы II, но и тирозинкиназы, и индуцирует торможение роста и пролиферации опухолевых клеток [19]. Активность топоизомеразы 2 измеряли с использованием электрофореза в агарозном геле с плазмидой ДНК pBR322 в качестве субстрата. Обработка клеточных линий аденокарцином поджелудочной железы человека Capan-1 или Panc-1 агентом HMNE3 в концентрации 1,6-3,2 мкМ в течение 48 ч привела к значительному увеличению числа апоптотических клеток (р < 0,05). По сравнению с контролем HMNE3 индуцировал повышенную экспрессию белков, связанных с индукцией апоптоза. Одновременно с этим отмечалось снижение активности тирозинкиназы в Capan-1 при IC50 0,64 ± 0,34 мкМ и в Panc-1 при IC50 3,10 ± 0,86 мкМ. Также было отмечено дозо- и времязависимое ингибирование активности c-Src в этих клеточных линиях. В соответствии с данными об апоптозе после обработки HMNE3 в течение 24 ч отмечалось значительное снижение активности Top2β. Суммируя полученные данные, можно считать, что HMNE3 индуцировал апоптоз в клетках Capan-1 и Panc-1, ингибируя активность тирозинкиназы и Top2. В недавнем исследовании [20] авторы продемонстрировали молекулярный докинг тринадцати фторхинолонов с человеческой Top2α и Top2β. Фторхинолоны являются антибактериальными антибиотиками широкого спектра действия и очень эффективны против различных бактериальных инфекций. Некоторые из фторхинолонов, такие как моксифлоксацин, оказывают противогрибковое действие, а также обладают противоопухолевой активностью. Моксифлоксацин образует комплексы с Тор2α и ответственен за прекращение репликации ДНК. Исследования молекулярной стыковки показали, что фторхинолоны образуют водородную связь и обладают хорошей аффинностью связывания с Top2α и Top2β человека. Следовательно, фторхинолоны могут ингибировать активность фермента топоизомеразы путём связывания на её активном участке. Предполагается, что офлоксацин, спарфлоксацин, ципрофлоксацин и моксифлоксацин являются самыми мощными ингибиторами среди тринадцати изученных фторхинолонов. В связывании Top2α с фторхинолонами участвуют остатки аминокислот Gln773, Asn770, Lys723 и Trp931, в то время как в связывании Top2β с фторхинолонами участвуют аминокислотные остатки AspO79, Ser480, Arg820, Arg503, Lys456 и Gln778. Исследователи предполагают, что фторхинолоны могут быть ингибиторами ДНК-топоизомеразы II и, следовательно, могут быть использованы в качестве противоопухолевых препаратов. 3-хлорметилен-6-фтортиохроман-4-он (CMFT) представляет собой новое производное тио-хроманонов, которое обладает противоопухолевой активностью. Y. Wang и соавт. сравнили противоопухолевую активность цис- и транс-изомеров и исследовали их ингибирующее действие на топоизомеразу I и топоизомеразу II человека в бесклеточной системе [21]. Ингибирование CMFT Top1 и Top2 можно было идентифицировать путём добавления растворов CMFT в реакционные смеси топоизомераза-ДНК и наблюдения относительных количеств релаксированных нитей и суперспиралей при электрофоретическом анализе. Результаты показали, что CMFT обладает ярко выраженной противоопухолевой активностью в низких концентрациях, при этом активность транс-изомера CMFT выше. Показано также, что CMFT индуцирует апоптоз. Анализы релаксации ДНК, а также анализы её расщепления и повторного лигирования продемонстрировали высокий потенциал взаимодействия с Top1 и Top2, подтвердив, что CMFT является Top-ядом, что может быть одним из механизмов индукции апоптоза клеток. Индолохинолины Криптолепин (CRP) - встречающийся в природе индолохинолиновый алкалоид (выделенный из корней Cryptolepis sanguinolenta семейства Periplocaceae) - противомалярийный препарат, применяемый в Центральной и Западной Африке. H.C. Pal и соавт. [22] изучили влияние криптолепина на рост немеланомных опухолевых клеток кожи человека (NMSCC) SCC-13 и A431 и механизм его действия. Клетки SCC-13 и A431 экспрессируют топоизомеразы (Top1 и Top2) в более высоких концентрациях. Их активность по сравнению с нормальными эпидермальными клетками человека также повышена. Обработка клеток криптолепином (2,5; 5,0 и 7,5 мкМ) в течение 24 ч приводила к заметному снижению активности топоизомеразы, ассоциированному с существенным повреждением ДНК, которое было обнаружено с помощью метода ДНК-комет. Все эти изменения в NMSCC под действием криптолепина приводили к значительному уменьшению жизнеспособности клеток, снижению колониеобразования и индукции апоптоза. Криптолепин индуцировал повреждение ДНК, приводившее к увеличению фосфорилирования ATM/ATR, BRCA1, Chk1/Chk2 и γH2AX, активации сигнального каскада p53, включая усиление экспрессии белков p16 и p21, ингибированию циклинзависимых киназ, циклинов D1, A, E и белков, участвующих в делении клеток (например, Cdc25a и Cdc25b), что приводило к остановке клеточного цикла в S-фазе. Кроме того, нарушался мембранный потенциал митохондрий и происходило высвобождение цитохрома С. Нафтохиноны Среди нафтохинонов особое внимание в последние годы уделяется исследователями лапахолу и его производным. Лапахол (4-гидрокси-3-(3-метилбут-2-енил)нафтален-1,2-дион) представляет собой нафтохинон, выделенный из многих видов семейства Bignoniaceae, произрастающих в Центральной и Южной Америке [23]. На опухолевых моделях лапахол изучали с 1970-х годов. Цитотоксичность лапахола и его производных была оценена на различных культурах клеток, а также на нескольких моделях перевиваемых опухолей мышей. Лапахол проявил значительное ингибирующее действие на рост глиомы C6 у крыс линии Wistar (р < 0,05) in vitro и in vivo. Показано также, что ингибирование пролиферации, индукция апоптоза и повреждение ДНК зависят от концентрации лапахола [24]. Влияние лапахола на Tор1 и Tор2 обнаружено при анализе релаксации суперспиральной ДНК плазмиды pBR322, опосредованной Tор1 и Tор2, а также в исследовании молекулярного докинга. Выявлено, что лапахол может ингибировать активность как Тор1, так и Тор2. В случае ингибирования Тор2 механизм действия лапахола аналогичен таковому у этопозида. Кроме того, лапахол снижает уровни экспрессии Tор2, хотя не влияет на экспрессию Tор1. По мнению исследователей, цитотоксичность лапахола может быть опосредована его влиянием на топоизомеразы. H. Xu и соавт. синтезировали и изучили аминопроизводные лапахола [23]. В этом ряду наиболее перспективным оказалось соединение 3а с пропиленовым заместителем в аминогруппе, показавшее значимую цитотоксичность для клеточных линий С6, LoVo, карциномы Эрлиха и К562, IC50 = 3,7-7,0 мкМ [23-25]. Была разработана и синтезирована серия новых производных лапахола, имеющих индольные каркасы [26, 27]. Антипролиферативная активность этих новых соединений in vitro оценивалась на клеточных линиях Eca109 и Hela. Почти все исследованные соединения проявили сильную ингибирующую активность в отношении двух испытуемых линий опухолевых клеток. Тест на Top1-опосредованную активность релаксации ДНК показал, что эти новые соединения обладают мощным ингибирующим действием в отношении Top1. Самые активные в этом отношении соединения 4n и 4k продемонстрировали более высокую цитотоксичность, чем камптотецин, и сравнимое с камптотецином ингибирование Top1 при концентрации 25 мкМ. Кроме того, методом окрашивания Hoechst 33342 также было показано, что эти вещества могут индуцировать апоптоз клеток Hela. Хальконы K. Jeon и соавт. разработали и синтезировали 22 гетероароматических циклических эпоксид- или тио-эпоксидзамещённых производных халькона [24]. В тесте ингибирования Тор1 соединение 1 было наиболее активным, но менее активным по сравнению с камптотецином. Соединения 9, 11 и 13 ингибировали функцию Тор2 сильнее, чем этопозид: ингибирование около 90 и 30% против 72 и 18% при 100 и 20 мкМ соответственно. В цитотоксическом тесте на клетках рака молочной железы человека было показано, что соединение 9 при IC50 6,61 ± 0,21мкM ингибирует рост линии T47D, а соединение 13 при IC50 4,32 ± 0,18 мкМ эффективно подавляет рост клеток линии MDA-MB468. Бензальдегиды В исследовании на клетках аденокарциномы лёгкого человека A549 показано, что куминальдегид подавляет пролиферацию, индуцирует апоптоз и образование лизосом с увеличением объёма кислых компартментов, подавляет активность Тор1 и Тор2, а также активность теломеразы в зависимости от концентрации. Подобные эффекты были обнаружены и на других линиях клеток, включая плоскоклеточный рак лёгкого человека NCI-H520 и аденокарциному толстой кишки COLO205. Кроме того, куминальдегид эффективно ингибировал рост опухолей человека in vivo на модели мышей Nude. Авторы сделали вывод о том, что куминальдегид может быть потенциальным агентом для противоопухолевой терапии [28]. Имидазопиридины Синтезирован ряд имидазопиридинил-1,3,4-оксадиазольных конъюгатов и исследована их цитотоксичность. Оказалось, что соединение 8q (NSC: 763639) было значимо активно на панели различных клеточных линий опухолей человека NCI-60 (США) (IС50 = 1,30 ± 5,64 мкм). Проточный цитометрический анализ показал, что соединение 8q останавливает клеточный цикл линии A549 в фазе суб-G1 с последующей индукцией апоптоза. Это было дополнительно подтверждено с помощью V-FITC, Hoechst-ядерного окрашивания, выявления активации каспазы 3, измерения потенциала митохондриальной мембраны и детекции генерации АФК. Результаты анализа Top2-опосредованной релаксации ДНК показали, что конъюгат 8q может значительно ингибировать активность Top2. В молекулярно-докинговых исследованиях были выявлены механизмы связывания с ферментом топоизомеразой (PDBID 1ZXN) [29]. Гетероциклические конденсированные азотсодержащие соединения В работе I. Riddell и соавт. противоопухолевый агент фенантриплатин - цис-[Pt(NH3)2(фенантридин)Cl](NO3) проявил себя как яд Top2 в дополнение к его известным механизмам действия - ингибированию ДНК- и РНК-полимеразы. Его эффективность основана на сочетании различных путей ингибирования пролиферации. При этом повреждения типа образования ковалентного комплекса ДНК-платина отличаются от тех, которые генерируются известными токсинами топоизомеразы. Последние обычно оказывают своё действие путём интеркаляции в месте расщепления фермента. Выявление этого феномена в отношении Top2 открывает возможность разработки неклассических противоопухолевых агентов, способных преодолевать лекарственную резистентность [30]. Приложено много усилий, направленных на разработку двойных ингибиторов Top1/Top2, которые проявляют высокую цитотоксичность и высокое сродство к обоим ферментам. В связи с этим было показано, что полное уничтожение топоизомеразных процессов в опухолевой клетке является чрезвычайно эффективным in vitro и in vivo для широкого спектра опухолей. Впоследствии двойные ингибиторы Top1/Top2 были оценены в клинических испытаниях фазы I/II: пиразолоакридин (PZA), бензопиридоиндольн-интоплицин, производные феназина XR11576 и XR594, батрацилин и инденохинолинон TAS-103, а также этопозидное производное тафлупозида гомокамптотецинэломотекан [31]. Хотя в доклинических исследованиях продемонстрирована перспективность этих производных, их эффективность пока не подтвердилась в клинике. Известно, что природные бензо[c]фенантридиновые алкалоиды обладают широким спектром фармакологической активности [30]. Среди них четвертичные аммониевые соли фагаронина и нитидин проявляют умеренную двойную токсическую активность в отношении топоизомераз I и II типов. В середине 1990-х годов был найден лёгкий и простой путь синтеза других аналогов, например 11-замещённых 6-аминобензо[с]-фенантридинов. С. Meier и соавт. описывают пиридо[3,4-с][1, 9]фенантролин (P8-D6) как мощный индуктор апоптоза, вызванного эквипотентным ингибированием активности топоизомераз 1 и 2 человека [30]. P8-D6 оказался активным против всех типов опухолей панели NCI-60. Вещество показало необыкновенно высокую общую цитотоксическую активность: средняя IC50 для всех протестированных линий составила 49 нм, что сопоставимо с таковой у камптотецина. Его ингибирующий эффект был в 4-10 раз выше по сравнению с другими упомянутыми двойными ингибиторами Toр1/Тор2, недавно прошедшими клинические испытания. Особо была отмечена чувствительность к P8-D6 клеток лейкемии и клеток NSCLC (немелкоклеточный рак лёгкого). P8-D6 обладает способностью ингибировать каталитическую активность топоизомераз I и II типа в низких микромолярных концентрациях in vitro. Существенной разницы между Top2α, которая достигает максимальных уровней белка в G2/M-фазе в клетках человека, и Top2β, которая экспрессируется независимо от пролиферативного статуса и клеточного цикла, не установлено [31]. Ещё одним классом в этой категории веществ являются акридины. Разработкам препаратов на их основе посвящён недавний фундаментальный обзор Zhang B. и соавт. [32]. Остановимся на некоторых из них, имеющих природное происхождение. Акроницин является естественным алкалоидом, выделенным в 1948 г. из австралийского дерева Acronchia baueri Schott, принадлежащего семейству Rutaceae. Он оказался активен против множества солидных опухолей. На основе его структуры синтезировано и описано в литературе множество соединений с антипролиферативной и антитопоизомеразной активностью. Пиридоакридины, такие как амфимедин и неоамфимедин, которые были выделены из тихоокеанских губок Amphimedon sp. и Xestospongia sp., соответственно обладают Top2-опосредованной цитотоксичностью. IC50 неоамфимедина на восьми линиях опухолевых клеток составляла 0,83-7,6 мкМ, в то время как амфимедин не показал цитотоксичности в этой дозе. Кроме того, неоамфимедин проявлял противоопухолевую активность на подкожных ксенографтах колоректального рака человека HCT116 у бестимусных (nude) мышей. Показано, что мишенями асцидимина, первоначально полученного из асцидий Didemnum sp., являются Тоp2 и ДНК и это определяет его цитотоксичность. Асцидимин также проявляет антимикробную активность против Escherichia coli, Bacillus subtilis, Candida albicans и Cladisporium resinae. Триазолоакридон, имидазоакридинон, а также акридин-индольные гибриды также оказывают ингибирующее действие на топоизомеразы II типа [32]. Нуклеозидные ингибиторы топоизомеразы На основе нуклеозидов разработаны новые селективные ингибиторы топоизомеразы 2. Показана значимость фрагментов катехиновой природы для проявления ингибирующего действия производных нуклеозидов в отношении топоизомеразы 2. Кроме того, ряд соединений из числа нуклеозидных производных и промежуточных соединений их синтеза, содержащих TBS-группу (tret-butyldimethylsilyl, трет-бутилдиметилсилил) и/или 1,3-дитиановый фрагмент, проявили сравнительно более высокую активность и селективность. В дальнейших экспериментах соединение 25b с β-конфигурацией тиминового фрагмента показало высокую антипролиферативную активность на 39 из 60 линий опухолевых клеток человека (NCI-60) и было более эффективным, чем его аналог 26b, содержащий тиминовый фрагмент в α-конфигурации. В сравнении с неактивным на этих моделях этопозидом цитотоксичность соединения 15b была значимо выше, IC50 = 8,1 ± 3,2 мкм [33, 34]. Производные бензотиазола Был синтезирован ряд новых 1-иминоизоиндолинов (3a-d) и изоиндолин-1-онов (4a-e), замещённых амидинобензотиазолами (3a-b, 4a-b) и амидинобензимидазолами (3c-d, 4c-e) [35]. Серосодержащие производные (3a-b, 4a-b) были малоизбирательны в отношении опухолевых клеток и показали высокую антипролиферативную активность не только в отношении различных карцином (цервикальной HeLa, колоректальной SW620, гепатоцеллюлярной HepG2 и молочной железы MCF-7), но и на диплоидных фибробластах человека BJ. Для наиболее эффективных соединений 4а и 4b анализ клеточного цикла и влияния на активность каспаз показал активацию митохондриального апоптотического пути в результате связывания с ДНК. Амидинзамещённые изоиндолин-1-оны 4a-d были более цитотоксичны по сравнению с амидинзамещёнными 1-иминоиоиндолинами 3a-d. Соединения без амидиновой группы ингибировали рост только клеток MCF-7. Для всех оцениваемых соединений показана ранняя ядерная локализация (после 5-часового лечения). Действительно, несущие положительный заряд амидинзамещённые производные 3a-d и 4a-b взаимодействуют с ДНК-спиралью. Напротив, производные 5а-d без амидиногруппы не проявляли ДНК-связывающих свойств, видимо, из-за отсутствия положительного заряда. Соединения 4a-b связывались со спиральной канавкой ДНК (спектры кругового дихроизма) или интеркалировали её (эксперименты по разрыву ДНК, индуцированные топоизомеразой 1). Они действуют как ингибиторы топоизомеразы 2, локализуясь в ядре, что согласуется с их антипролиферативной активностью (индукция апоптоза) в субмикромолярном диапазоне. Для амидинзамещённого производного 1-иминоизоиндолина 3a антипролиферативная активность оказалась значительно ниже для всех тестируемых клеточных линий, за исключением MCF-7 (в микромолярном диапазоне). Этот результат стал неожиданностью. Высказано предположение, что ядерная локализация для связывания с канавкой ДНК и интеркалирующий механизм действия, приводящий в эксперименте к выраженному «отравлению» топоизомеразы 1, сходному с камптотециновым. Показанные для 3а свойства создают предпосылки для большей цитотоксичности, что может быть следствием неизвестных механизмов действия или инактивации данного соединения. Амидинзамещённые производные 1-иминоиоиндолина 3b-d проявляли слабую антипролиферативную активность, ядерную и цитоплазматическую локализацию и интеркалирующее ДНК-связывание, но соединение 3d показало отсутствие или очень слабое ингибирование топоизомеразы. На этом основании высказано предположение о том, что для проявления как Top2-отравляющего действия, так и антипролиферативной активности наибольшее значение имеют структуры типа: изоиндолин-1-он + амидинобензотиазол с амидиновой группой [35]. Антрафурандионы Сравнительно недавно был открыт перспективный класс противоопухолевых ингибиторов топо-изомераз на основе гетероциклических производных антрахинона, в частности производные антра[2, 3-b]фуран-5,10-диона. Нуклеофильным замещением пропоксигрупп диаминами получена серия 4,11-диаминоантра[2, 3-b]фуран-5,10-дионов (рис. 2) - аналогов противоопухолевого препарата аметантрон [36, 37]. Исследование антипролиферативной активности на широкой панели клеточных линий опухолей млекопитающих показало, что антрафурандионы (1, 2) обладают наибольшей активностью среди конденсированных гетероаренантрацендионов с одним гетероатомом [36, 37]. Идентифицирован ряд соединений, ингибирующих рост опухолевых клеток в субмикромолярных концентрациях. Антра[2, 3-b]фуран-5,10-дион (2) с дистальными метиламиногруппами оказался высокоактивен против лекарственно-устойчивых клеточных линий с избыточной экспрессией Р-гликопротеина или делецией гена р53 [36]. Кроме того, это соединение блокирует in vitro Top1-опосредованное раскручивание ДНК в низких микромолярных концентрациях. Эти результаты показывают, что антрафурандионы представляют собой новый перспективный класс производных антрахинона со свойствами, потенциально ценными для противоопухолевой терапии. Позднее была синтезирована и изучена вторая серия 4,11-диаминоантра[2, 3-b]фуран-5,10-дионов с различными боковыми цепями [37]. От предыдущих аналогов [36] эти соединения отличаются отсутствием алкильной группы в фурановом кольце. Такая модификация привела к росту антипролиферативной активности производных. Наиболее высокую активность на панели опухолевых клеток млекопитающих, включая варианты с множественной лекарственной устойчивостью, показали 2-незамещённые производные (3, 4), содержащие боковые амино- и метиламиногруппы. Для 4,11-диаминоантра[2, 3-b]фуран-5,10-дионов (1-4) выявлены множественные механизмы цитотоксичности, включая ингибирование Top1/Top2-опосредованной релаксации ДНК, снижение соотношения NAD+/NADH через ингибирование tNOX, подавление NAD+-зависимой активности деацетилазы Сиртуин 1 (SIRT1) и активацию каспазо-опосредованного апоптоза [37]. В этой работе впервые показано, что опухоль-ассоциированные NADH-оксидазы (tNOX) и SIRT1 являются важными клеточными мишенями противоопухолевых антрацен-9,10-дионов. Позднее было обнаружено, что антрафурандион (3) обладает высокой аффинностью к G-квадруплексам из 5’-нетранслируемого участка мРНК транскрипта онкогена KRAS и дозозависимо подавляет трансляцию мРНК этого онкогена и синтез его продукта в опухолевых клетках - белка p21KRAS [38]. Другим перспективным химотипом для поиска противоопухолевых ингибиторов топоизомераз являются производные антрафуран-3-карбоксамида. Наиболее изученным соединением этого ряда является антрафуран ЛХТА-2034 (5), отличающийся от предыдущих веществ наличием аминопирролидидкарбонильной группы в положении 3 гетероцикла, а также гидроксигрупп в положениях 4, 11 (рис. 3) [39]. Антрафуран ЛХТА-2034 в низких концентрациях ингибирует топоизомеразы 1 и 2, а также ряд важных для опухолевого роста протеинкиназ (AurB, Pim). Это соединение обладает высокой активностью в отношении опухолевых клеток с различными фенотипами множественной лекарственной устойчивости и высокой противоопухолевой эффективностью на прогностически значимых для клиники опухолевых моделях. В 2018 г. описан синтез расширенной серии аналогов ЛХТА-2034, тестирование биологических свойств которой позволило выявить роль функциональных групп в противоопухолевых свойствах антрафуран- 3-карбоксамидов [40]. Для улучшения растворимости ЛХТА-2034 в воде были созданы и изучены его комплексы с солюбилизирующим 2-гидроксипропил-β-циклодекстрином (HP-βCD) [41]. Взаимодействие ЛХТА-2034 с HP-βCD привело к формированию комплекса включения ЛХТА-2034/HP-βCD со стехиометрическим соотношением 1:1. На основе комплекса ЛХТА-2034/HP-βCD разработан прототип парентеральной лиофилизированной лекарственной композиции с улучшенной по сравнению с субстанцией ЛХТА-2034 (более чем в 10 раз) растворимостью в воде, высокой стабильностью и меньшей «острой» токсичностью при парентеральном применении. Комплекс ЛХТА-2034/HP-βCD показал высокую противоопухолевую эффективность, увеличивая выживаемость мышей с лейкозом P388 до 140%, без достоверных отличий от субстанции ЛХТА-2034 в идентичных схемах применения (30 мг/кг × 5 дней). Кроме того, композиция ЛХТА-2034/HP-βCD эффективна на модели лейкоза с множественной лекарственной устойчивостью Р388/ADR, а также на высокометастазирующей в лёгкие меланоме B16/F10 [42]. Заключение Таким образом, анализ тематической литературы показал, что среди ингибиторов топоизомеразы ведутся интенсивные поиски самых разнообразных лекарственных средств. Исследователи как модифицируют известные базовые структуры, так и синтезируют новые. Открытие Top-направленного действия у уже известных препаратов, таких как фенантридин, расширяет сведения об их механизме действия. Для выявления ингибирующего действия в отношении топоизомераз применяют методы с использованием плазмидных ДНК. Параллельно изучается цитотоксическая активность, а также такие показатели, как индукция апоптоза, в том числе путём активации каспаз, изменение митохондриального потенциала, влияние на р53 и другие. Среди агентов, проявляющих свойства ингибиторов топоизомераз, одними из наиболее перспективных для онкологии химических соединений можно считать антрафурандионы, дающие хороший выход активных оригинальных ингибиторов. Особенно важен тот факт, что в РФ осуществляются синтетические и аналитические исследования этого ряда, лежащие в основе разработки лекарственных субстанций и их оптимальных лекарственных форм. Всё вышесказанное позволяет заключить, что исследования в данном направлении чрезвычайно актуальны и востребованы. Прогностически значимые данные, полученные в ходе доклинических исследований, позволяют надеяться, что созданные противоопухолевые средства проявят высокую эффективность при клинических испытаниях.

About the authors

Michael I. Treshalin

Gause Institute of New Antibiotics

Email: funky@beatween.ru
MD, senior researcher of the Laboratory of pharmacology and chemotherapy of the Gause Institute of New Antibiotics, Moscow, 119021, Russian Federation Moscow, 119021, Russian Federation

E. V Neborak

The Peoples’ Friendship University of Russia

Moscow, 117198, Russian Federation

References

Supplementary files