SERUM LEVELS OF TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF-A) AND ITS SOLUBLE RECEPTORS STNF-R1 AND STNF-R2 IN CANCER PATIENTS

Full Text

В течение многих лет в онкологии ведутся поиски методических подходов к использованию провоспа-лительного цитокина - фактора некроза опухолей а (ФНОа) в качестве биотерапевтического противоопухолевого средства. Обладая плейотропным действием, прежде всего иммунорегуляторного характера, он также выполняет функции эффекторной молекулы, связываясь с клетками-мишенями (в том числе с опухолевыми и эндотелиальными клетками через специфические рецепторы (ФНОа-Р), и индуцирует апоптоз клеток [1, 2, 9, 10, 12]. В то же время наличие выраженных и разнообразных побочных эффектов (обусловленных плей-отропностью данного мощного провоспалительного цитокина) является серьезным препятствием для его использования в практической онкологии [1, 13]. Обоснованием для разработки альтернативного подхода к использованию ФНОа послужило понимание механизма поддержания в норме его сверхнизких сывороточных концентраций. Так, было показано, что в норме часть мембранных рецепторов к ФНОа сбрасывается с клеток разных типов в сыворотку крови (СК) и связывает свободный ФНОа с формированием функционально неактивных комплексов [6, 9]. При этом регистрируют повышение уровня растворимых рецепторов (рФНОа-Р) [6, 9]. В ряде работ сообщается, что у онкологических больных при повышении уровня растворимых рецепторов ФНОа прогноз заболевания хуже [5, 7, 11]. Это явилось обоснованием для разработки методологии использования иммунных адсорбционных колонок с иммобилизованными антителами к рецепторам (ФНОа-Р1 и ФНОа-Р2) с целью их экстракорпоральной сорбции из крови, что теоретически должно приводить к увеличению концентрации в сыворотке свободного активного ФНОа [7-9]. В то же время такой подход к противоопухолевой терапии требует тщательного исследования исходного уровня ФНОа, его рецепторов и их соотношения у онкологических больных для разработки критериев отбора пациентов для апробации специфической аффинной сорбции. Данная работа является продолжением ранее начатого исследования, направленного на изучение состояния баланса ФНОа - рФНОа-Р у больных с различными солидными опухолями [3, 4]. Цель работы - изучение сывороточных уровней ФНОа и его растворимых рецепторов рФНО-Р1 16 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ 701 С 60 - 56,7 С 50- і У/// 40,0 40- Щ 1 30- Ж 19,7 у/У/ 20- Щщ. W 10 - шщ п W У/// и т I т 60,5 13,0 3,3 V777& I II 0-9,9 I II 10-19,9 I II 20-29,9 пг/мл 6,7 I II >30 Рис. 1. Распределение доноров (I) и онкологических больных (II) по уровням ФНОа в сыворотке крови. пг/мл Рис. 2. Распределение доноров (I) и онкологических больных (II) по уровням рФНО-Р1 в сыворотке крови. и рФНО-Р2 у больных со злокачественными новообразованиями органов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) - раком желудка (РЖ), колоректальным раком (КРР), а также плоскоклеточным раком головы и шеи (ПРГШ), раком легкого (РЛ) и у пациентов с меланомой в сравнении со здоровыми донорами как этап разработки протокола исследования клинической значимости метода специфической аффинной сорбции рецепторов к ФНОа из СК онкологических больных. Объектом исследования уровней ФНОа, рФНО-Р1 и рФНО-Р2 служила СК 32 доноров и 238 онкологических больных: 43 первичных больных КРР; 39 первичных больных РЖ, 27 первичных больных ПРГШ, 45 больных с меланомой (26 первичных и 19 случаев рецидивов/генерализации процесса) и 84 больных первичным раком легкого (43 случая плоскоклеточного рака, 32 - адено-генного и 9 - диморфного). Уровень ФНОа и его растворимых рецепторов (рФНО-Р1 и рФНО-Р2) в СК определяли твердофазным иммуноферментным сэндвич-методом с помощью соответствующих тест-систем: TNF-а (фирма "BioSource, Inc.", США), Human sTNF-RI/TNFRSF-1A (фирма "R&D Systems", США), Human sTNF-RII/TNFRSF-1B Immunoassay (фирма "R&D Systems, Inc.", США). Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью методов классической статистики. На предыдущем этапе работы были оценены границы нормы ФНОа и его рецепторов у здоровых лиц [3, 4]. Было установлено, что 96,7% доноров имели уровни ФНОа в диапазоне 0-19,9 пг/мл, что отражает значения нижней и верхней границ нормы данного цитокина. У всех доноров уровни рФНО-Р1 находились в пределах 1000-2000 пг/мл, и крайние значения, таким образом, выбраны в качестве нижней и верхней границ нормы данного рецептора. Абсолютное большинство здоровых лиц (96,9%) имели уровни рФНО-Р2 в диапазоне 1000-3500 пг/мл, его крайние значения также взяты за нижнюю и верхнюю границы нормы для рецептора-2 ФНОа [3, 4]. Распределение по уровням ФНОа у больных РЖ, КРР, ПРГШ, РЛ и с меланомой отличалось от такового у доноров: наблюдали сдвиг в сторону больших значений (рис. 1). Так, среди доноров более половины (56,7%) имели уровни цитокина в нижнем диапазоне нормальных значений (0-9,9 пг/мл), 40% - 10,0-19,9 пг/мл и только у одного (3,3%) значение ФНОа превышало верхнюю границу нормы (см. рис. 1). Среди онкологических больных только у 19,7% сывороточные уровни ФНОа находились в нижней половине диапазона нормы. Большинство пациентов (60,5%) имело уровни цитоки-на в верхней половине диапазона нормальных значений (10-19,9 пг/мл). Почти у каждого пятого онкологического больного (19,7%) обнаружены уровни ФНОа, превышающие норму (> 20 пг/мл), при этом у 6,7% пациентов они оказались выше 30 пг/мл (такую картину наблюдали при всех типах опухолей). При сравнении разных локализаций злокачественных заболеваний оказалось, что сдвиг распределения ФНОа был наиболее выраженным при РЖ и КРР (у 33,3 и 32,6% больных) -выше 20 пг/мл, наименьшим - при ПРГШ (сдвиг в сторону высоких значений, но в пределах верхней границы нормы). По выраженности сдвига распределения ФНОа у больных с меланомой и РЛ (среди больных с другими локализациями опухолей) занимали промежуточное положение: соответственно у 20 и 11,9% пациентов уровень цитокина был выше 20 пг/мл. Распределение по уровням рецептора рФНО-Р1 у онкологических больных также было сдвинуто в сторону больших значений в сравнении с донорами, причем в большей степени, чем распределение самого ФНОа (рис. 2). Так, если почти все доноры (96,9%) имели уровни рФНО-Р1 в диапазоне 1000-2000 пг/мл, то среди онкологических больных в целом таких было только 69,3%. Почти у 1/3 (30,2%) пациентов обнаружены повышенные (более 2000 пг/мл) уровни данного рецептора. Этот сдвиг оказался наиболее выраженным у больных РЖ и КРР (43,6 и 37,2% пациентов имели повышенные значения данного рецептора). У пациентов с меланомой и ПРГШ сдвиг рФНО-Р1 был менее выражен (15,5 и 18,5% повышенных значений); РЛ по этому параметру занимал промежуточное положение (32,1%). Сходную картину наблюдали в отношении распределения по уровням второго рецептора - рФНО-Р2. Так, если у 1/3 (34,4%) доноров уровни рФНО-Р2 зарегистрированы в нижнем диапазоне нормы (1000-1999 пг/ мл), то при злокачественных заболеваниях лишь 14,3% больных имели столь низкие уровни рецептора (рис. 3). Во втором диапазоне (2000-2999 пг/мл) доля онкологических больных составила 44,5%. В верхнем диапазоне нормы (3000-3499 пг/мл) доля больных (16,4%) также достоверно превысила долю доноров (9,4%). В целом у каждого четвертого онкологического больного (24,8% против 3,1% у доноров) зарегистрированы повышенные уровни данного рецептора. Наиболее выраженным сдвиг распределения уровней рФНО-Р2 оказался при РЖ, КРР и РЛ (35,9, 27,9 и 27,4% пациентов имели по 17 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 1, 2012 % пг/мл Рис. 3. Распределение доноров (I) и онкологических больных (II) по уровням рФНО-Р2 в сыворотке крови. вышенные значения данного рецептора). У больных с меланомой и ПРГШ сдвиг распределения рФНО-Р2 в сторону больших значений был менее выражен (11,1 и 18,5% случаев повышения). Закономерно, что и средние уровни исследуемых ци-токина и его рецепторов оказались выше у онкологических больных в сравнении с донорами (табл. 1). Так, у онкологических больных в целом уровень ФНОа оказался в 1,55 раза выше, а уровни его рецепторов рФНО-Р1 и рФНО-Р2 - в 1,34 и 1,26 раза выше, чем у доноров. Сравнивая разные локализации опухолей, можно отметить, что самые высокие уровни ФНОа обнаружены при РЖ и КРР, самые низкие - при ПРГШ, промежуточные - при РЛ и меланоме. Самые высокие уровни рФНО-Р1 также установлены при КРР и РЖ, самые низкие - при меланоме и ПРГШ, промежуточные - при РЛ. Наиболее высокие уровни рФНО-Р2 выявлены при РЖ, КРР и РЛ, самые низкие - при меланоме, промежуточные - при ПРГШ. В целом при тех локализациях, где в СК была самая высокая сывороточная концентрация ФНОа, оказались самыми высокими и концентрации его рецепторов. На активацию рецепторной защиты от ФНОа-зависимого апоптоза при генерализации опухолевого процесса косвенно указывает сравнение исследуемых параметров у доноров, первичных больных с меланомой и больных с меланомой при прогрессировании процесса в разные сроки после проведенного лечения. Действительно, средние уровни ФНОа, рФНО-Р1 и рФНО-Р2 в этой выборке первичных больных с меланомой не отличались от таковых у доноров, тогда как у больных с рецидивом или прогрессированием заболевания содержание рФНО-Р1 и рФНО-Р2 в СК было достоверно выше, чем у доноров и у первичных больных (табл. 2). Было установлено, что сочетанное повышение уровней ФНОа и рФНО-Р1 имело место у 13% всех онкологических больных, а ФНОа и рФНО-Р2 - у 12,2% (табл. 3). У 11,3% больных оказались повышенными одновременно уровни ФНОа и обоих его рецепторов (см. табл. 3). По локализациям наибольшее количество пациентов с сочетанным повышением уровней ФНОа и одного или двух его рецепторов имели РЖ и КРР (соответственно 25,6, 23,1 и 23,1% - РЖ и 23,3, 25,6 и 18,6% - КРР), наименьшее - ПРГШ (0, 3,7 и 0%). Меланома и РЛ занимали промежуточное положение (11,1, 8,8, 8,9 и 7,1, 7,1, 7,1% соответственно). Из 47 онкологических больных, у которых было повышено содержание ФНОа, 33 (70,2%) имели повышенные уровни рецепторов первого или второго типа или обоих, а диапазон частот повышения - 55,6-78,5. Данный факт - дополнительное свидетельство стремления "цитокиновой сети" к динамическому равновесию даже в условиях патологического процесса. Это укладывается в представление о том, что уровни растворимых рецепторов ФНОа, являющихся антагонистами мощного цитотоксического цитокина ФНОа, должны коррелировать с колебаниями его концентраций для поддержания динамического равновесия, направленного на блокировку возможных "избыточных" эффектов ФНОа на различные звенья иммунитета и гомеостаза в целом. Доля пациентов с повышенным уровнем ФНОа, одновременно имеющих повышенный уровень рецепторов, была наибольшей при КРР и РЖ (78,5 и 76,9%); при РЛ и ме- Таблица 1 Средние уровни и доля случаев повышения уровня ФНОа и его рецепторов в сыворотке крови доноров и онкологических больных Показатель Доноры (п = 30) Онкологические больные (п = 238) средний уровень, пг/мл доля случаев с повышенным уровнем, % средний уровень, пг/мл диапазон средних уровней для опухолей разных локализаций, пг/мл доля случаев с повышенным уровнем, % диапазон повышения доли случаев для опухолей разных локализаций, % ФНОа 10,0 ± 0,6 3,3% 15,5 ± 0,5 11,3-18,8 19,7 3,7-33,3 рФНО-Р1 1384,5 ± 44,4 0% 1864,4 ± 42,5 1535,2-2077,8 30,2 15,5-43,6 рФНО-Р2 2291,4 ± 103,7 3,1% 2891,0 ± 58,7 2466,4-3159,6 24,8 11,1-35,9 Таблица 2 Средние уровни и доля случаев повышения уровня ФНОа и его рецепторов в сыворотке крови доноров и больных с меланомой (первичных и с рецидивом/прогрессированием) Показатель Доноры (п = 30) Больные с меланомой, первичные (п = 26) Больные с меланомой рецидив/прогрессирование (n = 19) средний уровень, пг/мл доля случаев с повышенным уровнем, % средний уровень, пг/мл доля случаев с повышенным уровнем, % средний уровень, пг/мл доля случаев с повышенным уровнем, % ФНОа 10,0 ± 0,6 3,3% 14,7 ± 1,6 11,5% 15,5 ± 1,7 31,6% рФНО-Р1 1384,5 ± 44,4 0% 1417,9 ± 67,3 11,5% 1695,8 ± 133,4 21,1% рФНО-Р2 2291,4 ± 103,7 3,1% 2251,5 ± 138,8 7,7% 2760,5 ± 205,0 15,8% 18 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ Таблица 3 Частота сочетанного повышения уровня ФНОа и его рецепторов в сыворотке крови онкологических больных Задаваемые условия Частота повышения, % (n = 238) Диапазон частот повышения для опухолей разных локализаций ФНОа > 20 пг/мл 13 0-25,6 рФНО-Р1 > 2000 пг/мл ФНОа > 20 пг/мл 12,2 3,7-23,1 рФНО-Р2 > 3500 пг/мл ФНОа > 20 пг/мл 11,3 0-23,1 рФНО-Р1 > 2000 пг/мл рФНО-Р2 > 3500 пг/мл ланоме она оказалась ниже (60,0 и 55,6%), а при ПРГШ сочетанное повышение наблюдали лишь у 1 пациента. Таким образом, динамическое равновесие "цитокино-вой сети" достигается в разной степени у разных больных с опухолями разных локализаций. Наличие баланса между ФНОа и его рецепторами подтверждает ранговый корреляционный анализ уровней ФНОа и его рецепторов в СК доноров и онкологических больных с разной локализацией опухолей. У онкологических больных отмечены выраженная взаимосвязь между уровнями обоих рецепторов, сходная с таковой у доноров (коэффициент ранговой корреляции (КРК) - 0,852 и 0,807 соответственно) и умеренная корреляция между уровнями ФНОа и его рецепторов (табл. 4). При этом связь ФНОа с первым рецептором у онкологических больных оказалась слабее, чем у доноров (КРК для ФНОа и рФНО-Р1 - 0,417 vs. 0,531), а связь ФНОа со вторым рецептором сохранилась на том же уровне, что и у доноров (КРК для ФНОа и рФНО-Р2 - 0,485 vs. 0,519). При опухолях разных локализаций степень корреляции различалась и была наиболее выражена при КРР и наименее - при ПРГШ. РЖ, РЛ и меланома по этим параметрам занимали промежуточное положение. Несмотря на наличие статистически значимых корреляций между сывороточными уровнями ФНОа и его рецепторов, которые свидетельствуют о "стремлении" к балансу в этой системе при развитии опухолевого процесса, обращают на себя внимание различия в выраженности этих корреляций при опухолях разных локализаций и у отдельных больных. Из представленных в табл. 1 данных очевидно, что сывороточные уровни рецепторов ФНОа на 2 порядка превосходят уровни самого ФНОа, т. е. присутствуют в СК в избытке. Для оценки более тонких различий в степени баланса между ФНОа и его растворимыми рецепторами мы подсчитали Таблица 4 Коэффициенты ранговой корреляции между уровнями ФНОа и его рецепторов в сыворотке крови доноров и онкологических больных Показатель Коэффициент ранговой корреляции доноры (п = 30) онкологические больные (n = 238) диапазон значений у онкологических больных с опухолями разных локализаций рФНО-Р1 vs. 0,807 0,852 0,730-0,943 рФНО-Р2 ФНОа vs. 0,531 0,417 0,310-0,697 рФНО-Р1 ФНОа vs. 0,519 0,485 0,425-0,737 рФНО-Р2 Таблица 5 Соотношение рФНО-Р1 и ФНОа в сыворотке крови доноров и онкологических больных Соотношение рФНО-Р1/ ФНОа, отн. ед. Доля случаев, % доноры (п = 30) онкологические больные (n = 238) диапазон значений у онкологических больных с опухолями разных локализаций < 100 3,3 26,9 11,1-40,0 100-200 96,7 61,8 55,5-65,5 > 200 - 11,3 0,0-33,3 соотношение одного из рецепторов (ФНОа-Р1) с его лигандом у каждого обследованного и представили в виде распределения (табл. 5). Оказалось, что у 96,7% доноров это соотношение находилось в сравнительно узком диапазоне значений (100-200 отн. ед.). Этот диапазон, вероятно, отражает состояние баланса уровней ФНОа и его растворимого рецептора в норме. В то же время у 1/3 онкологических больных это соотношение выходило за пределы данного диапазона (см. табл. 5). Так, у 26,9% больных соотношение рФНО-Р1/ФНОа оказалось менее 100 отн. ед., а у 11,3% пациентов - более 200 отн. ед. Эти данные подтверждают наличие у части онкологических больных дисбаланса между уровнями ФНОа и его растворимых рецепторов (в частности первого типа). Рассматривая разные локализации опухолей, следует отметить, что при меланоме, РЖ и КРР наблюдали существенный сдвиг соотношения рФНО-Р1/ФНОа в нижний диапазон (менее 100 отн. ед.), т. е. в сторону преобладания лиганда: соответственно 40,0, 35,9 и 34,9% больных. При ПРГШ, напротив, отмечен больший сдвиг этого соотношения в сторону преобладания рецептора (более 200 отн. ед.) - 33,3% пациентов. РЛ занимал промежуточное положение, представляя одинаковое количество пациентов в нижнем и верхнем диапазонах соотношения рФНО-Р1/ФНОа - 16,7 и 17,8%. Заключение В настоящем исследовании показано, что у онкологических больных (в сравнении с донорами) происходит сдвиг распределения по сывороточным уровням ФНОа и его растворимых рецепторов рФНО-Р1 и рФНО-Р2 в сторону больших значений. Большинство (70,2%) онкологических больных с повышенным содержанием ФНОа имели также повышенные уровни рецепторов первого или второго типа или обоих, что, вероятно, свидетельствует о "стремлении" сывороточной системы ФНО к динамическому равновесию даже в условиях опухолевого процесса. Наиболее выраженным сдвиг распределения уровня ФНОа и его рецепторов оказался при РЖ и КРР, наименее - при ПРГШ. РЛ и меланома занимали промежуточное положение. Доля пациентов с повышенным уровнем ФНОа, одновременно имеющих повышенный уровень рецепторов, была наибольшей при КРР и РЖ, а при ПРГШ сочетанное повышение отмечено лишь у 1 (3,7%) пациента. Таким образом, динамическое равновесие "цитокиновой сети" достигается в разной степени при опухолях разных локализаций и у разных больных. Показано, что у онкологических больных в целом сохраняется корреляция между содержанием сывороточных уровней ФНОа и его рецепторов, сходная с таковой у доноров. Однако при более детальном анализе обнаружено, что у ряда больных (при всех рассматриваемых 19 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 1, 2012 локализациях опухолей) существует дисбаланс между сывороточными уровнями ФНОа и рФНО-Р1 за счет нарастания доли случаев как с низким, так и с высоким соотношением рФНО-Р1/ФНОа.

About the authors

V. I. Chissov

Herzen Moscow Oncology Research Institute, Ministry of Health and Social Development of Russia

N. S. Sergeyeva

Herzen Moscow Oncology Research Institute, Ministry of Health and Social Development of Russia

N. V. Marshutina

Herzen Moscow Oncology Research Institute, Ministry of Health and Social Development of Russia

E. V. Filonenko

Herzen Moscow Oncology Research Institute, Ministry of Health and Social Development of Russia

M. P. Solokhina

Herzen Moscow Oncology Research Institute, Ministry of Health and Social Development of Russia

E. V. Zenkina

Herzen Moscow Oncology Research Institute, Ministry of Health and Social Development of Russia

P. A. N. A. Parilova

Herzen Moscow Oncology Research Institute, Ministry of Health and Social Development of Russia

References

Supplementary files