Том 66, № 3 (2024)

В настоящем мини-обзоре систематизирована информация о методах количественной оценки внутриклеточной концентрации перекиси водорода, основанных на использовании генетически кодируемого сенсора пероксида HyPer. Рассматриваются два подхода: 1) градуировка биосенсора с использованием экзогенной перекиси водорода, основанная на оценке скорости проникновения пероксида в клетки и внутриклеточной пероксидазной активности; 2) прямое определение внутриклеточного содержания пероксида, основанное на измерении уровня окисления биосенсора, константы реакции окисления и константы реакции восстановления HyPer в клетках. Применение этих методов позволяет решать широкий спектр задач клеточной редокс-биологии — ранжировать диапазон физиологических и повреждающих концентраций перекиси водорода в клетках, оценивать эффективность системы антиоксидантной защиты в различных клеточных компартментах в условиях окислительного стресса, определять вклад различных ферментативных систем в пероксидазную активность клеток и изучать особенности систем антиоксидантной защиты в различных биологических контекстах (в процессе клеточного старения, дифференцировки, репрограммирования, при развитии патологий). Описанные методы могут быть адаптированы для других генетически-кодируемых биосенсоров перекиси водорода.

В последние десятилетия генная терапия на основе аденовирусного E1A доказала свою эффективность в отношении ряда опухолевых заболеваний, как на животных моделях, так и в клинических исследованиях. Показано, что помимо собственной антипролиферативной активности, E1A также обладает способностью усиливать цитотоксический эффект некоторых противоопухолевых препаратов. Применение Е1А в комбинированной терапии может решить ряд проблем клинической онкологии, среди которых наиболее актуальными являются проблема устойчивости или невосприимчивости опухолевых клеток к цитотоксическому воздействию. В настоящей работе описано создание клеточных моделей с индуцируемой антибиотиком доксициклином экспрессией белка аденовирусного E1A на основе клеток колоректального рака человека HCT116 и цисплатин-устойчивых клеток HCT116/C. Нами показана концентрационная и временная зависимость экспрессии белка E1A от доксициклина, а также показан антипролиферативный эффект аденовирусного E1A при индукции его экспрессии в полученных клетках HCT116-E1A и HCT116/C-E1A in vitro в экспериментах по оценке жизнеспособности в тестах МТТ и клоногенной активности, а также и in vivo в ксенографтных мышиных моделях. Таким образом, в результате нашей работы была создана модель для анализа антипролиферативных и сенсибилизирующих свойств E1A в чувствительных и платино-устойчивых клетках колоректального рака и поиска новых подходов противораковой терапии in vitro и in vivo. Полученная клеточная линия является удобной моделью для подбора наиболее перспективных сочетаний цитостатиков с генной терапией на основе E1A.

Изучено влияние N-ацилпроизводных 2-амино-4,6-ди-трет-бутилфенола на функции нейтрофилов. Установлено, что производные со свободной гидроксильной группой в бензольном кольце, в отличие от О-метилированных, модифицируют свойства клеток, снижая генерацию хлорноватистой кислоты в процессе формирования респираторного взрыва. Эти соединения являются перехватчиками HOCl/OCl^–, генерируемых стимулированными нейтрофилами, и снижают секрецию миелопероксидазы (МПО) клетками. Показано, что наиболее эффективным перехватчиком хлорноватистой кислоты является N-(3,5-ди-трет-бутил-2-гидроксифенил)ацетамид. Это вещество значительно подавляет секреторную дегрануляцию нейтрофилов и оказывает цитопротекторное действие в условиях галогенирующего стресса.

Важной задачей местного применения лекарств для лечения глаз является достижение компромисса между их эффективностью и безопасностью. Разработка новых многофункциональных местных офтальмологических систем доставки лекарств и скрининг in vitro потенциальных лекарственных глазных средств являются ключевыми направлениями в решении этой задачи. В настоящем исследовании был проведен первичный in vitro скрининг влияния эхинохрома (Ech), комплекса каррагинана (CRG) и Ech и его липосомной формы (CRG/Ech-Lip) на культивируемые эпителиальные клетки наружной оболочки глазного яблока — клетки эпителия конъюнктивы (Chang Conjunctiva, Clone 1—5c-4) и эпителия роговицы человека (HCE). Оценивали жизнеспособность клеток по их морфологии и метаболической активности с использованием световой микроскопии и МТТ-теста. Выявлена прямая зависимость интенсивности проявления цитотоксического действия Ech относительно его концентрации в питательной среде, формы использования, клеточной тест-системы и времени воздействия Ech на клетки. Ech в форме спиртового раствора в питательной среде в конечной концентрации 0.1 мг/мл проявляет выраженную цитоксичность в отношении обеих клеточных тест-систем. Такая же концентрация Ech в питательной среде в составе комплекса CRG/Ech оказалась критичной только для жизнеспособности эпителиальных клеток роговицы, в то время как выживаемость клеток конъюнктивы в этом случае составляла около 50 %. Выявлена высокая биосовместимость липосомной формы каррагинанового комплекса эхинохрома CRG/Ech-Lip с клетками обеих тест-систем и стимулирующее цитопротекторное действие в отношении клеток эпителия коньюнктивы.

Клетка — это сложно организованная трехмерная система, обладающая целым рядом высокодинамичных структур, морфология которых сложна для описания, так как является протяженной, изрезанной, неровной. Актиновый цитоскелет, состоящий из фибриллярного и глобулярного актина, а также вспомогательных белков, регулирующих его организацию, является одной из таких структур. Изучение его организации и динамики — актуальный вопрос современной цитологии. Форма и перестройки актинового цитоскелета тесно связаны с функционированием клетки. Возможность какой-либо (качественной или количественной) характеристики изменений актинового цитоскелета позволяет подтверждать или опровергать гипотезы в ходе исследований, а также делать новые предположения. Количественная характеристика помогает объективно и непредвзято сравнивать актиновые структуры в различных экспериментах, выявляя воздействия биологических, химических и физических стимулов. В настоящее время для численной оценки актиновых структур клетки существует несколько доступных и легко реализуемых подходов с помощью бесплатного программного продукта ImageJ. В представленном обзоре обобщены методы анализа изображений внутриклеточных структур актина, меченных фаллоидином, с помощью ImageJ. Рассмотренные методы позволяют получать количественную характеристику организации актиновых структур для дальнейшей оценки и сравнения результатов экспериментов.