MiR-155-5p-mediated increase in p53 content induced by dacarbazine in melanoma cells

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Онкологические заболевания лидируют в мире по уровню смертности населения. Согласно данным международного агентства по изучению рака (the International Agency for Research on Cancer), на конец 2020 года было зарегистрировано 19,3 млн новых случаев онкологических заболеваний. Меланома кожи является злокачественным новообразованием с агрессивным течением. За последние 40 лет каждый год отмечается тенденция к приросту заболеваемости [1]. Высокие показатели смертности при данном заболевании связаны с развитием раннего метастазирования и высокой терапевтической резистентностью к противоопухолевым препаратам. Для контроля над прогрессированием заболевания актуален поиск прогностических маркёров, совершенствование терапии, направленной на элиминацию опухолевых клеток [2]. Одним из возможных прогностических факторов могут выступать микроРНК — малые некодирующие РНК. Известно, что микроРНК легко транспортируются экстраклеточными везикулами от опухолевых клеток к клеткам микроокружения, другим опухолевым клеткам. МикроРНК miR-155-5p участвует в регуляции трансляции опухолевых белков, регулирует редокс-зависимые факторы опухолевого микроокружения [3]. Белок р53 является опухолевым супрессором, выполняющим многочисленные функции — индукцию апоптоза, репарацию повреждённой ДНК и остановку клеточного цикла, направленные на ингибирование процессов онкогенеза [4]. Индукция состояния старения клеток при воздействии повреждающих факторов осуществляется благодаря секреторному фенотипу, ассоциированному со старением (senescence associated secretory phenotype, SASP), который формируется под влиянием белка p53 и представляет высвобождение провоспалительных цитокинов, регуляторов межклеточного матрикса [5]. Таким образом, стареющие клетки представляют собой клетки, образующиеся в результате «ареста» клеточного цикла в фазе G₀/G₁, вызванного повреждением, например, воздействием химиотерапевтическими препаратами [6]. Стареющие клетки характеризуются длительной и, как правило, необратимой остановкой клеточного цикла. Белок Ki-67 является хорошо известным маркёром клеточной пролиферации [7]. Накопление Ki-67 происходит только во время фаз G₁, S, G₂ и M, тогда как в фазу G₀ клеточного цикла он деградирует, что позволяет использовать Ki-67 в качестве маркёра G₀-положительных клеток [8].

Цель исследования — определить механизмы реализации неапоптотических функций белка p53 при воздействии цитостатическим агентом дакарбазином на клетки меланомы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные линии и условия культивирования

В исследовании использовали клеточные линии меланомы кожи человека BRO, полученные в НИИ клинической иммунологии (Новосибирск, Россия), и SK-MEL-2 (ATCC® HTB-68™). Клетки меланомы кожи культивировали в среде RPMI-1640 (НПП «ПанЭко», Россия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, Австрия), 1% антибиотик/антимикотик (Thermo Fisher Scientific, Нидерланды) при 37 °С и 5% CO₂ в инкубаторе (Sanyo Electric Co., Япония).

Определение доли G₀-положительных клеток

Для определения содержания клеток в фазе G₀ клеточного цикла было выполнено иммуноцитохимическое исследование с маркёром клеточной пролиферации Ki-67. Клетки культивировали в 24-луночных планшетах и обрабатывали дакарбазином в концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) в течение 72 ч при 37 °С. IC50 была определена с помощью МТТ-теста, что описано нами ранее [9]. Через 72 ч клетки промывали фосфатно-солевым раствором (PBS) (Helicon, Россия), помещали в свежую среду без цитостатика и инкубировали ещё 48 ч. Затем клетки ещё раз промывали PBS, фиксировали 10% формалином и пермеабилизировали 0,5% раствором Triton X100 (Biotechnik, Германия). После чего клетки инкубировали с первичными кроличьими моноклональными антителами к Ki-67 человека (ab15580; Abcam, США) в концентрации 1:100 с 10% FBS (HyClone, Австрия) при 4 °С в течение ночи. В качестве вторичных антител использовали козьи антикроличьи антитела Alexa Fluor 488 IgG (H+L) (Thermo Fisher Scientific, США) в разведении 1:200 в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Ядра контрастировали 1 мкг/мл DAPI (AppliChem, Германия) в течение 15 мин. Клетки подсчитывали по меньшей мере в 10 полях зрения с использованием станции визуализации клеток Floid (Thermo Fisher Scientific, США). Ядра пролиферирующих клеток окрашивались в зелёный и синий цвета, тогда как ядра непролиферирующих живых клеток окрашивались только в синий цвет.

Иммуноцитохимическое исследование экспрессии p53

Определение уровня экспрессии белка p53 проводилось иммуноцитохимическим методом. После инкубации с дакарбазином клетки фиксировали 10% формалином и пермеабилизировали 0,5% раствором Triton X100. В качестве первичных антител были использованы кроличьи Anti-p53 антитела (ab131442; Abcam, США) в концентрации 1:100 с 10% PBS при 4 °С в течение ночи. В качестве вторичных антител использовали козьи антикроличьи антитела Alexa Fluor 488 IgG (H+L) в разведении 1:200 в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Ядра контрастировали 1 мкг/мл DAPI в течение 15 мин. Оценку флуоресценции производили с помощью системы визуализации Floid Cell Imaging Station (Thermo Fisher Scientific, США) с применением полуколичественного метода оценки.

Биоинформатический анализ

Для определения регуляторов экспрессии p53 использовали следующие базы данных: MiRDB5.0 (http://mirdb.org/MIRDB), TargetScan7.1 (http://www.targetscan.org), miRWalk 2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de).

Определение экспрессии miR-155-5p

Для определения уровня экспрессии miR-155-5p был использован метод ПЦР в режиме реального времени. Выделение экзосом выполняли с помощью набора Total Exosome Isolation Reagent (Thermo Fisher Scientific, США). Концентрацию микроРНК измеряли на флуориметре Qubit® 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Сингапур) с использованием набора для анализа микроРНК Qubit microRNA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, США). Обратную транскрипцию проводили с использованием специфических 5X праймеров из набора TaqMan MicroRNA Assay (кат. №. 4427975; Thermo Fisher Scientific, США) и 5X буфера, обратной транскриптазы из набора MMLV RT kit («Евроген», Россия) и экзосомальной микроРНК. Полученную кДНК добавляли в ПЦР-коктейль, содержащий реакционную смесь 2.5X RT qPCR с красителем ROX («Синтол», Россия), специфические праймеры 20X и деионизированную воду. В качестве эндогенного контроля использовали U6 snRNA (кат. №. 4427975, Thermo Fisher Scientific, США). Реакцию RT qPCR проводили методом ПЦР в режиме реального времени с помощью системы StepOne™ (Thermo Fisher Scientific, Сингапур) с использованием следующего протокола циклирования температуры: 50 °C в течение 2 мин, 95 °C в течение 10 мин, затем 40 циклов при 95 °C в течение 15 с и 0 °C в течение 1 мин. Данные проанализированы методом ΔCt.

Определение концентрации экзосом методом динамического светорассеяния

Вычисление размера наночастиц проводили методом динамического светорассеяния. Интенсивность динамического светорассеяния определяли с помощью анализатора размера частиц и дзета-потенциала Zetasizer Nano ZC (Malvern Panalytical, Великобритания) за четыре повтора длительностью по 60 с каждый.

Методы статистического анализа данных

Статистическую обработку и анализ данных осуществляли с помощью пакета программного обеспечения Statistica 7 (StatSoft, США). При сравнении парных независимых выборок использовали непараметрический критерий U-тест Манна–Уитни, при p ≤0,05 результаты считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ

По результатам иммуноцитохимического исследования с маркером клеточной пролиферации Ki-67 и DAPI (рис. 1) было выявлено увеличение доли G₀-положительных (Ki-67 негативных) клеток под воздействием цитостатического препарата дакарбазин в 8,8 раза в клеточной линии BRO и в 2,5 раза — в клеточной линии SK-MEL-2.

 

Рис. 1. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами Ki-67 и DAPI. * статистически значимые различия в клетках, подвергнутых воздействию дакарбазина, и в контроле (р ≤0,05). / Fig. 1. Immunocytochemical visualization with anti-Ki-67 antibodies and DAPI. * significant as compared to control (р ≤0,05).

 

Опухолевый супрессор p53 экспресcировался в клеточных линиях BRO и SK-MEL-2 по данным иммуноцитохимического окрашивания с антителами p53 и DAPI (рис. 2), что свидетельствует об отсутствии мутаций в гене TP53, кодирующем белок p53. Под воздействием алкилирующего агента дакарбазина не наблюдалось статистически значимого изменения экспрессии p53 в клетках меланомы BRO. В клеточной линии SK-MEL-2 уровень белка p53 увеличивался на 12,5% (р=0,049), что свидетельствует о повышении экспрессии данного белка.

 

Рис. 2. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами p53 и DAPI. * статистически значимые различия между клетками, подвергнутыми воздействию дакарбазина, и контролем (р ≤0,05). / Fig. 2. Immunocytochemical visualization with anti-p53 antibodies and DAPI. * significant as compared to control (р ≤0,05).

 

Эффективность выделения экзосом из культуральной среды была подтверждена на основе метода динамического светорассеяния (рис. 3). Среднее значение дзета-потенциала составило 153,2±54,6 нм; индекс полидисперсности — 0,402.

 

Рис. 3. Распределение диаметра частиц по интенсивности динамического светорассеяния. / Fig. 3. Microvesicles distribution in accordance to intensity of dynamic light scattering.

 

По результатам биоинформатического анализа p53 является геном-мишенью микроРНК miR-155-5p. Под воздействием дакарбазином уровень miR-155-5p в экзосомах клеточной линии BRO оставался без изменений по отношению к контролю. В экзосомах клеточной линии SK-MEL-2 уровень онко-микроРНК miR-155-5p снижался на 2,5% (р=0,049) (рис. 4).

 

Рис. 4. Уровень экспрессии miR-155-5p по результатам ПЦР в реальном времени. * статистически значимые различия между клетками, подвергнутыми воздействию дакарбазина, и контролем (р ≤0,05). / Fig. 4. miR-155-5p expression estimated by qPCR real-time. * significant as compared to control (р ≤0,05).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Алкилирующий агент с цитостатическим действием дакарбазин увеличивает долю клеток, находящихся в G0-фазе клеточного цикла. Онко-микроРНК miR-155-5p экспрессировалась в экзосомах двух исследуемых клеточных линий BRO и SK-MEL-2 меланомы кожи, что подтверждает в целом её наличие в экзосомах опухолевых клеток. Изменения уровня экспрессии p53 были противоположны изменениям экспрессии микроРНК miR-155-5p, что косвенно свидетельствует о функциональной связи этих молекул. Таким образом, отсутствие изменения экспрессии p53 в клетках меланомы линии BRO может быть связано с отсутствием изменения уровня miR-155-5p в этих клетках. В клеточной линии BRO не наблюдалось изменений экспрессии онкосупрессора p53 при увеличенном проценте G₀-положительных клеток, что может быть связано с активацией других механизмов ареста клеточного цикла в фазе G₀/G₁.

Резюме основного результата исследования

Установлено противоопухолевое действие алкилирующего цитостатического агента дакарбазина на клетки меланомы линии SK-MEL-2, что выражается в увеличении экспрессии опухолевого супрессора p53. Под воздействием дакарбазина в клетках меланомы SK-MEL-2 также происходит снижение экспрессии микроРНК miR-155-5p в экзосомах, геном-мишенью которой является p53. Таким образом, в клетках меланомы SK-MEL-2 под действием цитостатического препарата происходит снижение активации онкогенеза с формированием фенотипа стареющих клеток за счёт miR-155-опосредуемого увеличения экспрессии опухолевого супрессора p53.

Обсуждение основного результата исследования

Цитостатический препарат дакарбазин оказывал различное действие на клеточные линии меланомы кожи BRO и SK-MEL-2. Данные результаты можно связать с феноменом клеточной гетерогенности опухоли. Активация синтеза экзосомальной микроРНК говорит об усиленной секреторной активности клеток после повышения в них доли G₀-положительных клеток, характерной для SASP-фенотипа опухоли. Инициация стареющего фенотипа происходит в результате ингибирования онко-микроРНК miR-155-5p. Так, в клетках меланомы SK-MEL-2 под действием дакарбазина происходит снижение активации онкогенеза и формирование фенотипа стареющих клеток за счёт miR-155-опосредуемого увеличения экспрессии опухолевого супрессора p53. Небольшой процент увеличения экспрессии p53 может свидетельствовать о том, что клеточная линия BRO имеет другие, более сложные механизмы защиты от воздействия противоопухолевого препарата и более прогрессивное течение заболевания, которое требует дальнейшего детального изучения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявлено разнородное влияние цитостатического агента дакарбазина на фенотип различных клеточных линий меланомы кожи. Для клеточной линии SK-MEL-2 дакарбазин служит активатором секреторного типа, ассоциированного со старением, путём ингибирования экзосомальной выработки miR-155-5p, что активирует онкосупрессор p53. Активация экспрессии белка p53 с формированием SASP-фенотипа может способствовать снижению развития опухолевого роста. При этом на клеточную линию BRO дакарбазин не оказывал данных изменений. В связи с этим имеется необходимость более персонифицированно подходить к терапии злокачественных новообразований.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 19-15-00110 от 23.04.2019).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Д.А. Дашкова — проведение экспериментальной работы, составление черновика рукописи. А.Р. Есимбекова — проведение экспериментальной работы, статистическая обработка результатов исследования. К.В. Котова — редактирование статьи, Т.Г. Рукша — разработка концепции и анализ научной работы, критический пересмотр с внесением ценного интеллектуального содержания, написание и редактирование статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. The research was carried out with the financial support of the Russian Science Foundation (project № 19-15-00110 dated 23.04.2019).

Conflict of interests. The authors declare the absence of obvious and potential conflicts of interest related to the publication of this article.

Authors contribution. D.A. Dashkova — conducting experimental work, drafting a manuscript. A.R. Esimbekova — conducting experimental work, statistical processing of research results. K.V. Kotova — editing the article, T.G. Ruksha — concept development and analysis of scientific work, critical revision with the introduction of valuable intellectual content, writing and editing the article.

About the authors

Daria A. Dashkova

Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: dashkova_dasha2001@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-4104-5785
Russian Federation, 1 Partizana Zheleznyaka street, 660022 Krasnoyarsk

Aleksandra R. Esimbekova

Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: aleksandra.esimbekova.96@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-6363-5941
SPIN-code: 4261-2987

MD

Russian Federation, 1 Partizana Zheleznyaka street, 660022 Krasnoyarsk

Kseniya V. Kotova

Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Email: ksuhry@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-9868-5017

MD

Russian Federation, 1 Partizana Zheleznyaka street, 660022 Krasnoyarsk

Tatiana G. Ruksha

Prof. V.F. Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University

Author for correspondence.
Email: tatyana_ruksha@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8142-4283
SPIN-code: 5412-2148

MD, Dr. Sci. (Med.)

Russian Federation, 1 Partizana Zheleznyaka street, 660022 Krasnoyarsk

References

Supplementary files