Background: Cellular senescence is a stress response, triggered by various stimuli such as chemotherapy treatment and causes G0/G1 cell cycle arrest followed by the production of a senescence associated secretory phenotype (SASP). p53 considered to be a modulator of these events although the precise mechanisms of it remains not clear. Aims: To determine the non-apoptotic functions of the p53 protein - the formation of the SASP phenotype of melanoma cells under the treatment of the cytostatic agent dacarbazine. Materials and methods: The study was conducted on BRO and SK-MEL-2 skin melanoma cell lines. Melanoma cells were were treated by cytostatic agent dacarbazine. Then immunocytochemical study was performed to determine the proportion of G0-positive cells and the expression of the tumor suppressor protein p53. A bioinformatic analysis was accomplished to identify for p53 regulators with determining of miR-155-5p levels in exosomes released by dacarbazine-treated melanoma cells. Results: The cytostatic drug dacarbazine increases the proportion of cells residing in the G0 phase of the cell cycle. Onco-microRNA miR-155-5p was expressed in the exosomes of the two studied cell lines BRO and SK-MEL-2 of skin melanoma. Changes in the expression level of p53 correlate with changes in miR-155-5p microRNA expression. The absence of changes in p53 expression in BRO melanoma cells may be due to the absence of changes in miR-155-5p expression levels. In the BRO cell line, no changes in the expression of the oncosuppressor p53 were observed with an increased percentage of G0-positive cells, which may be associated with the activation of other mechanisms of cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Conclusions: Heterogeneous effect of the cytostatic agent dacarbazine on melanoma cells was revealed. For the SK-MEL-2 cell line, dacarbazine induces the release of senescence associated secretory phenotype by inhibiting exosomal production of miR-155-5p, which activates the p53 oncosuppressor, which was not observed in the BRO line. In this regard, there is a need for a more personalized approach to the treatment of malignant neoplasms.

Abstract

Background: Cellular senescence is a stress response, triggered by various stimuli such as chemotherapy treatment and causes G0/G1 cell cycle arrest followed by the production of a senescence associated secretory phenotype (SASP). p53 considered to be a modulator of these events although the precise  mechanisms of it remains not clear.

Aims: To determine the non-apoptotic functions of the p53 protein - the formation of the SASP phenotype of melanoma cells under the treatment of the cytostatic agent dacarbazine.

Materials and methods:  The study was conducted on BRO and SK-MEL-2 skin melanoma cell lines. Melanoma cells were were treated by cytostatic agent dacarbazine. Then immunocytochemical study was performed to determine the proportion of G0-positive cells and the expression of the tumor suppressor protein p53. A bioinformatic analysis was accomplished to identify for p53 regulators with determining of miR-155-5p levels in exosomes released by dacarbazine-treated melanoma cells.

Results: The cytostatic drug dacarbazine increases the proportion of cells residing in the G0 phase of the cell cycle. Onco-microRNA miR-155-5p was expressed in the exosomes of the two studied cell lines BRO and SK-MEL-2 of skin melanoma. Changes in the expression level of p53 correlate with changes in miR-155-5p microRNA expression. The absence of changes in p53 expression in BRO melanoma cells may be due to the absence of changes in miR-155-5p expression levels. In the BRO cell line, no changes in the expression of the oncosuppressor p53 were observed with an increased percentage of G0-positive cells, which may be associated with the activation of other mechanisms of cell cycle arrest in the G0/G1 phase.

Conclusions: Heterogeneous effect of the cytostatic agent dacarbazine on melanoma cells was revealed. For the SK-MEL-2 cell line, dacarbazine induces the release of senescence associated secretory phenotype by inhibiting exosomal production of miR-155-5p, which activates the p53 oncosuppressor, which was not observed in the BRO line. In this regard, there is a need for a more personalized approach to the treatment of malignant neoplasms.

Full Text

Вступление

Онкологические заболевания входят в число лидеров по всему миру по уровню смертности населения. Согласно данным международного агентства по изучению рака (the International Agency for Research on Cancer), на конец 2020 г. было зарегистрировано 19,3 миллиона новых случаев заболеваемости онкологическими заболеваниями. Меланома кожи является злокачественным новообразованием с агрессивным течением. За последние 40 лет каждый год отмечается тенденция к приросту заболеваемости [1]. Высокие показатели смертности при данном заболевании связаны с развитием раннего метастазирования и высокой терапевтической резистентностью к противоопухолевым препаратам. Для контроля над прогрессией заболевания сохраняется актуальным поиск прогностических маркеров, совершенствование терапии, направленной на элиминацию опухолевых клеток [2].  Одним из возможных прогностических факторов могут выступать микроРНК – малые некодирующие РНК. Известно, что микроРНК легко транспортируются экстраклеточными везикулами от опухолевых клеток к клеткам микроокружения, другим опухолевым клеткам. МикроРНК miR-155-5p участвует в регуляции трансляции опухолевых белков, регулирует редокс-зависимые факторы опухолевого микроокружения [3]. Белок р53 является опухолевым супрессором, выполняющим многочисленные функции – индукция апоптоза, репарация повреждённой ДНК и остановка клеточного цикла, направленные на ингибирование процессов онкогенеза [4]. Индукция состояния старения клеток при воздействии повреждающих факторов осуществляется благодаря секреторному фенотипу, ассоцицированному со старением (SASP), который формируется под влиянием белка p53 и представляет высвобождение провоспалительных цитокинов, регуляторов межклеточного матрикса [5]. Таким образом, стареющие клетки представляют собой клетки, образующиеся в результате ареста клеточного цикла в фазе G0/G1, вызванного повреждением, например, воздействием химиотерапевтическими препаратами [6]. Стареющие клетки характеризуются длительной и, как правило, необратимой остановкой клеточного цикла. Белок Ki-67 является хорошо известным маркером клеточной пролиферации [7]. Накопление Ki-67 происходит только во время фаз G1, S, G2 и M, тогда как в фазу G0 клеточного цикла он деградирует, что позволяет использовать Ki-67 в качестве маркера G0-положительных клеток [8].

Цель исследования: Определить механизмы реализации неапоптотических функций белка p53 при воздействии цитостатическим агентом дакарбазином на клетки меланомы.

Методы

Клеточные линии и условия культивирования

В исследовании использовали клеточные линии меланомы кожи человека BRO, полученная от НИИ клинической иммунологии (Новосибирск, Россия) и SK-MEL-2 (ATCC® HTB-68™). Клетки меланомы кожи культивировали в среде RPMI-1640 (ООО НПП ПанЭко, Москва, Россия), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (HyClone, GmbH, Паршинг, Австрия), 1% антибиотик/антимикотик (Gibco Life Technologies, Гранд-Айланд, Нидерланды) при 37°С и 5% CO2 в инкубаторе (Sanyo Electric Co. Ltd., Япония).

Определение доли G0-положительных клеток

Для определения содержания клеток в фазе G0 клеточного цикла было выполнено иммуноцитохимическое исследование с маркером клеточной пролиферации Ki-67. Клетки культивировали в 24-луночных планшетах и обрабатывали дакарбазином в концентрации IC50 в течение 72 ч при 37°С. Концентарция полумаксмального ингибирования (IC50) была определена методом МТТ, описанным нами ранее [9]. Через 72 часа клетки промывали фосфатно-солевым раствором (PBS) (Helicon, Москва, Россия), помещали в свежую среду без цитостатика и инкубировали еще 48 часов. Затем клетки промывали PBS, фиксировали 10% формалином и пермеабилизировали 0,5% раствором Triton X100 (Biotechnik GmbH, Гайберг, Германия). После чего клетки инкубировали с первичными кроличьими моноклональными антителами к Ki67 человека (ab15580; Abcam, Кембридж, MA, США) в концентрации 1:100 с 10% FBS (HyClone, GmbH, Паршинг, Австрия) при 4°С в течение ночи. В качестве вторичных антител использовали козьи антикроличьи антитела Alexa Fluor 488 IgG (H+L) (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Юджин, США) в разведении 1:200 в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Ядра контрастировали 1 мкг/мл DAPI (AppliChem GmbH, Дармштадт, Германия) в течение 15 мин. Клетки подсчитывали, по меньшей мере, в 10 полях зрения с использованием станции визуализации клеток Floid (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Ядра пролиферирующих клеток окрашивались в зеленый и синий цвета, тогда как ядра непролиферирующих живых клеток окрашивались только в синий цвет.

Иммуноцитохимическое исследование экспрессии p53

Определение уровня экспрессии белка p53 проводилось иммуноцитохимическим методом. После инкубации с дакарбазином, клетки фиксировали 10% формалином и пермеабилизировали 0,5% раствором Triton X100. В качестве первичных антител были использованы кроличьи Anti-p53 антитела (ab131442; Abcam, США) в концентрации 1:100 с 10% FBS при 4 °С в течение ночи. В качестве вторичных антител использовали козьи антикроличьи антитела Alexa Fluor 488 IgG (H+L) в разведении 1:200 в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте. Ядра контрастировали 1 мкг/мл DAPI в течение 15 мин. Оценка флуоресценции производилась с помощью системы визуализации Floid Cell Imaging Station с применением полуколичественного метода оценки.

 

Биоинформатический анализ

Для определения регуляторов экспрессии p53 использовали следующие базы данных: MiRDB5.0 (http://mirdb.org/MIRDB), TargetScan7.1 (http://www.targetscan.org), miRWalk 2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de).

Определение экспрессии miR-155-5p

Для определения уровня экспрессии miR-155-5p был использован метод ПЦР в реальном времени. Выделение экзосом проводилось с помощью набора Total Exosome Isolation Reagent (Invitrogen, MA, USA). Концентрацию микроРНК измеряли на флуориметре Qubit® 2.0 (Invitrogen by Life Technologies, Сингапур, Сингапур) с использованием набора для анализа микроРНК Qubit microRNA Assay Kit (Юджин, Орегон, США). Обратную транскрипцию проводили с использованием специфических 5X праймеров из набора microRNA TaqMan (кат.№. 4427975; Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc) и 5X буфера, обратной транскриптазы из набора MMLVRTkit (Евроген, Москва, Россия) и экзосомальной микроРНК. Полученную кДНК добавляли в ПЦР-коктейль, содержащий реакционную смеси 2.5X RT qPCR с красителем ROX (Синтол, Москва, Россия), специфические праймеры 20X и деионизированную воду. В качестве эндогенного контроля использовали U6 snRNA (кат.№. 4427975, Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc). Реакцию RT qPCR проводили на системе ПЦР в реальном времени StepOne™ (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc) с использованием следующего протокола циклирования температуры: 50 °C в течение 2 минут, 95 °C в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95 °C в течение 15 секунд и 0 °C в течение 1 минуты. Данные были проанализированы с использованием метода ΔCt.

Определение концентрации экзосом методом динамического светорассеяния

Вычисление размера наночастиц производилось методом динамического светорассеяния. Интенсивность динамического светорассеяния определялась с помощью анализатора размера частиц и дзета-потенциала Zetasizer Nano (Malvern Instruments Ltd., Великобритания) за четыре повтора длительностью по 60 с каждый.

  • Статистический анализ

Методы статистического анализа данных: Статистическая обработка и анализ данных осуществляли с помощью пакета программного обеспечения Statistica 7 (StatSoft, Россия). При сравнении парных независимых выборок использовали непараметрический критерий U-тест Манна-Уитни, при p ˂ 0,05 результаты считали статистически значимыми.

 

Результаты

По результатам иммуноцитохимического исследования с маркером клеточной пролиферации Ki-67 и DAPI (Рис. 1) было выявлено увеличение доли G0-положительных (Ki-67 негативных) клеток под воздействием цитостатического препарата дакарбазин в 8,8 раз в клеточной линии BRO и в 2,5 раза в клеточной линии SK-MEL-2.

Рис. 1. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами Ki-67 и DAPI. * - статистически значимые различия в клетках, подвергнутых воздействию дакарбазина и в контроле (р≤0,05).

 

Опухолевый супрессор p53 экспресcировался в клеточных линиях BRO и SK-MEL-2 по данным иммуноцитохимического окрашивания с антителами p53 и DAPI (Рис. 2), что свидетельствует об отсутствии мутаций в гене TP53, кодирующем белок p53. Под воздействием алкилирующего агента дакарбазин не наблюдалось достоверного изменения экспрессии p53 в клетках меланомы BRO. В клеточной линии SK-MEL-2 уровень белка p53 увеличивался на 12,5%, (р=0,049), что свидетельствует об повышении экспрессии данного белка.

Рис. 2. Иммуноцитохимическое окрашивание антителами p53 и DAPI. * - статистически значимые различия между клетками, подвернутыми воздействию дакарбазина и контролем (р≤0,05).

 

Эффективность выделения экзосом из культуральной среды была подтверждена на основе метода динамического светорассеяния (Рис. 3). Среднее значение дзета-потенциала составило 153,2 ± 54,6 нм; индекс полидисперсности 0,402.

Рис.3. Распределение размера частиц по интенсивности динамического светорассеяния.

 

По результатам  биоинформатического анализа p53 является геном-мишенью микроРНК miR-155. Под воздействием дакарбазина уровень miR-155-5p в экзосомах клеточной линии BRO оставался без изменений по отношению к контролю. В экзосомах клеточной линии SK-MEL-2 уровень онко-микроРНК miR-155-5p снижался на 2,5% (р=0,049 (Рис.4).

 

 

 

Рис.4. Уровень экспрессии miR-155-5p по результатам ПЦР в реальном времени.

* - статистически значимые различия в клетках, подвергнутых воздействию дакарбазина и контроле (р≤0,05).

 

Обсуждение

Алкилирующий агент с цитостатическим действием дакарбазин увеличивает долю клеток, находящихся в G0 фазе клеточного цикла. Онко-микроРНК miR-155-5p экспрессировалась в экзосомах двух исследуемых клеточных линиях BRO и SK-MEL-2 меланомы кожи, что подтверждает в целом ее наличие в экзосомах опухолевых клеток. Изменения уровня экспрессии p53 были противоположны изменениям экспрессии микроРНК miR-155-5p, что косвенно свидетельствует о функциональной связи этих молекул. Таким образом, отсутствие изменения экспрессии p53 в клетках меланомы линии BRO может быть связано с отсутствием изменения уровня miR-155-5p в этих клетках. В клеточной линии BRO не наблюдалось изменений экспрессии онкосупрессора p53 при увеличенном проценте G0-положительных клеток, что может быть связано с активацией других механизмов ареста клеточного цикла в фазе G0/G1.

  • Резюме основного результата исследования
  • Установлено противоопухолевое действие алкилирующего цитостатического агента дакарбазин на клетки меланомы линии SK-MEL-2, что выражается в увеличении экспрессии опухолевого супрессора Под воздействием дакарбазина в клетках меланомы SK-MEL-2  также происходит снижение экспрессии микроРНК miR-155-5p в экзосомах, геном-мишенью которой является p53. Таким образом, в клетках меланомы SK-MEL-2 под действием цитостатического препарата происходит снижение активации онкогенеза с формированием фенотипа стареющих клеток за счет miR-155-опосроедуемого увеличения экспрессии опухолевого супрессора p53.
    • Обсуждение основного результата исследования

Цитостатический препарат дакарбазин оказывал различное действие на клеточные линии меланомы кожи BRO и SK-MEL-2. Данные результаты можно связать с феноменом клеточной гетерогенности опухоли. Активация синтеза экзосомальной микроРНК говорит об усиленной секреторной активности клеток после повышения в них доли G0-положительных клеток, характерной для SASP-фенотипа опухоли. Инициация стареющего фенотипа происходит в результате ингибирования онко-микроРНК miR-155-5p. Так, в клетках меланомы SK-MEL-2 под действием дакарбазина происходит снижение активации онкогенеза и формирование фенотипа стареющих клеток за счет miR-155-опосроедуемого увеличения экспрессии опухолевого супрессора p53. Небольшой процент увеличения экспрессии p53 может свидетельствовать о том, что клеточная линия BRO имеет другие, более сложные механизмы защиты от воздействия противоопухолевого препарата и более прогрессивное течение заболевания, которое требует дальнейшего детального изучения.

Таким образом, выявлено разнородное влияние цитостатического агента дакарбазин на фенотип различных клеточных линий меланомы кожи. Для клеточной линии SK-MEL-2 дакарбазин служит активатором секреторного типа, ассоциированного со старением, путем ингибирования экзосомальной выработки miR-155-5p, что активирует онкосупрессор p53. Активация экспрессии белка p53 с формированием SASP-фенотипа может способствовать снижению развития опухолевого роста. При этом на клеточную линию BRO дакарбазин не оказывал данных изменений. В связи с этим, имеется необходимость более персонифицировано подходить к терапии злокачественных новообразований.

×

About the authors

Tatiana Ruksha

Author for correspondence.
Email: tatyana_ruksha@mail.ru
Russian Federation

Datiya Dashkova

Email: dashkova_dasha2001@mail.ru

Alexandra Esimbekova

Email: aleksandra.esimbekova.96@mail.ru

Kseniya Kotova

Email: ksuhry@mail.ru

References

Supplementary files

There are no supplementary files to display.


Copyright (c) Eco-Vector



СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: № 014159 от 23.10.1995 г
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ЭЛ № ФС 77 - 80673 от 23.03.2021 г
.



This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies