Technology development of CDKN2A/ARF gene mutations detection, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 during acute myeloid leukemia

Abstract

Full Text

В настоящее время активно разрабатывается генетическая прогностическая стратификация острых миелоидных лейкозов (ОМЛ). Установлено, что ОМЛ представляют собой генетически гетерогенную группу заболеваний, молекулярные механизмы онкогенеза при которых отличаются многошаговостью и варьируют в широких пределах. Цель исследования - разработать диагностическую тест-систему для детекции мутаций генов CDKN2A/ ARF, FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53, WT1 методом прямого автоматического секвенирования. Материал и методы. Исследованы пробы периферической крови и костного мозга 119 больных ОМЛ. В исследуемой группе всем пациентам проведено цитогенетическое и/или молекулярно-генетическое (полимеразная цепная реакция — ПЦР) исследование. Выделение тотальной РНК из опухолевых клеток проводили методом сорбции на силикагелевом носителе с последующим проведением реакции обратной транскрипции для получения кДНК. Участки экзонов исследуемых генов клонировали методом ПЦР с последующим секвенированием на автоматическом генетическом анализаторе ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США) 34 тезисы конференции по прямой и обратной последовательностям согласно рекомендациям производителя. Сопоставление сегментов, выравнивание и сравнение последовательностей нуклеотидов и аминокислот проводили с использованием компьютерной программы MEGA, версия 3.1. Результаты и обсуждение. Праймеры, фланкирующие участки кДНК, соответствующие кодирующим последовательностям исследуемых генов, содержащих горячие точки прогностически значимых мутаций, разработаны с использованием депонированных в GenBank нуклеотидных последовательностей (см. таблицу). Праймеры, использованные для амплификации и секвенирования Название Последовательность FLT-ITD-F 5' TGT TCA GAC AAG TCT CCC AAC TGC 3' FLT-ITD-R 5' CAT CTT GAG TTC TGA CAT GAG TGC C 3' FLT-TK-F 5' AAG ATC TTC TTT GCT TTG CAT ATC A 3' FLT-TK-R 5' GGA ATG CCA GGG TAA GGA TT 3' KIT1-F 5' CCG AAG GAG GCA CTT ACA C 3' KIT1-R 5' GCA GGC TCC AAG TAG ATT CA 3' KIT2-F 5' CAA CCA AGG CCG ACA A 3' KIT2-R 5' ACT TAG AAT CGA CCG GCA TT 3' KIT1-SF 5' TCA ATG CTG CCA TAG 3' KIT2-SF 5' TGA CTC CCG CCA TCA 3' KN-F 5' GCGTCCCCTTGCCTGGAAAGATACC 3' KN-R 5' TGAGGGACCTTCCGCGGCATCTAT 3' KN-SF 5' ACAGGGTCGGAGGGGGCTCT 3' KN-SR 5' GCATCTATGCGGGCATGGTT 3' NPM1-F 5' AGGAAGCTGAAGAAAAAGCG 3' NPM1-R 5' GGACAGCCAGATATCAACTG 3' NPM1-S1 5' GGACAAGAATCCTTCAAGAA 3' NRAS-F 5' GTT CAT GGC GGT TCC 3' NRAS-R 5' GGC GTA TTT CTC TTA CCA GT 3' NRAS-S 5' CGG CTG TGG TCC TAA ATC TG 3' P53-F 5' AGT CAG ATC CTA GCG TCG AG 3' P53-R 5' TGG CGG GAG GTA GAC TG 3' P53-S1 5' ACA TTT TCA GAC CTA TGG AA 3' P53-S2 5' GCG CCA TGG CCA TCT ACA AG 3' P53-S3 5' ACC CTT TTT GGA CTT CAG GT 3' TET-F 5' AAC AAA CTG AAA ACG CAA GC 3' TET-R 5' GCC CAC GTC ATG AGA ACT AT 3' TET-S1R 5' CAG ATC CAT CGG CTG AGA 3' TET-S2F 5' CAG AAT ACC CAA TAT CCA 3' TET-S3F 5' TCC AAG GAG GCT TAC ACA 3' WT1-F 5' ACC CAG GCT GCA ATA AGA 3' WT1-R 5' AGG AGG AGT GGA GAG TCA GA 3' WT1-S 5' TAA GCT GTC CCA CTT ACA GA 3' Частота мутаций (в том числе синонимичных замен) исследуемых генов, определяемых с использованием разработанной тест-системы, оказалась следующей: CDKN2A/ARF - 0%, FLT3 - 23,6%, KIT - 33,3%, NPM1 - 15,2%, NRAS - 11%, TET2 - 20%, TP53 - 11%, WT1 - 4,5%. Наиболее частыми типами мутаций во всех исследуемых генах, за исключением NPM1 , были однонуклеотидные замены. При этом наибольшая частота синонимичных, т. е. не приводящих к изменению аминокислотного остатка в кодируемом белке, замен отмечалась в кодирующих последовательностях генов FLT3 и KIT. Помимо них, в гене FLT3 со значимой частотой определялись тандемные дупликации, а в NPM1 преобладающим типом аномалий были тетрануклеотидные инсерции экзона 12. Кроме того, в 80,5% проб, обследованных на мутации экзонов 4—11 ТР53, выявлялась несинонимичная замена C215G, являющаяся полиморфным аллельным вариантом гена. Заключение. Таким образом, разработанная тест-система позволяет эффективно определять мутации генов FLT3, KIT, NPM1, NRAS, TET2, TP53 и WT1 при ге-нотипировании ОМЛ методом прямого автоматического секвенирования.