Mass spectrometric analysis of SERUM im patients with squamous cell carcinoma of head and neck

Abstract

Full Text

Цель исследования — провести масс-спектрометрический анализ сыворотки крови больных с плоскоклеточной карциномой головы и шеи (ПКГШ) в сравнении с группой здоровых лиц для выявления потенциальных маркеров прогноза заболевания. Материал и методы. Материалом для исследования явилась сыворотка крови 10 здоровых (контрольная группа) и 20 больных ПКГШ (10 человек Т3—4N1—2M0, 10 человек T1—2N0M0), до лечения. Средний возраст больных 53 ± 5,3 года. Про-теазную активность сыворотки крови ингибировали с помощью набора Protease Inhibitor Cocktail ("Sigma", США). Очищенная от альбумина и IgG сыворотка крови с помощью колонок Albumin & IgG Depletion SpinTrap ("GE Healthcare", США) подвергалась денатурирующему гель-электрофорезу в градиентном ПААГ (6—15%). Для обнаружения белковых полос в геле использовали окраску Coomassie R-250. Интересующие участки ПААГ-геля вырезали и подвергали протеолизу по методу J. Rosenfeld. Для масс-спектрометрического анализа смесь пептидов элюировали с микроколонок C18 ZipTips ("Millipore Corporation", MA) на мишень приборной пластины масс-спектрометра UltraFlexIII TOF/TOF ("Bruker", США). Идентификацию полученных спектров проводили с использованием алгоритма Mascot, Biotools 3.2 ("BrukerDaltonics", Германия). Результаты и обсуждение. Для масс-спектрометрического анализа выбирались белковые полосы в гелях, имеющие различия в интенсивности окраски в группах здоровых и больных ПКГШ с метастазами и без метастазов. Сравнение элек-трофореграмм сыворотки крови здоровых и больных ПКГШ без метастазов выявило различия в интенсивности окрашивания белковых полос массой 10, 25, 50, 75 кД. Интенсивность окрашивания белковых полос массой 10, 12, 15, 18, 40, 100 кД была выше в группе больных с метастазами, чем в группах здоровых и пациентов ПКГШ без метастазов. Масс-спектрометрический анализ белков из выделенных бендов идентифицировал аполипопротеины А1 и А2 (Аро1, Аро2), транс-тиретин, серотрасферрин, протеинфосфатазу 1В, комплемент С3, субъединицы гемоглобина а и ß, матриксный экстрацеллюлярный фосфогликопро-теин (MEPE), сывороточный амилоид А (САА), а2-макроглобулин, динеина тяжелую цепь 3, аде-нилилциклазаассоциированный белок-1 (CAP1), миозин-15 (см. таблицу). 40 тезисы конференции Масс-спектрометрический анализ белков Идентифицированный белок ID Ыолекулярная масса Score Sequence Coverag, % Apolipoprotein A-I APOA1 HUMAN 30 759 200 68 Apolipoprotein A-II APOA2 HUMAN 11 282 81 58 Hemoglobin subunit alpha HBA HUMAN 15 305 68 49 Hemoglobin subunit beta HBB HUMAN 16 102 149 85 Serum amyloid A protein SAA HUMAN 13 524 89 71 Adenylyl cyclase-associated protein 1 CAP1 HUMAN 51 823 73 30 Alpha-2macroglobulin A2MG HUMAN 163 189 70 20 Ashwin ASHWN HUMAN 25 843 68 36 Matrix extracellular phosphoglycoprotein MEPE HUMAN 58 384 60 26 Serotransferrin TRFE HUMAN 79 280 60 32 Protein phosphatase 1B PPM1B HUMAN 52 609 63 39 Complement C3 CO3 HUMAN 188569 64 26 Увеличение уровня Аро1, Аро2, транстиретина, серотрансферрина, САА и комплемента С3 при опухолях различной локализации подтверждается данными литературы и отражает реакцию организма на развитие патологического процесса. Транстиретин (преальбумин) — белок острой фазы, относящийся к фракции альбуминов, его основная функция транспорт тироксина и трийодтиронина (Северин Е.С., 2003). При различных заболеваниях рассчитывается прогностический индекс воспаления и состояния питания (Лейдерман И.Н., 2012). По данным масс-спектрометрического анализа CAP1 входит в панель предполагаемых белков-маркеров для дифференциального анализа при раке полости рта (Thiel U. , 2011). САА известен как маркер повреждения ткани и воспаления, относится к белкам острой фазы и предлагается в комбинации с гаптоглобином и комплементом С3 для дифференциальной диагностики рака различных локализаций (Dowling P. , 2012]). Белок MEPE участвует в минерализации костей и является членом семейства белков SIBLING. SIBLING участвуют в модуляции адгезии клеток, в регуляции металлопротеи-наз ММП 2, 3, 9, что коррелирует с плохим прогнозом заболевания (Fisher L. , 2004). Высокая экспрессия МЕРЕ наблюдается в опухолях (чаще мезенхимального происхождения), вызывающих онкогенную остеомаляцию (Imanishi Y., 2012). Причастность белков SIBLING ко многим звеньям прогрессии опухолевого роста делает их потенциальными кандидатами в качестве эффективных биомаркеров. Известно, что протеинфосфатаза 1В (PPM1B, PP2CB) участвует в МАРК-киназном сигнальном пути регуляции многих клеточных процессов, включающих регуляцию пролиферации (TAK1^NFkB путь), транскрипции и апоп-тоза (WNT-сигнальный путь) (http://www.genome.jp). Белок Ashwin входит в состав тРНК-лигазного комплекса, участвующего в сплайсинге тРНК (Popow J., 2011). Заключение. Выявлены различия в электрофоретическом распределении белков сыворотки крови у больных ПКГШ в отличие от группы здоровых. Изменения в белковом спектре могут быть обусловлены появлением белков, свойственных как прогрессии ПКГШ, так и сопутствующим заболеваниям. В сывороточном протеоме больных ПКГШ представлены белки, участвующие в различных клеточных процессах, которые могут быть предложены для дальнейшего изучения в качестве потенциальных маркеров опухолевой прогрессии. Так как в настоящее время нет данных о характере изменения протеома во взаимосвязи с клинико-морфологическими характеристиками опухолевого процесса при ПКГШ, это направление исследований является одним их актуальных в онкопротеомике.