The indicators of the tumour proliferative activity and therapeutic responsiveness in adenocarcinoma in anal canal after complex treatment

Full Text

Рак анального канала - редкое злокачественное новообразование. На его долю приходится всего 1-6% злокачественных опухолей аноректальной зоны [1]. Морфологическая верификация диагноза рака ануса составляла 99,6% [2]. Прирост абсолютного числа заболевших составил 10,6% у мужчин и 9,4% у женщин, средний показатель 14,4 на 100 тыс. населения. В структуре заболеваемости, рак прямой кишки занимает 4-е ранговое место, в возрасте 40-54 года у мужчин данная нозология составляет 4,7%, в возрасте 55-69 лет - 5,5 и 4,9% соответственно у мужчин и женщин, в 70-84 лет составляет 6%. Заболеваемость в России раком прямой кишки в 2012 г. составляет 5,1% среди мужчин и 4,7% среди женщин. Средний возраст мужчин 40-54 года, женщин 55-69 лет. В структуре смертности рак прямой кишки занимает 5-е место. В группах с 40 до 54 лет и с 70 лет и старше показатель смертности составляет 5,4% среди мужчин и 6,4% среди женщин. Летальность больных обоего пола составила 12,9% [2]. Данная нозология характеризуется высокой склонностью к рецидивированию, плохим прогнозом заболевания. Рак анального канала - редкая онкологическая патология. По данным отделения проктологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, 4,8% от всех опухолей прямой кишки составляет плоскоклеточный рак. Из них 80-85% локализовано в анальном канале [3]. Частота встречаемости аденокарциномы составляет 0,1-4,0% от всех новообразований желудочнокишечного тракта; от 3 до 10% от злокачественных новообразований анального канала [4]. Следовательно, в 90% случаев аденокарцинома встречается в прямой кишке. После применения разработанного в РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН комбинированного лечения, включающего предоперационную химиотерапию, оперативное лечение и СВЧ-гипертермию достигнуто достоверное улучшение безрецидивной 5-лет- ней выживаемости до 44,3% больных раком прямой кишки [5]. Совокупность морфологических признаков, возникающих в опухоли под воздействием лечения, объединяется в термин «лечебный патоморфоз». Диагностика лечебного повреждения опухоли проводится в соответствии с критериями лучевого па- томорфоза, предложенными Г.А Лавниковой (1976) и J. Dworak (1997). Выделяют 4 степени лечебного патоморфоза, при которых учитываются показатели выраженности дистрофических изменений паренхиматозных элементов опухоли, их митотическая активность, наличие участков фиброза и некроза. Прогнозировать течение опухолевого заболевания возможно, используя маркер пролиферативной активности Ki-67. Многими авторами доказано, что он является универсальным независимым показателем прогнозирования рецидива, общей и без- рецидивной выживаемости [6, 7]. Имеются данные. указывающие на четкую корреляцию между Ki-67, стадией Т, снижением дифференцировки опухоли [1, 8, 9]. Он является антигеном в активно пролиферирующих клетках. Этот антиген определяется в G1- ранней S-, G2-стадии достигая максимума в фазе митоза [10]. Медиана индекса Ki-67, равная 50%, является критической прогностической точкой, позволяющей разделить больных с благоприятным и неблагоприятным течением и исходом заболевания [1]. Индекс Ki-67 отражает пролиферативную активность, является решающим фактором чувствительности к химиотерапии. По данным иностранных источников, при низких значениях Ki-67 эффективность лечения заключается в снижении курсов химиотерапии, при высоких - в выделении группы пациентов с чувствительностью к химиотерапии. Известно что при лимфоме высокий уровень Ki-67 приводит к дедифференцировке опухоли и увеличивает вероятность спонтанных мутаций, приводящих к неэффективности лечения. По данным других исследователей, высокая пролиферативная активность является благоприятным признаком ответа на проводимое лечение [11]. По мнению исследователей, положительный ответ на комплексное лечение наблюдается при высоком индексе пролиферативной активности, по мнению других авторов; при показателях индекса Ki-67 менее 40%. Высокая степень регрессии опухоли до лечения составила 16,7%, после лечения - 14,3% [12]. Относительно высокий уровень клеточной пролиферации Ki-67 увеличивает время удвоения опухолевой клетки [13]. Цель исследования - оценить экспрессию антигена Ki-67 и показатели лечебного патоморфоза в аденокарциномах анального канала, сравнить уровень Ki-67 ео степенью регрессии опухоли. Материал и методы Методом иммуногистохимии проводилось окрашивание парафиновых срезов ткани опухоли толщиной 3-5 мкм, готовились на микротоме (Leica, Германия), наносились на предметные стекла, обработанные поли L -лизином и подсушивались на нагревательном столике при температуре 37°С в течение 10 ч. После депарафинирования и обезвоживания срезов производилась демаскировка антигенных де- Степень инвазии опухоли при световой микроскопии Степень инвазии опухоли количество абс. % Подслизистый слой 1 3 Мышечная оболочка 5 15,5 Все слои стенки кишки 3 9,0 Стенка кишки, внутренний сфинктер 2 6,0 Жировая клетчатка 17 52,5 Прорастание в соседние органы (влагалище) 3 9 Всего. 33 100 терминант. Система детекции проводилась с использованием первичных антител, время инкубации 3040 мин. Для визуализации продуктов иммунной реакции был использован стрептовидин-биотиновый пероксидазный метод (DAKO, LSAB+ Kit, HRP), в качестве хромогенного субстрата применяли раствор диаминобензидина (Dako, Liquid DAB+), ядра докрашивали гематоксилином Майэра. Индекс пролиферации Ki-67 оценивали на 100 учтенных ядрах опухолевых клеток, имеющих ядерную локализацию в 5-10 репрезентативных полях зрения. Выражали в процентах с учетом количества окрашенных ядер. Пролиферативная активность опухоли расценивалась как низкая при индексe Ki-67 от 0-20%, и высокая - более 20%. Степень злокачественности определяли по A. Elizabeth, M. Montrogomery (2012). G1 принимали при обнаружении 2-х митозов в 10 полях зрения; индекс Ki-67 менее 2%; G2 от 2-20 митозов в 10 полях зрения, G3 митотический индекс более 20 в 10 полях зрения или Ki-67 более 20%. Огепень выраженности лечебного патоморфоза оценивалась в соответствии с критериями предложенными Г.А. Лавниковой (1976), J. Dworak (1997). Результаты и обсуждение Проведен анализ результатов исследования 33 пациентов с установленным гистологическим вариантом аденокарциномы в возрасте от 22 до 73 года, медиана возраста составила 58 лет, преобладали больные старше 50 лет. Из них 11 мужчин и 19 женщин, средний возраст пациентов составил 56,3 ± 1,9 года (р = 0,01), преобладали пациенты 50-60 лет (n = 13; 44,8%). В соответствии с TNM-классификацией злокачественных опухолей (6-е издание), преобладала стадия рТК . Около 2/3 больным при первичной биопсии установлен диагноз умереннодиффререн- цированной (61,5% наблюдений), низкодифференцированной (в 30% наблюдений) аденокарциномы. Проведено лечение с применением предоперационной неоадьювантной лучевой терапии РОД и суммарной дозы СОД 25 Гр, или в сочетании с вну- триполостной СВЧ гипертермией на 3,4 и 5-м сеансах предоперационной лучевой терапии с частотой электромагнитных колебаний 460 МГц в течение 60 мин при достижении температуры в опухоли 43,5-44°С (n = 33). Доза облучения подводится с учетом толерантности тканей. Лучевая терапия влияет Рис. 2. II степень лечебного патоморфоза. а - лечебные формы, десмопластическая реакция. Окраска гематоксилином и эозином. х200. б - индекс пролиферативной активности соответствует Ki-67 80%. х400. в - индекс пролиферативной активности Ki-67 соответствуют 15%. х200. Рис. 1. I степень лечебного патоморфоза. а - гибель отдельных клеток; апоптозные тельца. Окраска гематоксилином и эозином. х200. б - индекс пролиферативной активности Ki-67 соответствует 90%. х400. в - степень лечебного патоморфoза Ki-67 cоответствует 10%. х200. Степень лечебного патоморфоза коррелировала со степенью инвазии (coeff. corr. = +0,47) (р > 0,05). Между степенью злокачественности и показателем Ki-67 определялась слабая положительная корреляционная зависимость (coeff. corr. = -0,062). Уровень Ki-67 после лечения находился в отрикак на нормальные клетки так на патологические. Рис. 3. III степень лечебного патоморфоза. а - отдельные раковые комплексы с признаками дистрофии. Окраска гематоксилином и эозином. х100. б - индекс пролиферативной активности Ki-67 соответствует 90%. х400. в - индекс пролиферативной активности Ki-67 cоответствует 15%. х200. Оперативное вмешательство включало брюшнопромежностную экстирпацию (n = 17) и брюшноанальную резекцию (n = 14), один больной без оперативного лечения. При морфологической диагностике опухолей анального канала, уровень инвазии в стенку прямой кишки (Т), соответствовал патоморфологической категории Т3-Т4 в 73% наблюдений (n = 22) (см. таблицу). После проведения комплексного лечения в обеих группах не выявлено лечебного патоморфоза в 16,6% (n = 5); I степень регрессии опухоли - 30% (n = 9), II степень регрессии опухоли - 33,3% (n = 11), III степень регрессии - 16,6% (n = 6), IV степень регрессии - 3,3% (n = 2). При I степени лучевого патоморфоза определяется клеточный полиморфизм, дистрофия клетки, нарушение вызревания клетки (рис. 1). При II степени лучевого патоморфоза опухоли паренхима сохранена, видны дистрофические изменения клеток, появление полей некроза, лучевых гигантов, десмопластическая реакция стромы (рис. 2). При III степени лучевого патоморфоза, железы отсутствуют, структура опухоли изменена, определяются обширные поля некроза и фиброза, доля опухолевых клеток в паренхиме составляет до 5% (рис. 3). Выявлена взаимосвязь между максимальным размером опухоли и степенью инвазии опухоли (coeff. corr. = +0,58) (р < 0,05), площадью опухоли и степенью регрессии опухоли (coeff. corr. = -0,18). Степень лечебного патоморфоза Рис. 4. Распределение показателя индекса пролиферативной активности и лечебного патоморфоза. Выявлена отрицательная корреляция между показателем Ki-67 и степенью регрессии (coeff. corr. = -0,4, р < 0,05). 0 - без лечебного патоморфоза. цательной зависимости между степенью регрессии опухоли (coeff. corr. = -0,4) (p < 0,05) (рис. 4). По данным зарубежных авторов высокий Ki-67 определяется с увеличением степени инвазии опухоли [14]. В опухолях со значением Ki-67 более 55% и менее медианы статистическая достоверность между уровнем Ki 67 и наличием метастазов в лимфатических узлах увеличивается (р = 0,03), а также выявляется связь с наличием рецидива заболевания (р = 0,04). В группе пациентов с высокой пролиферативной активностью опухолей 5-летняя безрецидивная выживаемость значительно ниже [15]. Результаты 2013 г. доказали, что при инвазии Т2-Т4 экспрессия Ki-67 ниже в сравнении с ранним раком [16]. Значение показателя Ki-67 достоверно зависит от степени регрессии опухоли. При высокой пролиферативной активности (Ki-67 > 20%) определялась низкая степень регрессии опухоли (I-II степень лечебного патоморфоза) (n = 26). Среднее значение показателя Ki-67 при высокой пролиферативной активности составляет 62,5 ± 12, при Ki-67 < 20 - 10,9 ± 2,05 (n = 7). По данным исследования, среднее значение Ki-67 составляло 30,4 ± 5,7 в группе больных с инвазивным раком (р < 0,05). Соотношение пролиферирующих и потенциально пролиферирующих опухолевых клеток составляет 1/3. Большая часть исследованных опухолевых клеток являются потенциально пролиферирующими, способными активно участвовать в стадиях канцерогенеза. Индекс пролиферативной активности до проведения комплексного лечения в клетках аденокарциномы находился в интервале от 46 до 80%. Среднее значение Ki-67 с метастазами и рецидивами составило 53,8 ± 2,04, без рецидивов - 44,07 ± 5,2. Низкая пролиферативная активность с метастазами наблюдалась в 38,2%, без метастазов в 41,1% случаев. Высокая пролиферативная активность с метастазами составила 32,2% случаев, без - 67,6% (n = 23). По данным исследования, предположительно, что корреляционная связь между степенью регрессии и уровнем инвазии обусловлена повреждающим действием ионизирующего излучения. Пролиферативный антиген является более чувствительным показателем степени регрессии опухоли, чем гистологический метод [17]. При уровне Ki-67 30,4 ± 5,7 выявляются метастазы и рецидивы в 21% случаев. Уровень Ki-67 является относительно неблагоприятным фактором после проведенного лечения и требует дальнейшего динамического наблюдения. Таким образом, определяя степень регрессии опухоли по разработанным методикам необходимо проводить расчет индекса Ki-67 иммуногистохими- ческим методом, сопоставлять данные изменения с наличием метастазов и рецидивов. Планируется проведение дальнейшего исследования в этом направлении. Выводы 1. По результатам исследования выявлена отрицательная взаимосвязь между максимальным размером опухоли и индексом пролиферативной активности Ki-67 после лечения (coeff. corr. = -0,49). 2. Положительная корреляционная зависимость между степенью регрессии опухоли и уровнем инвазии (coeff. corr. = +0,47). 3. Отрицательная корреляционная зависимость между степенью регрессии опухоли и индексом пролиферативной активности Ki-67 после лечения (TOeff corr. = -0,4).

About the authors

Tat’yana V. Zenukova

Blokhin Research Center Russian Cancer of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: zenyukova1980@mail.ru
МD 115478 Moscow, Russian Federation

A. G Perevoschikov

Blokhin Research Center Russian Cancer of the Russian Academy of Medical Sciences

115478 Moscow, Russian Federation

D. V Kuzmichev

Blokhin Research Center Russian Cancer of the Russian Academy of Medical Sciences

115478 Moscow, Russian Federation

Yu. A Barsukov

Blokhin Research Center Russian Cancer of the Russian Academy of Medical Sciences

115478 Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files