Ex vivo comparative study of probe-based confocal laser endomicroscopy and light microscopy in diagnostics of lung cancer

Full Text

По данным Международного агентства по изучению рака, в мире ежегодно диагностируют около 1 млн новых случаев рака легкого, что составляет более 12% всех выявленных злокачественных новообразований [1]. Национальное исследование по скринингу рака легкого в США (National lung cancer screening trial - NLCST) свидетельствует о 20% сокращении смертности, однако инвазивная диагностика влечет за собой значительное количество осложнений и летальных исходов [2]. Даже трансбронхиальные биопсии ткани легкого при бронхоскопии и тонкоигольная аспирационная биопсия под контролем компьютерной томографии (КТ) сопровождаются осложнениями. Таким образом, запрос на новые диагностические процедуры, заведомо менее инвазивные, закономерно возрастает. Особый интерес в настоящее время представляют методы, направленные на снижение риска, связанного с забором биопсийного материала. Сравнительно недавно появившаяся в арсенале бронхологов технология - конфокальная лазерная эндомикроскопия (КЛЭМ) - позволяет в реальном времени неинвазивно получать близкое к микроскопическому изображение. Метод КЛЭМ основан на принципе конфокальной флюоресцентной микроскопии. Минизонд проводится по инструментальному каналу бронхоскопа до уровня визуализации бронхиальных и альвеолярных структур, позволяя производить так называемую оптическую биопсию. В данном зонде используется лазер (длина волны 488 нм), луч которого передается в альвеолярное пространство, в результате чего генерируется в реальном времени изображение с диаметром оптического поля 600 мкм, частотой 12 изображений в секунду и глубиной проникновения 50 мкм [3]. В иных медицинских областях, таких, например, как гастроэнтерология, данная технология применяется для выбора оптимального участка слизистой оболочки для выполнения биопсии, в особенности при пищеводе Барретта и раке желудка [4, 5]. В бронхологии КЛЭМ была применена для исследования центральных дыхательных путей, в результате чего установлены определенные признаки предраковых поражений слизистой оболочки бронхов [6]. С точки зрения онкологии перспективы метода КЛЭМ при исследовании периферической зоны - легочной паренхимы - связаны с попытками сопоста- вить эндомикроскопические изображения с гистологической картиной карциномы и установить степень их корреляции. Доступные на сегодняшний день исследования по соответствию in vivo биопсий получаемому впоследствии гистологическому заключению не располагают надежной доказательной базой ввиду невозможности одновременно с визуализацией прецизионно выполнить биопсию в зоне проведения «оптической биопсии», так как минизонд для КЛЭМ и биопсийные щипцы не могут быть заведены в инструментальный канал бронхоскопа одновременно. С целью сопоставления результатов традиционной гистологии и эндомикроскопических данных по раку легкого мы провели настоящее исследование ex vivo. Материал и методы Исследование было одобрено этическим комитетом Федерального научно-клинического центра специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России. В исследование включено 18 пациентов, подвергшихся лобэктомии или пульмонэктомии по поводу рака легкого с ноября 2011 г. по февраль 2012 г. Сразу после лобэктомии доля легкого со злокачественным новообразованием была сначала обследована методом КЛЭМ с последующей маркировкой. Далее образцы отправлялись в отделение патологической анатомии для приготовления гистологических препаратов. КЛЭМ выполнена при помощи системы Cellvizio (Mauna Kea Technologies, Париж, Франция) с использованием минизонда диаметром 1,4 мм (Alveoflex; Mauna Kea Technologies) с боковым разрешением 3,5 мкм, полем 600 • 500 мкм и глубиной пенетрации 50 мкм [7-9]. Перед введением минизонда в бронхи и кровеносные сосуды с целью сохранения их наполненного состояния и во избежание ателектаза вводился 10% раствор формалина. Выделялся бронх, ведущий непосредственно к опухоли, и через него осуществлялось заведение минизонда. Фрагменты легочной ткани обследовались с поверхности, захватывая зону поражения и прилежащие к опухоли участки. Видеозаписи анализировались посредством встроенного в систему программного обеспечения (Cellvizio viewer, version 1.6.0; Mauna Kea Technologies). Вся опухолевая ткань в удаленной доле легкого промаркирована раствором бриллиантовой зелени, а окружающие опухоль участки окрашены метиленовым синим. Фрагменты ткани легкого залиты в парафиновые блоки, микротомные срезы осуществлялись на толщину не более 50 мкм, и затем полу- 17 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2015 Характеристика пациентов Т аблица 1 Номер пациента Возраст, годы Пол Курение Характеристики рака легкого 1 45 М Курильщик Периферическая локализация, муцинозная аденокарцинома 2 53 Ж Курильщик Периферическая локализация, ацинарная аденокарцинома 3 60 М Курильщик Периферическая локализация, папиллярная аденокарцинома 4 62 М Курильщик Периферическая локализация, папиллярная аденокарцинома 5 55 Ж Бывший курильщик Центральная локализация, плоскоклеточная карцинома 6 68 М Курильщик Периферическая локализация, плоскоклеточная карцинома 7 59 Ж Не курит Центральная локализация, мелкоклеточный рак 8 70 М Бывший курильщик Центральная локализация, мелкоклеточный рак 9 64 М Курильщик Центральная локализация, плоскоклеточная карцинома 10 61 М Курильщик Периферическая локализация, папиллярная аденокарцинома 11 69 Ж Бывший курильщик Центральная локализация, плоскоклеточная карцинома 12 55 М Не курит Центральная локализация, мелкоклеточный рак 13 53 Ж Курильщик Периферическая локализация, папиллярная аденокарцинома 14 70 Ж Не курит Центральная локализация, плоскоклеточная карцинома 15 61 М Не курит Периферическая локализация, папиллярная аденокарцинома 16 66 М Курильщик Периферическая локализация, папиллярная аденокарцинома 17 54 М Бывший курильщик Центральная локализация, плоскоклеточная карцинома 18 68 Ж Курильщик Периферическая локализация, папиллярная аденокарцинома Рис. 1. Ткани, окружающие опухоль. a - слипшиеся между собой и утолщенные межальвеолярные перегородки, полости альвеол расширены. Cellvizio; б - утолщенные альвеолярные стенки. Лимфоцитарная инфильтрация альвеолярных стенок. Окраска гематоксилином и эозином. *200; в - альвеолярный отек. Капли жидкости в просвете альвеол. Ex vivo КЛЭМ; г - альвеолярный отек. Эозинофильная альвеолярная секреция. Окраска гематоксилином и эозином. *200; д - аутофлуоресцирующее скопление макрофагов. Ex vivo КЛЭМ; е - альвеолярные макрофаги вокруг опухолевой ткани. Окраска гематоксилином и эозином. *200. ченные срезы были окрашены гематоксилином и эозином. Световая микроскопия гистологических образцов выполнена на микроскопе Nikon eclipse 50i с использованием камеры DS-Fi1. Изображения, полученные в результате использования обоих методов - КЛЭМ и гистологического исследования, - оценены и сравнены двумя независимыми патоморфологами. Специфичными для конкретной опухоли 18 КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ признаками сочтены лишь те, которые были идентифицированы и морфологами, и эндоскопистами. Рис. 2. Легочная аденокарцинома. a - пациент № 2. Ярко флуоресцирующее поле (стромальный компонент), пронизанное темными пятнами (показаны стрелками). Ex vivo КЛЭМ; б - пациент № 2. Стромальный компонент представлен коллагеновыми волокнами, инфильтрированными лимфоцитами. Паренхима состоит из железистых раковых структур. Окраска гематоксилином и эозином. *200; в - пациент № 1. Муцинозный компонент. Слабо флуоресцирующие скопления слизи. Ex vivo КЛЭМ; г - пациент № 1. Муцинозный компонент. Слизь внутри некротизированных альвеолярных перегородок. Окраска гематоксилином и эозином. *200. Рис. 3. Плоскоклеточная карцинома. a - пациент № 5. Плоскоклеточная карцинома. Дихотомическое ветвление ярко флуоресцирующих волокон (стромальный компонент), темные слои поверх стромального каркаса. Ex vivo КЛЭМ; б - пациент № 5. Плоскоклеточная карцинома. Ветвление коллагеновых и эластических волокон; крупные чешуйчатые клетки поверх стромального каркаса. Окраска гематоксилином и эозином. *200. Результаты и обсуждение От 18 пациентов получено 18 образцов ткани (табл. 1). Легочная ткань, прилежащая непосредственно к опухоли Изменения в участках легочной ткани, прилежащих к опухоли, во всех образцах аналогичны и представлены участками альвеолярного дистелектаза с утолщением альвеолярных перегородок (рис. 1, a, б), внутриальвеолярным отеком в виде наличия капель транссудата в просвете альвеол (см. рис. 1, в, г) и большим количеством альвеолярных макрофагов (см. рис. 1, д, е). Аденокарцинома Ткань аденокарциномы представляла собой неструктурированную (аморфную) массу, в которой невозможно различить просветы и стенки альвеол ввиду изменений, обусловленных раковой трансформацией. Вместо этого наблюдался ярко флуоресцирующий оптически плотный каркас в сочетании с участками пониженной плотности. Данный феномен мы назвали «оптической рельефностью» (рис. 2, a). Поскольку известно, что элементы соединительной ткани визуализируются как ярко флуоресцирующие, а клеточные структуры не видны при КЛЭМ с данной длиной волны, мы пришли к заключению, что яркие области соответствовали стромальному компоненту опухоли, а участки пониженной плотности - железисто-подобным структурам, характерным для легочной аденокарциномы. Данное предположение не противоречит типичным гистологическим признакам опухоли, которые мы наблюдали во всех образцах аденокарциномы (рис. 2, б). Явление «оптической рельефности» отмечалось во всех препаратах аденокарциномы. Кроме того, в препаратах муцинозной аденокарциномы муцинозный компонент визуализировался в виде слабо флуоресцирующей слизистой массы в сочетании с некротизированными альвеолярными перегородками (рис. 2, в, г). Плоскоклеточная карцинома При данном типе опухоли ввиду раковой трансформации также визуализировалась аморфная масса. При КЛЭМ мы обнаружили дихотомически ветвящиеся ярко флуоресцирующие волокна, которые представляли собой стромальный компонент опухоли, а оптически менее плотные слои, расположенные на стромальном каркасе, с низким уровнем флуоресценции, вероятнее всего, являлись клеточным компонентом (рис. 3, a). Гистологически мы наблюдали аналогичные изменения, включая «дихотомическое ветвление» соединительнотканных волокон в сочетании с плоскоклеточным компонентом опухоли (рис. 3, б). Мелкоклеточный рак Мелкоклеточная карцинома, подобно прочим 19 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2015 Рис. 4. Мелкоклеточная карцинома. a - пациент № 8. Мелкоклеточная карцинома. Эффект рассеивания света. Ex vivo КЛЭМ; б - пациент № 8. Мелкоклеточная карцинома. Мелкие лимфоцитоподобные клетки и незначительное количество стромальных волокон. Окраска гематоксилином и эозином. *40. типам рака легкого, визуализировалась в виде бесструктурной массы. В изображениях, полученных при «оптической биопсии», данный гистологический тип опухоли отличался слабовыраженным соединительнотканным компонентом, что не противоречит микроскопической картине мелкоклеточного рака легкого (рис. 4, б). Однако мы нашли другую отличительную особенность, характерную только для мелкоклеточной карциномы - эффект рассеяния света (рис. 4, a). В табл. 2 и 3 суммированы данные, полученные в результате эндомикроскопического исследования всех образцов ткани. В некоторых препаратах не выявлено четкого паттерна, присущего конкретной опухоли. При световой микроскопии данных образцов установлен смешанный гистологический паттерн с признаками одновременно и аденокарциномы, и плоскоклеточного рака. Трансбронхиальная биопсия ткани легкого является относительно безопасной процедурой, однако все же противопоказана при тяжелой сопутствующей патологии и временами требует дополнительных затрат в связи с возникающими осложнениями [10]. Поскольку КТ-скрининг для выявления рака легкого становится все более популярным, справедливо ожидать общего прироста осложнений в связи Таблица 2 Эндомикроскопические особенности различных типов рака легкого Тип рака легкого Компонент опухоли стромальный компонент паренхиматозный компонент Аденокарцинома Ярко флуоресцирующий фон с оптически низкоплотными включениями Оптически низкоплотные включения железистоподобных структур Плоскоклеточная карцинома Дихотомическое ветвление тонких соединительнотканных волокон Оптически низкоплотные поля, расположенные на стромальном каркасе Мелкоклеточных рак Отсутствует Эффект рассеивания света с инвазивными диагностическими процедурами [11]. Такой метод, как срочное цитологическое исследование материала, полученного при трансбронхиальной тонкоигольной биопсии (Rapid Onsite Evaluation of fine needle aspiration specimens by cytology, ROSE), помогает сократить количество биопсий (тонкоигольная аспирация под контролем EBUS), а следовательно, и риски, но изначально для гистологической оценки все еще необходима биопсия. КЛЭМ - новая технология, позволяющая осуществлять первичную неинвазивную «оптическую биопсию» для оптимизации места непосредственного забора биопсийного материала. Тем не менее этот метод все еще остается на доклинических позициях отчасти ввиду недостаточных критериев интерпретации полученных изображений, в том числе при раке легкого [12]. Другое потенциальное преимущество КЛЭМ перед срочным цитологическим исследованием состоит в простоте подготовки препаратов и возможности дистанционной трансляции изображений. В данном пилотном исследовании мы описали отличительные особенности различных типов рака легкого (аденокарцинома, плоско- и мелкоклеточный рак), сравнив ex vivo экземпляры, полученные в результате лобэктомии, с КЛЭМ-изображениями участок за участком. В самой ткани рака мы наблюдали два компонента опухоли: строму и паренхиму. Основной визуализируемой структурой при КЛЭМ в нормальной ткани легкого является эластин, в состав которого входят естественные эндогенные флюорофоры [13]. Поэтому мы описали различия между аденокарциномой, плоскоклеточной карциномой и мелкоклеточным раком легкого согласно соответствующим различиям в соединительнотканном паттерне различных опухолей. Общей особенностью всех изученных образцов рака легкого было наличие аморфных масс ввиду неопластической трансформации. При КЛЭМ визуализируемые в норме альвеолярные полости и стенки не наблюдались в пределах ткани, пораженной раком. Стромальный компонент аденокарциномы представлен ярко флуоресцирующей областью, пронизанной оптически разреженными участками. Ширина светового излучения зависела от толщины интерстициальных волокон в каждом конкретном случае. Паренхиматозный компонент виден в качестве менее оптически плотных полей, образуемых железисто-подобными структурами, патогномонич- ными для аденокарциномы. Такая особенность визуализации может быть объяснена неспособностью метода КЛЭМ выявить клеточные структуры без дополнительной контрастной окраски. Главный недостаток этой технологии - фиксированная длина волны (488 нм), что существенно ограничивает ее диагностические возможности. Микроспектрометральные эксперименты наряду с конфокальной микроэндоскопической визуализа- 20 КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Таблица 3 Изменения, выявленные при конфокальной лазерной эндомикроскопии, для каждого из исследованных образцов Номер образца Тип рака Наличие стромального компонента Паттерн темных пятен Дихотомическое ветвление стромального компонента Паренхиматозный паттерн темных слоев Эффект рассеивания света 1 Муцинозная аденокарцинома + + - - - 2* Ацинарная аденокарцинома + + - + - 3 Папиллярная аденокарцинома + + - - - 4 Папиллярная аденокарцинома + + - - - 5* Плоскоклеточная карцинома + - + + - 6* Плоскоклеточная карцинома + + + + - 7 Мелкоклеточный рак - - - - + 8 Мелкоклеточный рак - - - - + 9 Плоскоклеточная карцинома - - + + - 10 Папиллярная аденокарцинома + + - - - 11 Плоскоклеточная карцинома - - + + - 12 Мелкоклеточный рак - - - - + 13 Папиллярная аденокарцинома + + - - - 14 Плоскоклеточная карцинома - - + + - 15* Папиллярная аденокарцинома + + - + - 16 Папиллярная аденокарцинома + + - - - 17 Плоскоклеточная карцинома - - + + - 18 Папиллярная аденокарцинома + + - - - Примечание. «+» - КЛЭМ-паттерн присутствует, «-» - КЛЭМ-паттерн отсутствует; * - при световой микроскопии данных препаратов выявлен смешанный гистологический паттерн одновременно с признаками аденокарциномы и плоскоклеточного рака. цией продемонстрировали, что главный сигнал флюоресценции, испускаемый в результате возбуждения при длине волны 488 нм, порождается эластином [14]. Оптически менее плотные области обусловлены структурами, не визуализирующимися при данной длине волны. Мелкоклеточная карцинома - главным образом клеточная опухоль, поэтому стромальный компонент не определялся. На КЛЭМ-изображениях мелкоклеточная карцинома представлена эффектом рассеяния света. Другие исследователи использовали контрастные красители, такие как акрифлавин и флуоресце- ин, для дополнительного отображения клеточных или паренхиматозных компонентов интерстиция [15-17]. В этом исследовании отсутствие контраста не препятствовало визуализации злокачественной структуры и дифференциации ее от смежных тканей. Необходимы дополнительные исследования для оценки эффекта красителей при КЛЭМ с использованием уже выявленных особенностей визуализации рака легкого. Учитывая тот факт, что наша модель является моделью ex vivo, мы использовали формалин для предотвращения ателектаза и удаляли кровь, что позволяло улучшить визуализацию по сравнению с моделью in vivo [18]. Кровь может послужить серьезным ограничителем при исследовании с длиной волны 488 нм, так как оптическая плотность крови такова, что затруднила бы визуализацию опухоли или легкого. В клинической практике оптическая визуализация с помощью КЛЭМ должна выполняться перед стандартной биопсией, поскольку даже умеренное кровотечение может существенно снизить качество получаемых изображений. Уже есть сообщения об in vivo исследованиях рака легкого с применением КЛЭМ, мы же в своей работе с ex vivo моделью преследовали цель выявить ошибки, связанные с выполнением биопсии in vivo [14, 19]. В отличие от биопсии, например, при пищеводе Барретта или слизистой оболочки крупных бронхов при периферической биопсии легкого нет возможности прямого эндоскопического контроля. Кроме того, технология КЛЭМ не встроена в бронхоскоп и конфокальный зонд необходимо извлечь из инструментального канала, после чего заводятся щипцы для взятия биопсии, а вероятность их попадания в тот же самый фокус 600 мкм не так велика. Поле зрения при КЛЭМ составляет только 600 мкм, глубина - 50 мкм, что делает невозможным сравнение со световой микроскопией при исследовании на модели in vivo. У данного исследования есть несколько ограничений. Оно не было слепым с точки зрения доступности результатов КЛЭМ и гистологического исследования для эндоскописта и морфолога, анализирующих изображения, что заведомо могло привести к предвзятости их трактовки. Для того чтобы оценить потенциальную практическую выгоду метода КЛЭМ, необходимо интерпретировать изображения без знания диагноза. Однако цель исследования не состояла в том, чтобы независимо установить диагноз, основываясь лишь на особенностях изображения, выявленных с 21 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2015 помощью КЛЭМ. Мы сравнивали изображения, полученные двумя методами. Кроме того, эти результаты необходимо воспроизвести на модели in vivo для верификации полученных результатов. Также необходимо провести изучение корреляций между трактовкой изображений, основываясь на этих описательных результатах, и пониманием технологии, визуализирующей только стромальные компоненты ткани. Кроме того, наш объем выборки был совсем невелик и следует провести более масштабное исследование в условиях in vivo для подтверждения выявленных нами диагностических особенностей. В этом исследовании нам удалось дифференцировать различные подтипы немелкоклеточного рака легкого, однако наши образцы могли содержать очаги некроза и подтипы с «перекрыванием» гистологических признаков. Безусловно, КЛЭМ ввиду своей неинвазивно- сти является перспективным методом диагностики и скрининга рака легкого, дополняющим КТ. Условия для скрининга рака легкого закономерно могут отличаться от условий, созданных нами при проведении данного исследования, поскольку мы не рассматривали определенные подтипы рака легкого, например, такие как аденокарцинома in situ, которая характеризуется менее инвазивными признаками по сравнению с рассмотренными нами формами рака. Последующие исследования будут направлены на изучение предраковой патологии легких для оценки скрининговых возможностей “оптической биопсии”. Заключение Таким образом, наше исследование показало, что КЛЭМ способна выявить определенные характерные признаки, при помощи которых возможно верифицировать некоторые формы рака легкого в образцах ex vivo. Эти эндомикроскопические характеристики отчасти отражают гистологическую структуру опухоли, визуализируемую при световой микроскопии, и, вероятно, могут быть использованы для диагностики рака легкого in vivo.

About the authors

Olesya V. Danilevskaya

Federal Research Clinical Center of Special Medical Care and Technologies

Email: danless@mail.ru
MD, PhD 115682, Moscow, Russian Federation

A. V Sorokina

Federal Research Clinical Center of Special Medical Care and Technologies

115682, Moscow, Russian Federation

A. V Averyanov

Federal Research Clinical Center of Special Medical Care and Technologies

115682, Moscow, Russian Federation

F. G Zabozlaev

Federal Research Clinical Center of Special Medical Care and Technologies

115682, Moscow, Russian Federation

N. Yu Urazovsky

Federal Research Clinical Center of Special Medical Care and Technologies

115682, Moscow, Russian Federation

D. V Sazonov

Federal Research Clinical Center of Special Medical Care and Technologies

115682, Moscow, Russian Federation

A. G Sotnikova

Federal Research Clinical Center of Special Medical Care and Technologies

115682, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files