Diagnostic and prognostic significance of non-ribosomal nucleolar B23/nucleophosmin protein expression in smooth muscular tissue of the uterus

Abstract

Full Text

Исследование аргирофильных белков, ассоциированных с ядрышкообразующими районами (Ag- ЯОР-белков), в патологоанатомической практике началось около 30 лет назад (Roussel P. и соавт., 2010). Одним из ключевых аргирофильных белков клетки является нерибосомный ядрышковый белок В23/нуклеофозмин (NPM, синонимы нума- трин и NO38) с молекулярной массой от 35 до 40 кД, содержание которого в активно пролиферирующих клетках (в первую очередь в малигнизиро- ванных) превышает в 20-30 раз содержание в неизмененном пуле клеток (Lim M. и соавт., 2006). Его мультифункциональное значение сводится к рибосомальному синтезу, шаперонной функции с ядерно-ядрышковой транслокацией ряда белков, регуляции апоптоза за счет супрессии р53 и рМ311 и пролиферации (Szebeni A., 1999). Конечным функциональным актом белка являются антиапоптоти- ческое воздействие и остановка дифференцировки клетки, что в какой-то степени сближает его действие с функциональным значением белков теплового шока (Piao L. и соавт., 2009). К настоящему времени накоплен большой материал, свидетельствующий о диагностической и прогностической значимости исследования NPM при опухолях, однако полученные результаты носят противоречивый характер (Shakalya W. И соавт., 2008). Гладкомышечные доброкачественные и злокачественные опухоли тела матки с точки зрения эпидемиологии и распространенности являются гетерогенной группой опухолей. На всех этапах морфологического исследования гладкомышечных опухолей возникает большое количество нерешенных вопросов: речь идет прежде всего о клинико-морфофункциональных характеристиках опухоли, а ответы патолога зачастую носят формальный ответ, не отвечающий современным клиническим подходам терапии данной патологии и техническим возможностям клинической патологии (Politi K. и соавт., 2004; Chen L. и соавт., 2008). Несмотря на многочисленные работы в направлении поиска молекулярных звеньев патогенеза, морфогенетические механизмы процессов становления лейомиомы (ЛМ) и, возможно, ее последующей малигнизации до настоящего времени неизвестны в большей степени ввиду недостаточно всесторонней освещенности клинико-морфофункциональных характеристик как ЛМ, так и лейомиосаркомы (ЛМС) (Leitao M. и соавт., 2004). Что касается клинической и патоморфологической значимости исследования NPM в ЛМ и ЛМС тела матки, и в первую очередь в клетках ЛМС, во взаимосвязи с различными клинико-морфологическими, биомолекулярными параметрами и прогнозом, в настоящее время нет работ, в какой-либо степени освятивших данную проблему, хотя была показана высокая корреляция содержания общих аргиро- фильных белков в клетках ЛМ и ЛМС с клиникоморфологическими параметрами (Авдалян А.М. и соавт., 2013). Цель работы - определение взаимосвязи некоторых клинико-морфологических, биомолеку- лярных характеристик ЛМ и ЛМС тела матки с количественными и качественными параметрами экспрессии NPM опухолевых клеток. Материал и методы. В исследовании использовали операционный материал от больных ЛМ (45 случаев) и ЛМС (45 случаев), пролеченных за период 1986-2007 гг. в АКОД. Материал проводили по стандартной проводке, готовили срезы 3-4 мкм. Для выявления количества Ag-ЯОР-белков без учета типа срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике. В каждом случае определяли количество Ag-ЯОР-белков в виде гранул в нуклеолярном и кариоплазматиче- ском кластерах в ядрах на 100-120 случайно выбранных клеток при увеличении в 1000 раз (объектив х100, 1.25, oil). Для оценки качественных и количественных параметров NPM проводили ИГХ-реакцию с антителами к Nucleofosmin в автоматическом иммуностейнере Ventana XT (клон FC-61911, Monosan). Оценивали тип реакции (ядерный, цитоплазматический или нуклеоляр- ный), количество позитивных нуклеол на ядро, оценивали площадь позитивных нуклеол (в мкм2) и интегральную оптическую плотность (IOD) в условных единицах свечения. Компьютерный анализ цифровых изображений проводили с использованием программы ImageJ 1.42. Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Statistica 6.0. Для оценки корреляций количества NPM с другими патоморфологическими параметрами использовали так называемые пороговые величины, представляющие из себя средний показатель изучаемого критерия. При анализе 10-летней выживаемости использовали кумулятивный пропорциональный анализ по Каплану - Мейеру, многофакторный анализ Кокса. При анализе взаимосвязи изученных параметров NPM в клетках ЛМС с прогнозом все больные были рандомизированы на 2 группы: с благоприятным прогнозом (живы без рецидива и/или метастазиро- вания в течение всего периода исследования) и с неблагоприятным прогнозом (либо умерли в течение исследования, либо имелся рецидив и/или ме- тастазирование за срок исследования). Результаты. Результатом иммуногистохимиче- ской реакции с антителами к NPM была ядрышковая локализация выявляемого белка, что было вполне логичным и сопоставимым с данными мировой литературы. Полученные данные показали, что различные варианты ЛМ не отличались друг от друга по количественным и качественным характеристикам NPM. В то же время были выявлены значимые различия изученных параметров NPM в ЛМ и ЛМС. Индекс NPM, интегральная оптическая плотность и площадь позитивных ну- клеол были значимо выше в ЛМС относительно ЛМ (65,9±3,5 и 54,1±4,3%, 18450±216 и 13257± 947 IOD, 1,2±0,1 и 0,9±0,05 мкм2 соответственно). В ЛМС в зависимости от гистологического типа была выявлена статистически значимая дисперсия данных: минимальными количественными показателями характеризовался веретеноклеточный тип ЛМС: площадь позитивных нуклеол и интегральная оптическая плотность были значимо меньше, чем при ЛМС эпителиоидноклеточной и с большим количеством многоядерных клеток (72,8±2,7 и 64,9±3,9%, 30006±320 и 12826±145 IOD, 1,8±0,2 и 0,9±0,09 мкм2 соответственно). В то же время не было выявлено значимых различий между гистологически различными типами ЛМС по индексу NPM и количеству позитивных нуклеол в ядрах опухолевых клеток. При поиске взаимосвязи характеристик NPM с клинико-морфологическими характеристиками ЛМ и ЛМС были получены интересные данные. Значимых различий NPM между возрастными группами ни при ЛМ, ни при ЛМС найдено не было. Размер ЛМ также не был взаимосвязан с параметрами NPM. В то же время при ЛМС до 7 см IOD позитивных нуклеол и соответственно количество белка было значимо меньше, чем в опухолях более 7 см. Также при увеличении степени злокачественности ЛМС значимо увеличивались индекс IOD NPM в клетках опухоли (14681±157 и 23161±427 IOD соответственно). При прогрессировании стадии заболевания от I до II происходило увеличение индекса NPM и значимое снижение IOD-позитивных нуклеол NPM (75,4±3,3 и 62,8±5,2%, и 19974±345 и 15402±165 IOD соответственно). При анализе прогностической значимости количественных и качественных характеристик NPM в клетках ЛМС было выявлено, что рост индекса и IOD NPM сопряжен с неблагоприятным исходом. Так, в случаях благоприятного исхода (больные живы на момент исследования) индекс и IOD NPM составили 61,8±3,3 и 16925±36 % соответственно, а при неблагоприятном исходе (больные погибли на момент исследования) - 72,6%±4,4% и 20536±291 соотетственно, х2=5,9; р=0,002. Что касается сопоставлений с биомолекуляр- ными маркерами систем пролиферации и апоптоза и рецепторного статуса опухоли, было выявлено, что в ЛМ оставались относительно стабильными параметры NPM при увеличении пролиферативного индекса Ki-67, но значимо увеличивался индекс NPM и IOD при росте экспрессии р53 и при негативном рецепторном статусе. Вместе с тем в ЛМС происходили радикально противоположные динамики: при росте Ki-67 снижался индекс и IOD NPM. При росте р53 происходил сонаправленный рост индекса и IOD NPM. При позитивном же рецепторном статусе ЛМС индекс и IOD были выше, чем при негативном. Выводы 1. Преобладающим типом реакции с NPM в клетках ЛМ и ЛМС различных гистологических типов была ядрышковая. Цитоплазматическая, ядерная и смешанные типы реакции нами не были отмечены ни в одном случае. 2. Индекс НФС, интегральная оптическая плотность и площадь позитивных нуклеол были значимо выше в ЛМС относительно ЛМ: 65,9±3,5 и 54,1±4,3%, 18450±216 и 13257±947 IOD, 1,2±0,1 и 0,9±0,05 мкм2 соответственно. 3. Значимо высокими количественными и качественными показателями NPM характеризовался гистологический тип ЛМС эпителиоиднокле- точный и с большим количеством многоядерных клеток относительно веретеноклеточного варианта: 72,8±2,7 и 64,9±3,9%, 30006±320 и 12826± 145 IOD, 1,8±0,2 и 0,9±0,09 мкм2 соответственно. 4. Была обнаружена корреляция размера, степени злокачественности (по FNCLCC) и стадии (по FIGO) с IOD NPM (увеличение при опухоли более 7 см и по мере увеличения степени злокачественности; снижение показателя от I ко II стадии процесса) при ЛМС (r=3,6-5,9). При ЛМ не было обнаружено значимых корреляций клинико-патологических параметров с характеристиками NPM (r=3,1). 5. При анализе взаимосвязи NPM с экспрессией Ki-67, р53 и рецепторного статуса в ЛМ и ЛМС были обнаружены обратные взаимосвязи: в ЛМ при увеличении Ki 67 и р53 происходил рост индекса и IOD NPM, а при позитивном рецепторном статусе также происходил рост этих показателей. В ЛМС, напротив, при увеличении индекса Ki- 67 и р53 происходило снижение индекса и IOD NPM, а при позитивном рецепторном статусе происходило снижение этих показателей. При многофакторном прогностическом анализе по Коксу параметры индекса и IOD NPM были значимыми, но не независимыми параметрами 10-летней выживаемости при %2=5,9.