PROCATHEPSIN B AND ENDOGENOUS INHIBITORS OF CYSTEINE PROTEASES IN TUMORS OF REPRODUCTIVE SYSTEM

Full Text

Неуклонный рост заболеваемости злокачественными новообразованиями среди населения России является глобальной проблемой социальной значимости, которая диктует условия для её решения на всех этапах, как в медицинской индустрии, так и в науке. Только за 2015 г. прирост общей заболеваемости составил 4,0% по сравнению с показателем 2014 г., а за период с 2005 г. прирост составил 20,35%. Наибольший удельный вес в структуре общей онкологической заболеваемости женщин составили злокачественные новообразования органов репродуктивной системы - 38,9% (в 2014 г. 37,6%). Среди злокачественных новообразований у женщин в 2015 г. опухоли половых органов составили 18,0% (в 2014 г. 17,1%). Ведущими локализациями в структуре онкологической патологии у женщин остаются рак молочной железы (20,9%), рак тела матки (7,7%), рак яичников (4,4%) [1]. Поиск новых биологических маркеров в диагностике рака остаётся по-прежнему перспективным направлением в онкологии. Очевидно, что рак органов репродуктивной системы представляет глобальную и актуальную проблему в онкологии, причём многие факторы, которые вовлечены в процесс развития опухолей, до настоящего времени остаются невыясненными. Исследования на моделях опухолей у экспериментальных животных и при различных типах рака у людей показали, что общей особенностью является увеличение экспрессии и активности протеаз в опухолевых и/или стромальных клетках опухоли при прогрессировании рака. Цистеиновые, аспартильные, сериновые и другие протеазы универсально вовлечены в развитие и метастазирование опухолей человека и млекопитающих [2, 3]. Опухолевые клетки способны секретировать как зрелые, так незрелые проформы протеаз различных классов и их эндогенные ингибиторы, чтобы защитить опухолевые клетки от протеолиза и разрушения [3-5]. Проформы и эндогенные ингибиторы цистеиновых протеаз (цистатины) играют определяющую роль как регуляторы внутрилизосомного и внутриклеточного протеолиза [5, 6]. Показано, что катепсин B наряду с катепсином D участвует в апоптозе опухолевых клеток [7, 8] и процессинге прокаспаз и активных каспаз [8, 9], секреторного ингибитора протеаз лейкоцитов [5, 6, 10]. Высказана гипотеза, что при повышенной экспрессии протеаз в опухолях человека и животных прокатепсин B и активная зрелая форма катепсина B могут быть маркерами инвазии опухолей, например при раке молочной железы, прямой кишки, предстательной железы [11-13], их также рассматривают как возможный новый опухолевый биомаркер при раке яичников [14-19]. Цистатины образуют прочные обратимые комплексы с мишенями - цистеиновыми протеазами и являются эффективными эндогенными ингибиторами катепсинов B, L, H, S [2, 3, 16, 20, 21]. Суперсемейство цистатинов первой (цистатины A, B) и второй группы (цистатины C, S, SN, D) привлекают всё большее внимание исследователей в связи с перспективой использования ингибиторов цистеиновых протеаз в терапии опухолей человека. Эндогенные ингибиторы цистеиновых протеаз - цистатин C и цистатин B - возможно, также вовлечены в развитие опухолей, пролиферацию и миграцию клеток [2, 5-7]. Полагают, что цистатин B играет защитную роль против повреждающего действия цистеиновых протеаз, что выявлено при колоноректальном раке и других опухолях [12, 14, 18]. До настоящего времени роль цистатинов B и C в онкологии исследована недостаточно. Поиск новых биомаркеров опухолей среди ингибиторов протеаз и неактивных проформ ферментов представляет определённый интерес при раке лёгкого, раке молочной железы [8] и других опухолях [12, 13, 15, 20-22]. Цель исследования - оценка роли прокатепсина B и ингибиторов цистеиновых протеиназ (цистатинов B и C) в биологических жидкостях у человека как возможных маркеров злокачественных опухолей репродуктивной системы. Материал и методы Объект исследования: биологические жидкости женщин 18-80 лет, больных опухолями органов репродуктивной системы (n = 172). Забор патологического материала (сыворотка крови, асцит) производили на базе Областного онкологического диспансера г. Новосибирска, в отделениях онкологии, гинекологии и маммологии. В качестве контроля использовали сыворотку крови 72 здоровых женщин в возрасте 18-65 лет (Областной диагностический центр, n = 32; ГБУЗ Новосибирской области «Городская больница № 3», n = 40). Биохимические исследования проводили на базе НИИ физиологии и фундаментальной медицины и НИИ биохимии г. Новосибирска. Исследованию подлежал выборочный патологический материал женщин с новообразованиями и различной локализацией процесса, у которых не наблюдалось межгрупповых отличий по возрасту (в ранее опубликованных результатах). Проведено сравнительное исследование концентрации прокатепсина B, эндогенных ингибиторов цистеиновых протеаз B и C в сыворотке крови. Рассматривались группы больных с II-IV стадиями рака, пациенток с пограничными образованиями яичников (n = 9) и злокачественными опухолями яичников (n = 30, из них 14 до лечения); раком эндометрия (n = 29, из них до лечения 16); раком молочной железы (n = 29, из них 18 до лечения). Асцитическую жидкость исследовали у пациенток с опухолями яичников, продуцирующими асцит. Биологический материал подлежал исследованию как до оперативного вмешательства и назначения терапии (оперативной, полихимиотерапии (ПХТ), лучевой), так и после лечения. Забор асцитической жидкости производили после диагностической абдоминальной пункции (парацентеза), а также после экстирпации матки с придатками в операционной. Забор крови осуществляли натощак из локтевой вены вакутейнером; сыворотку и асцитическую жидкость для исследования получали при центрифугировании образцов крови при 3000 об/мин и +4°C в течение 20 мин («Eppendorf 5415 R», Германия). Пробы хранили при -70°C не более одного мес и исследовали после однократного размораживания. Концентрацию прокатепсина B оценивали методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью коммерческого набора R&D Human Pro-Cathepsin B («Quantikine ELISA Kit», США); содержание цистатина С оценивали с помощью наборов ИФА BioVendor (Чехия), КРКА («Ново-Место», Словения) и набора ИФА R&D Human Cystatin C ELISA (США) для человека. Концентрацию цистатина B измеряли с помощью коммерческого набора для ИФА «USCN Life Science, Inc.» («Wuhan», Китай). Для определения стандартного биомаркера рака яичников СА-125 использовали метод ИФА с применением коммерческого набора ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирская обл., пос. Кольцово). Статистическая обработка результатов Статистический анализ результатов выполнен методом параллельных рядов вариационной статистики в среде приложения ANOVA, программа SPSS Statistica 12.0. Результаты выражали в виде средних арифметических величин и стандартных ошибок средних, M ± m, где M - среднее арифметическое значение, m - ошибка среднего. Нормальность распределения определяли по критерию Колмогорова-Смирнова, достоверность оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. В ряде случаев ввиду наличия выборок переменных, не подчиняющихся нормальному распределению, использовали непараметрические методы статистической обработки с помощью теста Kruskal-Wallis. Взаимосвязь между показателями оценивали с помощью корреляционного анализа, определяли коэффициент корреляции r. Различия считали статистически значимыми при p < 0,05. Результаты В сыворотке крови у больных по сравнению с контрольной группой здоровых женщин отмечено высокое содержание прокатепсина B при раке яичников (p < 0,001), раке эндометрия (p < 0,001), раке молочной железы (p < 0,001); концентрация цистатина B увеличена при раке яичников (p < 0,05), раке эндометрия (p < 0,001), раке молочной железы (p < 0,05); при раке яичников повышен также уровень CA-125 (более 400 Ед/л; p < 0,001) (табл. 1). При доброкачественных опухолях яичников повышен уровень прокатепсина B (p < 0,05) и CA-125 (более 35-45 Ед/л; p < 0,01). Однако при доброкачественных и пограничных опухолях яичников содержание в сыворотке крови цистатинов B и C достоверно не отличалось от контроля. Концентрация цистатина C не была изменена в сыворотке крови во всех группах со злокачественными новообразованиями репродуктивных органов (см. табл. 1). Прокатепсин B При исследовании содержания прокатепсина B в различных биологических жидкостях больных с новообразованиями репродуктивных органов отмечены его высокие показатели при раке яичников как в сыворотке крови, так и в асцитической жидкости, что даёт основание рассматривать его в перспективе как возможный новый биомаркер опухолей яичников [14-18]. Нами отмечены достоверные различия между показателями групп больных с опухолями яичников в сыворотке крови (p < 0,05) и асцитической жидкости (p < 0,01) (табл. 2). Выявлено достоверное увеличение концентрации прокатепсина B в сыворотке крови (p < 0,001) и асцитической жидкости (p < 0,001), а также концентрации CA-125 при раке яичников (p < 0,001). CA-125 - единственный маркер, который показывал достоверные изменения в сыворотке крови у больных с доброкачественными опухолями яичников (p < 0,01 по сравнению с контролем) в отличие от прокатепсина B, цистатина B и цистатина C (см. табл. 1). Уровни прокатепсина B и цистатина C в сыворотке крови коррелировали в группе контроля (r = 0,47; p = 0,04); концентрации прокатепсина B коррелировали с содержанием цистатина B в сыворотке крови после лечения при раке яичников (r = 0,89; p = 0,04). В асцитической жидкости уровень прокатепсина B коррелировал с уровнем цистатина B в сыворотке крови до лечения (r = 0,81; p = 0,02). Наши результаты согласуются с литературными данными, подтверждающими, что цистатин C и прокатепсин B в сыворотке крови коррелируют с прогрессированием заболевания [12, 21, 22]. Прокатепсин B является наиболее важным маркером при опухолях яичников, продуцирующих асцит, что важно в дифференциальной диагностике рака и выявлено как в сыворотке крови, так и асцитической жидкости (см. табл. 1, 2), что говорит о повышенной внеклеточной секреции его клетками опухоли (наиболее важный результат). Цистатин B По сравнению с показателями контрольной группы концентрация цистатина B достоверно увеличена в сыворотке крови при раке яичников (p < 0,05), раке эндометрия (p < 0,001), раке молочной железы (p < 0,05) (см. табл. 1). При сравнении уровня цистатина B в сыворотке крови и асцитической жидкости у больных с доброкачественными и злокачественными опухолями яичников достоверные различия выявлены только в сыворотке крови (p < 0,01) (см. табл. 2). Как показано ранее в литературе, самые высокие уровни цистатина B, которые коррелировали с благоприятным прогнозом у больных раком, наблюдали в тканях опухоли [12, 22]. Повышение уровня цистатина B уменьшает связанную с опухолью протеолитическую активность, и есть доказательства подавляющей роли цистатина B при различных типах рака [21, 22]. Цистатин C Концентрация цистатина C в асцитической жидкости при раке яичников значительно повышена (p < 0,05) по сравнению с его уровнем при доброкачественных опухолях, что может быть важным в дифференциальной диагностике рака яичников (см. табл. 2). Стандартный маркер CA-125 Мы показали, что этот маркер в сыворотке крови достоверно повышен и при доброкачественных опухолях яичников (p < 0,01), и при раке яичников (p < 0,001) (см. табл. 1). При сравнении концентраций CA-125 у больных со злокачественными и доброкачественными опухолями яичников отмечены достоверные различия только в сыворотке крови (p < 0,001) (см. табл. 2). Можно полагать, что CA-125 является лучшим сывороточным маркером при любых опухолях яичников. Концентрация CA-125 коррелировала с уровнем цистатина C в сыворотке крови перед лечением (p < 0,05; r = 0,61) и содержанием цистатина C в асцитической жидкости (p < 0,03; r = - 0,81). Показатели прокатепсина B и ингибиторов цистеиновых протеаз в сыворотке крови после противоопухолевой терапии При сравнении всех исследуемых показателей до и после проводимой терапии достоверное снижение уровня прокатепсина B отмечено во всех группах больных с новообразованиями репродуктивной системы (табл. 3); концентрации цистатина B и CA-125 снижены при раке яичников (см. табл. 3). Таким образом, определение в сыворотке крови содержания прокатепсина B и в меньшей степени цистатина B может быть важным в оценке толерантности к терапии и в дифференциальной диагностике опухолей яичников наряду с определением CA-125, а также как возможных маркеров рака репродуктивных органов. Заключение Прокатепсин B в сыворотке крови является наиболее вероятным биомаркером опухоли при раке яичников, что важно для детального изучения особенностей заболевания при различных вариантах опухолей яичников. Обнаружение различных профилей содержания прокатепсина B и цистатина B в сыворотке крови и асцитической жидкости у пациенток, страдающих раком яичников, а также изменение их уровней при раке молочной железы и раке эндометрия требуют дальнейшего изучения.

About the authors

Elena A. Gashenko

Scientific Research Institute of Physiology & Basic Medicine

Email: elena.gashenko@gmail.com
MD, Researcher of the Laboratory of Experimental Models of Neuron Degenerative Processes. Novosibirsk, 630117, Russian Federation Novosibirsk, 630117, Russian Federation

V. A Lebedeva

Novosibirsk State Medical University

Novosibirsk, 630091, Russian Federation

G. S Russkikh

Scientific Research Institute of Biochemistry

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

E. A Tsykalenko

Novosibirsk State Medical University

Novosibirsk, 630091, Russian Federation

A. B Pupyshev

Scientific Research Institute of Physiology & Basic Medicine

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

I. V Brak

Scientific Research Institute of Physiology & Basic Medicine

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

T. A Korolenko

Scientific Research Institute of Physiology & Basic Medicine

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

References

Supplementary files