INTERRELATION OF THE EXPRESSION OF PROTEINS ALK, HER2 AND AMPLIFICATION OF THE GENE OF HER2 WITH THE PROLIFERATIVE ACTIVITY AND SURVIVAL IN PATIENTS WITH STAGE I-II LUNG ADENOCARCINOMA

Full Text

На сегодняшний день среди случаев немелкоклеточного рака лёгкого отмечается увеличение частоты аденокарциномы лёгкого (Ак) по отношению к плоскоклеточному раку. Также в Ак найдены специфические генетические изменения, определяющие назначение таргетной терапии. В связи с этим является актуальным анализ молекулярно-биологических факторов, связанных с назначением таргетной терапии и прогнозом жизни больного. Белок ALK - это трансмембранный тирозинкиназный рецептор. Чаще всего в Ак гиперэкспрессия происходит за счёт внутрихромосомной мутации - инверсии на коротком плече хромосомы 2 части гена ALK с геном EML4, в результате чего образуется слитный белок EML4-ALK, приводящий к активации внутриклеточных каскадов и повышению пролиферации, угнетению апоптоза клетки. Гиперэкспрессия ALK при Ак выявляется с частотой от 1,4 до 11,2% [1, 2]. Первым таргетным препаратом, показавшим эффективность в отношении выживаемости больных Ак, был кризотиниб. Онкоген Her2 (erbB2) находится на длинном плече хромосомы 17 (q12-q21), продуктом этого онкогена является трансмембранный белок Her2 (erbB2) - рецептор с тирозинкиназной активностью относительно эпидермального фактора роста. В раковых клетках гиперэкспрессия этого онкогена происходит за счёт амплификации и намного реже за счёт мутации. Амплификация гена Her2 часто наблюдается при инвазивном раке молочной железы, в противоположность этому частота амплификации гена Her2 при Ак оценивается крайне вариабельно - от 2 до 38% [3, 4]. На сегодняшний день ведётся оценка эффективности терапии Ак препаратом трастузумаб (герцептин). В схемы химиотерапии Ак включены препараты антрациклинового ряда, ингибирующие фермент топоизомеразу IIα (TopoIIα), степенью активности которого обусловлена чувствительность опухоли к данным препаратам. TopoIIα - белок с ферментативной активностью, участвующий в топологической сборке ДНК во время транскрипции, конденсации и сегрегации хромосом. Он выявляется в клетках в S-, G2-, M-фазе клеточного цикла, поэтому является также маркером пролиферативной активности [5]. Для оценки пролиферативной активности общепризнанным и доступным является иммуногистохимическое определение уровня антигена Ki-67. Антиген Ki-67 выявляется в клетках в поздних G1-, S-, G-2, М-фазе, однако функциональное значение этого ядерного белка в процессе пролиферации до конца не выяснено. Метаанализ исследований показал взаимосвязь повышенной экспрессии Ki-67 с прогнозом Ак [6]. Анализ имеющейся литературы показал противоречивый характер связи изменений в генах ALK и Her2 с пролиферативной активностью и выживаемостью больных Ак [1, 3, 4, 7-12]. Исследовали мутации гена ALK и состояние гена Her2 в отношении пролиферативной активности и выживаемости при Ак. С учётом вышеизложенного целью работы было определение содержания белков ALK, Her2 и гена Her2, CEP17 во взаимосвязи с пролиферативной активностью и выживаемостью при Ак лёгкого I-II стадии. Материал и методы Исследовано 82 операционных материала Ак, удалённые за период 2007-2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов - 59 (72%) мужчин и 23 (28%) женщин составил 61 год (от 45 до 75 лет). Выполнена лобэктомия 73 (89%) пациентам и пневмонэктомия 9 (11%) пациентам. Предоперационная лучевая и химиотерапия не проводились. Постоперационная химиотерапия проведена 11 (13%) пациентам, чаще использовались цисплатин и этопозид. Постоперационную лучевую терапию суммарной очаговой дозой 50-60 Гр получили 22 (27%) пациента. Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно классификации TNM 7-го пересмотра [13]: Т1 - у 28 (34%) пациентов, Т2 - у 54 (66%); до 3 см - у 48 (59%), более 3 см - у 34 (41%); с N0 - у 64 (78%), N1 - у 18 (22%); стадия I - у 60 (73%), стадия II - у 22 (27%) пациентов. Гистологический тип определён согласно классификации IASLC/ATS/ERS [14]: преимущественно лепидический - у 8 (10%), преимущественно ацинарный - у 38 (46%), преимущественно солидный - у 36 (44%) пациентов. Кусочки ткани фиксировали 18-24 ч в 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом/алциановым синим. Выполняли иммуногистохимическое окрашивание в автоматическом режиме в автостейнере BenchMark XT («Ventana») с системой визуализации ultraView Universal DAB Detection Kit («Ventana»). Использовались 2 группы первичных антител. Первая группа первичных антител - дифференциально-диагностические маркёры, характеризующие гистогенез опухоли: цитокератин 7 (клон SP52, «Ventana»), цитокератин 20 (клон SP33, «Ventana»), TTF-1 (клон SP141, «Ventana) (контроль окрашивания - слизистая оболочка желудка). Для Ак характерным было положительное окрашивание на цитокератин 7 и TTF-1, в меньшей степени - на цитокератин 20. Вторая группа первичных антител - молекулярно-биологические маркёры, отражающие специфические характеристики опухоли: ALK (клон D5F3, «Ventana), Her2 (клон 4В5, «Ventana»), топоизомераза IIα (клон JS5B4, «Ventana»), Ki-67 (клон MIB-1, «Dako»). В каждом случае при исследовании белка ALK (контроль окрашивания - ALK-положительная Ак) отрицательной экспрессией считалось отсутствие цитоплазматического гранулярного окрашивания, положительной экспрессией - наличие окрашивания. Оценку окрашивания на белок Her2 (контроль окрашивания - Her2-положительный рак молочной железы) проводили согласно рекомендациям производителя с модификацией, предложенной для рака желудка [15], поскольку Ак не является гормонозависимой опухолью, как рак молочной железы: 0 - нет окрашивания или мембранное окрашивание менее 10% клеток; 1+ - слабое или фрагментарное мембранное окрашивание более 10% клеток; 2+ - слабое или умеренное базолатеральное или полное мембранное окрашивание более 10% клеток; 3+ - умеренное или выраженное базолатеральное либо полное окрашивание более 10% клеток. Иммуногистохимический статус опухоли определяли как отрицательный (окрашивание 0 или 1+) или положительный (окрашивание 2+ или 3+). При исследовании Ki-67 и TopoIIα исследовали 1000 клеток в 5-7 полях зрения микроскопа при ув. 400. Вычисляли индекс метки (ИМ) - количество положительно окрашенных клеток от общего числа исследованных клеток, выраженное в процентах. Так как распределение ИМ Ki-67 или TopoIIα было непараметрическим, данные представляли в виде медианы (Ме) и интерквартильного интервала (и. и.). Срезы были окрашены SISH-методом в автостейнере BenchMark XT («Ventana») набором INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail («Ventana») с двойной меткой - зондами для Her2 и CEP17 на одном стекле соответственно протоколу производителя (независимо от степени экспрессии белка Her2). Результаты окрашивания SISH оценивали согласно инструкции к набору: подсчитывали метку в 20/40 ядрах опухолевых клеток (ув. 1000), вычисляли соотношение Her2/CEP17. Оценку амплификации проводили согласно рекомендациям производителя: при соотношении Her2/CEP17 < 1,8 считали, что амплификация гена Her2 отсутствует, при соотношении Her2/CEP17 > 2,0 регистрировали наличие амплификации. При соотношении 1,8-2,0 в рассчёт включали дополнительный объём клеток до тех пор, пока не получали пограничного уровня. Для оценки состояния CEP17 использовали классификацию, предложенную S. Wang и соавт. [16]: при наличии менее 2,25 красных меток - отсутствие увеличения CEP17, при наличии более 2,25 красных меток - увеличение CEP17. По состоянию генов Her2 и CEP17 выделены 4 типа Ак: отсутствие амплификации гена Her2 и отсутствие увеличения CEP17 - тип N, отсутствие амплификации гена Her2 и наличие увеличения CEP17 - тип P, наличие амплификации гена Her2 и отсутствие увеличения CEP17 - тип A, наличие амплификации гена Her2 и наличие увеличения CEP17 - тип AP. Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Statistica 6.0. При проверке статистических гипотез применяли двусторонний точный критерий Фишера для таблиц 2Ч2, коэффициент корреляции рангов Спирмена (r). Определяли общую скорректированную выживаемость больных за 3-, 5- и 9-летний период после операции, использовали метод Каплана-Мейера, логарифмический ранговый тест, регрессионную модель Кокса. Достоверность полученных критериев оценивали при p < 0,05. Результаты При Ак положительная экспрессия ALK (см. рисунок, а, 3-я полоса вклейки) определена в 4 (5%) случаях: у 3 женщин и 1 мужчины, в 2 случаях отмечена I стадия и в 2 случаях II стадия заболевания, во всех случаях - преимущественно ацинарное строение. При Ак положительный Her2-статус (см. рисунок, б, 3-я полоса вклейки) определен в 16(20%) случаях. Хромогенная гибридизация in situ показала амплификацию гена Her2 в 7 (9%) случаях, увеличение CEP17 в (5%) случаях и амплификацию гена Her2 совместно с увеличением CEP17 в 10 (12%) случаях. В 4 (5%) случаях Ак амплификация гена Her2 (без увеличения CEP17) определялась в виде кластеров (12 и более копий) и соответствовала высокому уровню (см. рисунок, в, 3-я полоса вклейки). В 3 (4%) случаях Ак амплификация гена Her2 (без увеличения CEP17) определялась в виде отдельных множественных копий (от 4 до 8) и соответствовала низкому уровню (см. рисунок, г, 3-я полоса вклейки). Во всех 4 случаях отмечено незначительное увеличение CEP17 (до 4 красных меток). Во всех 10 случаях амплификации гена Her2 совместно с увеличением CEP17 амплификация гена Her2 соответствовала низкому уровню (от 4 до 8 копий), и увеличение CEP17 было незначительной степени (до 4 красных меток). В нашем исследовании во всех случаях с амплификацией гена Her2 определены опухоли I стадии с отсутствием метастазов в регионарные лимфатические узлы и преимущественно ацинарным или солидным типом строения. В случаях Ак с положительной экспрессией белка ALK отмечена отрицательная экспрессия белка Her2 и отсутствие амплификации гена Her2. При положительной экспрессии белка ALK зафиксирован достоверно более низкий уровень пролиферативной активности, оцененный по ИМ Ki-67 p = 0,02) и ИМ TopoIIα (p = 0,02), по сравнению с отрицательной экспрессией белка ALK (табл. 1). Также наблюдалась слабая корреляция между экспрессией белка ALK и ИМ Ki-67 (r = 0,24; p = 0,03) и ИМ TopoIIα (r = 0,23; p = 0,03). При положительной экспрессии белка Her2 отмечен более низкий уровень пролиферативной активности по сравнению с отрицательной экспрессией этого белка (см. табл. 1), однако различия не были статистически значимыми (p = 0,3). При наличии амплификации гена Her2 выявлен низкий уровень пролиферативной активности, оцененный по ИМ Ki-67 и ИМ TopoIIα, по сравнению с типами N и AP (статистически значимое различие), типом P (различие статистически незначимо, вероятно, ввиду крайне малого количества случаев в группе с типом P). Пролиферативная активность не имела статистически значимых различий между типами N, AP и P (см. табл. 1). Также отмечена умеренная корреляция амплификации гена Her2 с ИМ Ki-67 (r = 0,32; p = 0,003) и ИМ TopoIIα (r = 0,31; p = 0,004). Выживаемость больных Ак I-II стадии за 3-, 5- и 9-летний период после операции составила соответственно 52,3 ± 5,6, 38,4 ± 5,6 и 34,2 ± 5,6%. Выживаемость больных Ак при положительной экспрессии ALK и Her2 была ниже по сравнению с отрицательной (табл. 2), однако различия не были статистически значимыми. Так как в нашем исследовании амплификация гена Her2 выявлена только при I стадии заболевания, выживаемость больных в сопоставлении со статусом гена Her2, CEP17 рассчитана только для группы больных с I стадией заболевания (см. табл. 2). Выживаемость больных Ак при наличии амплификации гена Her2 была ниже по сравнению с больными с другими типами опухоли: по сравнению с типами N и AP различие статистически значимо (p = 0,01), с типом P - близкое к уровню статистической значимости (p = 0,07), вероятно, ввиду крайне малого количества случаев в группе с типом P). Больные Ак при наличии амплификации гена Her2 не пережили 5-летний период после операции. Выживаемость больных не имела статистически значимых различий между типами N, AP и P. При проведении однофакторного регрессионного анализа амплификация гена Her2 была взаимосвязана с выживаемостью больных; взаимосвязь с экспрессией ALK имела тенденцию к статистической значимости (табл. 3). Многофакторный регрессионный анализ показал, что 2 фактора - наибольший размер опухоли и в большей степени амплификация гена Her2 - имели независимое влияние на выживаемость больных Ак (см. табл. 3). Таким образом, в ходе одно- и многофакторного анализа установлено, что наличие амплификации гена Her2 в Ак является неблагоприятным прогностическим фактором. Обсуждение В нашем исследовании при Ак положительная экспрессия ALK определена в 4 (5%) случаях, положительная экспрессия белка Her2 - в 16 (20%) случаях и амплификация гена Her2 - в 7 (9%) случаях, что согласуется с данными литературы [1-4, 8-12]. Мутация гена ALK и амплификация гена Her2 являются факторами, приводящими к активации внутриклеточных сигнальных каскадов и повышению пролиферации, инактивации апоптоза. Повышение пролиферативной активности (по ИМ Ki-67) обнаружено в ALK-положительной Ак [7] и при раке молочной железы [17]. Также выявлена взаимосвязь Her2-положительного рака молочной железы с высоким ИМ Ki-67 [18] и ИМ TopoIIα [19]. Однако в нашем исследовании была обнаружена парадоксальная взаимосвязь - при Ак с наличием мутации гена ALK или амплификацией гена Her2 наблюдалась низкая пролиферативная активность (экспрессии Ki-67 и фермента TopoIIα). Вероятнее всего, повышение пролиферативной активности опухоли является результатом взаимного влияния многих активирующих и инактивирующих сигнальных путей, суммация которых зависит от сочетания изменений в геноме клетки (совместных мутаций, амплификации генов). Поэтому наши результаты совпадают с данными других авторов, показавших взаимосвязь Her2-положительного рака молочной железы с низким ИМ Ki-67 [20]. Как показало наше исследование, выживаемость больных ALK-положительной Ак была ниже по сравнению с ALK-отрицательной, это различие статистически незначимо, вероятно, ввиду небольшого количества случаев для статистического анализа в группе ALK-положительной Ак. В литературных источниках имеются противоречивые данные о выживаемости больных ALK-положительной Ак, не получавших стандартной химиотерапии и специфической таргетной терапии. Одни исследования указывают на низкую выживаемость больных ALK-положительной Ак по сравнению с ALK-отрицательной [10, 11], результаты других исследований, наоборот, свидетельствуют о лучшей выживаемости больных ALK-положительной Ак [12], в ряде исследований не обнаружено различий в выживаемости больных с ALK-положительной и ALK-отрицательной Ак [1]. В нашем исследовании выживаемость больных Ак с наличием амплификации гена Her2 была ниже по сравнению с отсутствием амплификации и взаимо-связана с неблагоприятным прогнозом. В настоящее время прогностическая значимость амплификации гена Her2 при Ак чётко не определена. В некоторых исследованиях обнаружено, что амплификация гена Her2 является неблагоприятным фактором, связанным с низким показателем выживаемости и неблагоприятным прогнозом [4, 9], в других исследованиях не выявлено такой взаимосвязи [3, 8]. Выживаемость больных Ак с положительной экспрессией белка Her2 была ниже по сравнению с отрицательной (различие статистически недостоверно), что также сообщается в работах других авторов [3, 8]. Примечательными представляются данные нашего исследования о сочетании низкой пролиферативной активности с низкой выживаемостью больных при ALK-положительной и Her2-положительной Ак. По нашему мнению, пролиферативная активность в большей степени ассоциируется с ростом и инвазивностью первичной опухоли и в меньшей степени - с метастатическим потенциалом. Вероятно, наличие изменений в генах ALK и Her2 связано с высокой агрессивностью Ак без увеличения пролиферативной активности. Таким образом, мутация гена ALK и амплификация гена Her2 связаны с пролиферативной активностью и выживаемостью больных Ак. Выводы 1. При Ак с положительной экспрессией белка ALK и амплификацией гена Her2 отмечена низкая пролиферативная активность (по индексу метки Ki-67 и топоизомеразы IIα). 2. Выживаемость больных Ак была меньше при положительной экспрессии белка ALK по сравнению с отрицательной (различие недостоверно). Статистически значимая низкая выживаемость больных отмечена при амплификации гена Her2. 3. При одно- и многофакторном регрессионном анализе амплификация гена Her2 была взаимосвязана с плохим прогнозом.

About the authors

Artak U. Panas’yan

Altai branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; Altai Krai Oncology Centre

Email: urartu26@yandex.ru
MD, Researcher of the Department for the Development of Modern Methods of Treatment in Thoracic Oncology of the Altai Branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; Barnaul, 656049, Russian Federation Barnaul, 656049, Russian Federation; Barnaul, 656043, Russian Federation

D. S Kobyakov

Kogalym municipal hospital

Kogalym, 628481, Russian Federation

A. M Avdalyan

Altai branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, 656049, Russian Federation

A. A Ivanov

Altai branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, 656049, Russian Federation

E. L Lushnikova

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

M. A Bakarev

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

A. F Lazarev

Altai branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, 656049, Russian Federation

References