EXPRESSION OF MARKERS OF APOPTOSIS (P53, BCL-2, BAX) AND PROLIFERATION (KI-67, TOPOISOMERASE IIA, ARGYROPHILIC PROTEINS OF NUCLEOLAR ORGANIZER REGIONS) IN HEALTHY PERSONS AND NON-SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS AND THEIR RELATIONSHIP WITH SOME CLINICAL AND MORPHOLOGICAL PARAMETERS



Cite item

Abstract

Study of markers of apoptosis and proliferation in relation to clinical and morphological parameters in non-small cell cancer (NSCLC) patients and healthy persons. There were investigated 237 surgery samples of NSCLC and 10 cases of normal lung tissues. p53, bcl-2, bax, Ki-67, topoisomerase IIα (ТороIIα) levels were determined by immunohistochemical method. Argyrophilic proteins associated with nucleolar organizer regions (AgNOR) were detected with silver nitrate. In NSCLC expression of p53, bcl-2, Ki-67, TopoIIα, AgNOR increased and expression of bax was lower if compared with the normal tissue. Expression of apoptotic markers (p53, bcl-2, bax) correlated with clinical and morphological parameters of NSCLC: histogenesis, N index and the stage (for bcl-2), gender (for bax). Expression of Ki-67 and TopoIIα correlated with gender, largest size of the tumor, histogenesis and differentiation. AgNOR proteins were interrelated with the gender, T and N indices, largest tumor dimension, stage, histogenesis and differentiation. In NSCLC cases the expression of apoptotic markers correlated with proliferation: in p53 positive tumors - high level of proliferation (Ki-67, TopoIIα, AgNOR), in bcl-2 positive tumors - low AgNOR, in bax positive tumors - low proliferative activity (Ki-67, TopoIIα). In NSCLC there is observed the change in expression of apoptotic markers (p53, bcl-2, bax) and proliferation (Ki-67, TopoIIα, AgNOR) in conjunction with normal tissue and clinical and morphological parameters of tumor.

Full Text

Актуальность. Не менее 80% рака лёгкого приходится на немелкоклеточный рак лёгкого (НМКРЛ), результаты лечения которого и соответственно выживаемость больных с этой патологией далеки от желаемых. В связи с этим актуальным является исследование взаимосвязи клинико-морфологических параметров по системе TNM и молекулярно-биологических маркёров, связанных с клеточным циклом, в норме и при НМКРЛ. Развитие апоптоза - запрограммированной гибели клетки - возможно двумя путями: рецепторным и митохондриальным. Белок р53 является транскрипционным фактором, регулирующим функцию большинства генов и выполняющим супрессорную функцию (остановка клеточного цикла, репарация ДНК и апоптоз). Bcl-2 - антиапоптотический белок, а bax - проапоптотический белок митохондриального пути активации апоптоза. Активация bax происходит через белок р53, а инактивация - через димеризацию с белком bcl-2. В настоящее время существуют определенные трудности в достоверной оценке пролиферативного потенциала опухоли, так как пролиферация включает в себя не только количество пролиферирующих клеток (пролиферативная активность, фракция роста), но и скорость прохождения клеткой фаз митоза (продолжительность клеточного цикла). Для оценки пролиферативной активности общепризнанным и доступным является иммуногистохимическое (ИГХ) определение уровня антигена Ki-67. Антиген Ki-67 выявляется в клетках в позднюю G1-, S-, G2-, М-фазы, однако функциональное значение этого ядерного белка в процессе пролиферации до конца не известно. Фермент топоизомераза IIα (ТороIIα) - белок с ферментативной активностью, участвующий в топологической сборке и распутывании нитей ДНК во время транскрипции, конденсации и сегрегации хромосом. Выявляется в клетках в S-, G2-, M-фазы клеточного цикла, в связи с чем является также маркёром пролиферативной активности. Аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белки), являются маркёром скорости клеточного цикла. До 75% окрашивания Ag-ЯОР-белков происходит за счёт двух главных аргирофильных белков: С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК. Эти белки выявляются в ядрах клеток во все фазы клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5-3 раза в S- и G2-фазы. Показана обратная зависимость между количественным содержанием Ag-ЯОР-белков и длительностью клеточного цикла, временем удвоения опухоли. Анализ существующей литературы показал противоречивый характер связи маркёров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα и Ag-ЯОР-белков) с клинико-морфологическими параметрами при НМКРЛ: возрастно-половыми отличиями, стадией процесса, гистогенетическим типом рака, а уровень экспрессии белков в неизменённом бронхоальвеолярном эпителии в мировой литературе освещён крайне скудно, что затрудняет исследование динамических изменений от нормы до развёрнутых стадий рака [1-9]. Кроме того, отсутствуют работы, уточняющие взаимную связь маркёров апоптоза (p53, bcl-2, bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα, Ag-ЯОР-белков) при НМКРЛ. Исходя из вышеизложенного, целью работы стало исследование маркёров апоптоза (p53, bcl-2, bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα, Ag-ЯОР-белков) во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ и в норме. Материал и методы Исследованы 237 операционных материалов НМКРЛ, удаленных за период 2007-2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 35 до 75 лет), мужчин - 203 (86%), женщин - 34 (14%). Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно классификации TNM 7-го пересмотра [10] и представлена в табл. 1. В качестве контроля исследованы кусочки патологически неизменённой ткани лёгкого в 10 случаях, полученные из отдалённых от опухоли участков. Кусочки ткани фиксировали 18-24 ч в 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом/альциановым синим по Крейбергу. Для уточнения гистогенеза опухоли и с дифференциально-диагностической целью ИГХ-методом определяли цитокератины 7 (клон SP52), 20 (клон SP33), High Molecular Weight (клон 34βE12), цитокератины 5/6 (клон D5 16B4) в автостейнере Ventana XT (контроль окрашивания - эпидермис кожи и слизистая оболочка желудка). Также окрашивали на Ki-67 (клон MIB-1), ТороIIα (клон JS5B4), р53 (клон DO-7, Dako), bcl-2 (клон 124, Dako) и bax (клон SP47, SpringBio). В каждом случае исследовали 1000 клеток в 5-7 полях зрения при увеличении в 400 раз. Определяли индекс метки (ИМ) - долю положительно окрашенных клеток от общего количества подсчитанных клеток в процентах (для Ki-67, ТороIIα, р53 - ядерное окрашивание, для bcl-2, bax - цитоплазматическое). Для маркёров апоптоза р53, bcl-2 и bax индекс метки более 10% считался положительной экспрессией антигена в опухоли [5]. Для изучения Ag-ЯОР-белков срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике [11]. Перед окрашиванием срезы автоклавировали при 120 °C в течение 20 мин в 0,01 М цитратном буфере (рН 6,0) [11]. Определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм2) в ядрах 100-120 клеток с 10-15 цифровых изображений, полученных при увеличении микроскопа в 1000 раз (объектив 100/1,25 Oil). Компьютерный анализ изображений проводили в программе ImageJ 1.42. В качестве внутреннего контроля окрашивания использовали площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов [12]. Находили индекс площади (ИП) Ag-ЯОР-белков - частное от деления площадей Ag-ЯОР-белков в клетке опухоли и малом лимфоците. Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica 6.0. Так как распределение ИП Ag-ЯОР-белков было параметрическим, то данные представляли в виде среднего и стандартного отклонения. Поскольку распределение ИМ Ki-67 и ТороIIα было непараметрическим, то данные представляли в виде медианы и интерквартильного интервала. Применяли непараметрические методы: однофакторный тест Краскела-Уоллиса, U-тест Манна-Уитни, двухсторонний критерий Фишера, коэффициент корреляции рангов Спирмена (r). Различия оценивали как достоверные при p < 0,05. Результаты Результат ИГХ-окраски определялся в виде ядерного (Ki-67, ТороIIα и р53) или цитоплазматического (bcl-2 и bax) окрашивания. Результат окраски азотнокислым серебром определялся в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне коричневого ядрышка или бледно-желтого ядра (см. рисунок на 4-й полосе вклейки). В ядрах малых лимфоцитов чаще определялась одна гранула серебра, реже две. Средняя площадь Ag-ЯОР-белков в ядре малого лимфоцита равнялась 1,48 ± 0,12 мкм2. В ядрах клеток патологически не измененного эпителия альвеол отсутствовала экспрессия p53, bcl-2 и bax. В эпителии бронхов отсутствовали p53-положительные клетки, bcl-2-положительные клетки определялись только в базальном слое (ИМ bcl-2 - менее 10%), bax-положительные клетки определялись во всех слоях (ИМ bax - более 90%). В клетках НМКРЛ положительная экспрессия p53 составила 104 (44%) случая, bcl-2 - 43 (18%) случая и bax - 130 (55%) случаев (рисунок). В клетках НМКРЛ наблюдалось снижение экспрессии bax (по сравнению с эпителием бронхов) и повышение экспрессии p53 и bcl-2 по сравнению с патологически не измененным эпителием альвеол и бронхов (p < 0,001). В ядрах клеток патологически не измененного эпителия альвеол ИМ Ki-67 и ТороIIα составил менее 1% (единичные положительные клетки), ИП Ag-ЯОР-белков - 1,31 ± 0,2. В эпителии бронхов ИМ Ki-67 составил 4 (1-8)%, ИМ ТороIIα - менее 1% (единичные положительные клетки), ИП Ag-ЯОР-белков - 1,85 ± 0,24. В клетках НМКРЛ ИМ Ki-67 составил 25 (18-42)%, ИМ ТороIIα - 19 (12-27)% и ИП Ag-ЯОР-белков - 6,52 ± 1,66 (см. рисунок). В клетках НМКРЛ наблюдалось повышение ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα и ИП Ag-ЯОР-белков по сравнению с таковыми патологически не измененного эпителия альвеол и бронхов (p < 0,001). При анализе взаимосвязи маркёров найдена корреляция экспрессии р53, bcl-2 и bax с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ: экспрессия bcl-2 и р53 выше при плоскоклеточном раке, экспрессия bax выше при аденокарциноме и раке у женщин, экспрессия bcl-2 выше при отсутствии метастазов (N0) и при I стадии (см. табл. 1). В НМКРЛ гистогенез имел слабую корреляцию с р53, bcl-2 и bax, показатель N и стадия процесса - с bcl-2 (p < 0,05). Отсутствовала корреляция между маркёрами апоптоза р53, bcl-2 и bax. В НМКРЛ найдены статистически значимые отличия ИМ Ki-67 и ТороIIα в следующих группах: пол, размер опухоли, гистогенез, дифференцировка. ИП Ag-ЯОР-белков имел отличия при всех клинико-морфологических параметрах рака: пол, показатели Т, N, наибольший размер опухоли, стадия заболевания, гистогенез и дифференцировка опухоли (см. табл. 1). ИМ Ki-67 и ТороIIα коррелировал с полом, наибольшим размером опухоли, гистогенезом и дифференцировкой (p < 0,01). ИП Ag-ЯОР-белков коррелировал с полом, показателем Т, наибольшим размером опухоли, показателем N, стадией заболевания, гистогенезом и дифференцировкой (p < 0,001). В НМКРЛ найдена корреляция между маркёрами пролиферации - ИП Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα (p < 0,001). Найдено увеличение пролиферации в НМКРЛ с положительной экспрессией р53. При положительной экспрессии bcl-2 уменьшается активность ядрышковых организаторов, а при положительной экспрессии bax - пролиферативная активность (см. ИМ Ki-67 и ТороIIα) (табл. 2). В НМКРЛ найдена статистически значимая корреляция между маркёрами апоптоза (p53, bcl-2, bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα, Ag-ЯОР-белков): между ИП Ag-ЯОР-белков и р53, bcl-2; между ИМ Ki-67 и р53, bax; между ИМ ТороIIα и р53, bax. Обсуждение При НМКРЛ по сравнению с патологически не измененным эпителием изменяется экспрессия маркёров апоптоза (p53, bcl-2 и bax), что, вероятно, приводит к нарушениям в процессе клеточной гибели и иммортализации раковых клеток. Также при НМКРЛ по сравнению с патологически не измененным эпителием увеличивается количество пролиферирующих клеток (по уровню ИМ Ki-67 и ТороIIα) и изменяется активность ядрышкового аппарата клетки (ИП Ag-ЯОР-белков), что в сочетании с множеством других механизмов приводит к увеличению пула опухолевых клеток. Эти данные имеют дифференциально-диагностическое значение при исследовании патогистологического материала из легкого. Аналогичные результаты получены в других исследованиях [4, 8, 13-15]. Экспрессия bax и маркёров пролиферации значимо взаимосвязана с полом больных НМКРЛ. Данных, говорящих о том, что рак лёгкого является гормонозависимым, нет, но механизмы его развития во многом связаны с гендерными особенностями образа жизни, что и приводит к гетерогенности опухолевых пулов. Данный факт необходимо учитывать при анализе данных маркёров при НМКРЛ. Экспрессия маркёров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) взаимосвязана с гистогенезом НМКРЛ, что, вероятно, отражает взаимосвязь особенностей генетических нарушений и гистогенеза опухоли. Эти результаты подтверждаются данными мировой литературы [5, 7]. В нашем исследовании найдена высокая экспрессия белка bcl-2 в опухолях без метастазов и при I стадии НМКРЛ. Аналогичные данные получены в других исследованиях [3, 6]. Нами не найдена корреляция между маркерами апоптоза p53, bcl-2 и bax, что согласуется с данными других исследований [3] и указывает на их независимую экспрессию в НМКРЛ. Пролиферативная активность (Ki-67, ТороIIα) увеличивается при увеличении размера и солидизации опухоли (умеренная/низкая по сравнению с высокой дифференцировкой), а также в плоскоклеточном раке по сравнению с аденокарциномой. Активность ядрышкового аппарата клетки взаимосвязана со всеми клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ. Наши результаты подтверждаются данными других исследований [1, 2, 9]. Эти данные могут быть использованы в качестве дополнительного дифференциально-диагностического критерия при разграничении клинико-морфологических параметров по системе TNM в НМКРЛ. Найденная нами корреляция между маркёрами пролиферации подтверждает значимость их совместного исследования при изучении пролиферативного потенциала НМКРЛ. Для p53-положительного НМКРЛ характерна высокая пролиферативная активность (Ki-67, ТороIIα) и активность ядрышковых организаторов. Y. Ohmura и соавт. также нашли взаимосвязь экспрессии p53 и Ki-67 [6]. Поскольку не менее чем в 70% p53-положительного НМКРЛ определяются точечные мутации гена p53, то возникновение мутации в гене p53 приводит как к снижению апоптоза, так и к увеличению пролиферации, что проявляется в более неблагоприятном прогнозе при таких опухолях. При bcl-2-положительном НМКРЛ найдена низкая активность ядрышковых организаторов, а при bax-положительном - низкая пролиферативная активность (Ki-67, ТороIIα). Полученные данные согласуются с благоприятным прогнозом при bcl-2-положительном НМКРЛ. Данный факт, а также высокая экспрессия bcl-2 при N0 и I стадиях рака труднообъяснимы, поскольку bcl-2 - это антиапоптотический белок. Поэтому наши данные в какой-то степени объясняют данный феномен. Таким образом, при НМКРЛ наблюдается изменение экспрессии маркёров апоптоза (p53, bcl-2, bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα, Ag-ЯОР-белков) во взаимосвязи с нормой и с клинико-морфологическими параметрами опухоли. Выводы 1. При НМКРЛ изменяется экспрессия маркёров апоптоза и пролиферации по сравнению с нормой: повышается экспрессия p53, bcl-2 и снижается экспрессия bax; повышается уровень пролиферации по экспрессии Ki-67, ТороIIα и Ag-ЯОР-белков. 2. Экспрессия маркёров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) взаимосвязана с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ: гистогенезом, показателем N и стадией (для bcl-2), полом (для bax). Экспрессия Ki-67 и ТороIIα взаимосвязана с полом, наибольшим размером опухоли, гистогенезом и дифференцировкой. Ag-ЯОР-белки взаимосвязаны с полом, показателями T и N, наибольшим размером опухоли, стадией, гистогенезом и дифференцировкой. 3. При НМКРЛ экспрессия маркёров апоптоза взаимосвязана с пролиферацией: в р53- положительных опухолях - высокая пролиферация (Ki-67, ТороIIα и Ag-ЯОР-белков), в bcl-2-положительных опухолях - низкая активность ядрышковых организаторов, в bax-положительных опухолях - низкая пролиферативная активность (Ki-67, ТороIIα).
×

About the authors

Artak U. Panasyan

Altaysky branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; Altai Oncology Center

Email: urartu26@yandex.ru
Researcher of the Department for the Development of New Methods of Treatment in Thoracic Oncology, Barnaul, 656049, Russian Federation Barnaul, 656049, Russian Federation; Barnaul, 656043, Russian Federation

D. S Kobyakov

Kogalym City Hospital

Kogalym, 62848, Russian Federation

A. M Avdalyan

Altaysky branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, 656049, Russian Federation

A. A Ivanov

Altaysky branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, 656049, Russian Federation

E. L Lushnikova

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

M. A Bakarev

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

A. F Lazarev

Altaysky branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, 656049, Russian Federation

References

  1. Коган Е.А., Швец С.И., Коваленко В.Л., Соболева Ю.В. Соотношение процессов пролиферации, апоптоза, ангиогенеза и метастазирования в различных гистогенетических типах рака легкого (иммуногистохимическое исследование). Арх. патол. 2004; 66(6): 33-8.
  2. Carvalho P.E., Antonangelo L., Bernardi F.D., Leao L.E., Rodrigues O.R., Capelozzi V.L. Useful prognostic panel markers to express the biological tumor status in resected lung adenocarcinomas. J. Clin. Oncol. 2000; 30(11): 478-86.
  3. Groeger A.M., Esposito V., De Luca A., Cassandro R., Tonini G., Ambrogi V. et al. Prognostic value of immunohistochemical expression of p53, bax, Bcl-2 and Bcl-xL in resected non-small-cell lung cancers. Histopathology. 2004; 44(1): 54-63.
  4. Jeanmart M., Lantuejoul S., Fievet F., Moro D., Sturm N., Brambilla C. et al. Value of immunohistochemical markers in preinvasive bronchial lesions in risk assessment of lung cancer. Clin. Cancer Res. 2003; 9(6): 2195-203.
  5. Lai R.S., Wang J.S., Hsu H.K., Chang H.C., Lin C.H., Lin M.H. Prognostic evaluation of the expression of p53 and bcl-2 oncoproteins in patients with surgically resected non-small cell lung cancer. Jpn. J. Clin. Oncol. 2002; 32(10): 393-7.
  6. Ohmura Y., Aoe M., Andou A., Shimizu N. Telomerase activity and Bcl-2 expression in non-small cell lung cancer. Clin. Cancer Res. 2000; 6(8): 2980-7.
  7. Poleri C., Morero J.L., Nieva B., Vazquez M.F., Rodriguez C., de Titto E. et al. Risk of recurrence in patients with surgically resected stage I non-small cell lung carcinoma: histopathologic and immunohistochemical analysis. Chest. 2003; 123(6): 1858-67.
  8. Porebska I., Wyrodek E., Kosacka M., Adamiak J., Jankowska R., Harlozinska-Szmyrka A. Apoptotic markers p53, Bcl-2 and Bax in primary lung cancer. In Vivo. 2006; 20(5): 599-604.
  9. Rodrigues O.R., Antonangelo L., Yagi N., Minamoto H., Schmidt Júnior A.F., Capelozzi V.L. et al. Prognostic significance of argyrophilic nucleolar organizer region (AgNOR) in resected non-small cell lung cancer (NSCLC). Jpn. J. Clin. Oncol. 1997; 27(5): 298-304.
  10. Sobin L., Gospodarowicz M., Wittekind C. TNM Classification of Malignant Tumours. 7th Ed. Oxford, Wiley-Blackwell. 2009: 138-46.
  11. Trere D. AgNOR staining and quantification. Micron. 2000; 31(2): 127-31.
  12. Derenzini M., Trere D. Standardization of interphase Ag-NOR measurement by means of an automated image analysis system using lymphocytes as an internal control. J. Pathol. 1991; 165(4): 337-42.
  13. Лазарев А.Ф., Бобров И.П., Климачев В.В., Лубенников В.А. Характеристика ядрышкового аппарата опухолевых клеток при раке желудка. Арх. патол. 2002; 64(6): 30-2.
  14. Лазарев А.Ф., Кобяков Д.С., Климачев В.В., Авдалян А.М., Бобров И.П. Аргирофильные белки районов ядрышковых организаторов в аденомах с различной степенью дисплазии и аденокарциноме толстой кишки. Арх. патол. 2010; 72(4): 16-20.
  15. D’Amico T.A., Aloia T.A., Moore M.B.H., Herndon J.E., Brooks K.R., Lau C.L. et al. Molecular biologic substaging of stage I lung cancer according to gender and histology. Ann. Thorac. Surg.2000; 69(6): 882-6.

Copyright (c) 2017 Eco-Vector



СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: № 014159 от 23.10.1995 г
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ЭЛ № ФС 77 - 80673 от 23.03.2021 г
.



This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies