EXPRESSION OF MARKERS OF APOPTOSIS (P53, BCL-2, BAX) AND PROLIFERATION (KI-67, TOPOISOMERASE IIA, ARGYROPHILIC PROTEINS OF NUCLEOLAR ORGANIZER REGIONS) IN HEALTHY PERSONS AND NON-SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS AND THEIR RELATIONSHIP WITH SOME CLINICAL AND MORPHOLOGICAL PARAMETERS

Full Text

Актуальность. Не менее 80% рака лёгкого приходится на немелкоклеточный рак лёгкого (НМКРЛ), результаты лечения которого и соответственно выживаемость больных с этой патологией далеки от желаемых. В связи с этим актуальным является исследование взаимосвязи клинико-морфологических параметров по системе TNM и молекулярно-биологических маркёров, связанных с клеточным циклом, в норме и при НМКРЛ. Развитие апоптоза - запрограммированной гибели клетки - возможно двумя путями: рецепторным и митохондриальным. Белок р53 является транскрипционным фактором, регулирующим функцию большинства генов и выполняющим супрессорную функцию (остановка клеточного цикла, репарация ДНК и апоптоз). Bcl-2 - антиапоптотический белок, а bax - проапоптотический белок митохондриального пути активации апоптоза. Активация bax происходит через белок р53, а инактивация - через димеризацию с белком bcl-2. В настоящее время существуют определенные трудности в достоверной оценке пролиферативного потенциала опухоли, так как пролиферация включает в себя не только количество пролиферирующих клеток (пролиферативная активность, фракция роста), но и скорость прохождения клеткой фаз митоза (продолжительность клеточного цикла). Для оценки пролиферативной активности общепризнанным и доступным является иммуногистохимическое (ИГХ) определение уровня антигена Ki-67. Антиген Ki-67 выявляется в клетках в позднюю G1-, S-, G2-, М-фазы, однако функциональное значение этого ядерного белка в процессе пролиферации до конца не известно. Фермент топоизомераза IIα (ТороIIα) - белок с ферментативной активностью, участвующий в топологической сборке и распутывании нитей ДНК во время транскрипции, конденсации и сегрегации хромосом. Выявляется в клетках в S-, G2-, M-фазы клеточного цикла, в связи с чем является также маркёром пролиферативной активности. Аргирофильные белки, ассоциированные с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белки), являются маркёром скорости клеточного цикла. До 75% окрашивания Ag-ЯОР-белков происходит за счёт двух главных аргирофильных белков: С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК. Эти белки выявляются в ядрах клеток во все фазы клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5-3 раза в S- и G2-фазы. Показана обратная зависимость между количественным содержанием Ag-ЯОР-белков и длительностью клеточного цикла, временем удвоения опухоли. Анализ существующей литературы показал противоречивый характер связи маркёров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα и Ag-ЯОР-белков) с клинико-морфологическими параметрами при НМКРЛ: возрастно-половыми отличиями, стадией процесса, гистогенетическим типом рака, а уровень экспрессии белков в неизменённом бронхоальвеолярном эпителии в мировой литературе освещён крайне скудно, что затрудняет исследование динамических изменений от нормы до развёрнутых стадий рака [1-9]. Кроме того, отсутствуют работы, уточняющие взаимную связь маркёров апоптоза (p53, bcl-2, bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα, Ag-ЯОР-белков) при НМКРЛ. Исходя из вышеизложенного, целью работы стало исследование маркёров апоптоза (p53, bcl-2, bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα, Ag-ЯОР-белков) во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ и в норме. Материал и методы Исследованы 237 операционных материалов НМКРЛ, удаленных за период 2007-2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 35 до 75 лет), мужчин - 203 (86%), женщин - 34 (14%). Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно классификации TNM 7-го пересмотра [10] и представлена в табл. 1. В качестве контроля исследованы кусочки патологически неизменённой ткани лёгкого в 10 случаях, полученные из отдалённых от опухоли участков. Кусочки ткани фиксировали 18-24 ч в 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом/альциановым синим по Крейбергу. Для уточнения гистогенеза опухоли и с дифференциально-диагностической целью ИГХ-методом определяли цитокератины 7 (клон SP52), 20 (клон SP33), High Molecular Weight (клон 34βE12), цитокератины 5/6 (клон D5 16B4) в автостейнере Ventana XT (контроль окрашивания - эпидермис кожи и слизистая оболочка желудка). Также окрашивали на Ki-67 (клон MIB-1), ТороIIα (клон JS5B4), р53 (клон DO-7, Dako), bcl-2 (клон 124, Dako) и bax (клон SP47, SpringBio). В каждом случае исследовали 1000 клеток в 5-7 полях зрения при увеличении в 400 раз. Определяли индекс метки (ИМ) - долю положительно окрашенных клеток от общего количества подсчитанных клеток в процентах (для Ki-67, ТороIIα, р53 - ядерное окрашивание, для bcl-2, bax - цитоплазматическое). Для маркёров апоптоза р53, bcl-2 и bax индекс метки более 10% считался положительной экспрессией антигена в опухоли [5]. Для изучения Ag-ЯОР-белков срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике [11]. Перед окрашиванием срезы автоклавировали при 120 °C в течение 20 мин в 0,01 М цитратном буфере (рН 6,0) [11]. Определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм2) в ядрах 100-120 клеток с 10-15 цифровых изображений, полученных при увеличении микроскопа в 1000 раз (объектив 100/1,25 Oil). Компьютерный анализ изображений проводили в программе ImageJ 1.42. В качестве внутреннего контроля окрашивания использовали площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов [12]. Находили индекс площади (ИП) Ag-ЯОР-белков - частное от деления площадей Ag-ЯОР-белков в клетке опухоли и малом лимфоците. Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программы Statistica 6.0. Так как распределение ИП Ag-ЯОР-белков было параметрическим, то данные представляли в виде среднего и стандартного отклонения. Поскольку распределение ИМ Ki-67 и ТороIIα было непараметрическим, то данные представляли в виде медианы и интерквартильного интервала. Применяли непараметрические методы: однофакторный тест Краскела-Уоллиса, U-тест Манна-Уитни, двухсторонний критерий Фишера, коэффициент корреляции рангов Спирмена (r). Различия оценивали как достоверные при p < 0,05. Результаты Результат ИГХ-окраски определялся в виде ядерного (Ki-67, ТороIIα и р53) или цитоплазматического (bcl-2 и bax) окрашивания. Результат окраски азотнокислым серебром определялся в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне коричневого ядрышка или бледно-желтого ядра (см. рисунок на 4-й полосе вклейки). В ядрах малых лимфоцитов чаще определялась одна гранула серебра, реже две. Средняя площадь Ag-ЯОР-белков в ядре малого лимфоцита равнялась 1,48 ± 0,12 мкм2. В ядрах клеток патологически не измененного эпителия альвеол отсутствовала экспрессия p53, bcl-2 и bax. В эпителии бронхов отсутствовали p53-положительные клетки, bcl-2-положительные клетки определялись только в базальном слое (ИМ bcl-2 - менее 10%), bax-положительные клетки определялись во всех слоях (ИМ bax - более 90%). В клетках НМКРЛ положительная экспрессия p53 составила 104 (44%) случая, bcl-2 - 43 (18%) случая и bax - 130 (55%) случаев (рисунок). В клетках НМКРЛ наблюдалось снижение экспрессии bax (по сравнению с эпителием бронхов) и повышение экспрессии p53 и bcl-2 по сравнению с патологически не измененным эпителием альвеол и бронхов (p < 0,001). В ядрах клеток патологически не измененного эпителия альвеол ИМ Ki-67 и ТороIIα составил менее 1% (единичные положительные клетки), ИП Ag-ЯОР-белков - 1,31 ± 0,2. В эпителии бронхов ИМ Ki-67 составил 4 (1-8)%, ИМ ТороIIα - менее 1% (единичные положительные клетки), ИП Ag-ЯОР-белков - 1,85 ± 0,24. В клетках НМКРЛ ИМ Ki-67 составил 25 (18-42)%, ИМ ТороIIα - 19 (12-27)% и ИП Ag-ЯОР-белков - 6,52 ± 1,66 (см. рисунок). В клетках НМКРЛ наблюдалось повышение ИМ Ki-67, ИМ ТороIIα и ИП Ag-ЯОР-белков по сравнению с таковыми патологически не измененного эпителия альвеол и бронхов (p < 0,001). При анализе взаимосвязи маркёров найдена корреляция экспрессии р53, bcl-2 и bax с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ: экспрессия bcl-2 и р53 выше при плоскоклеточном раке, экспрессия bax выше при аденокарциноме и раке у женщин, экспрессия bcl-2 выше при отсутствии метастазов (N0) и при I стадии (см. табл. 1). В НМКРЛ гистогенез имел слабую корреляцию с р53, bcl-2 и bax, показатель N и стадия процесса - с bcl-2 (p < 0,05). Отсутствовала корреляция между маркёрами апоптоза р53, bcl-2 и bax. В НМКРЛ найдены статистически значимые отличия ИМ Ki-67 и ТороIIα в следующих группах: пол, размер опухоли, гистогенез, дифференцировка. ИП Ag-ЯОР-белков имел отличия при всех клинико-морфологических параметрах рака: пол, показатели Т, N, наибольший размер опухоли, стадия заболевания, гистогенез и дифференцировка опухоли (см. табл. 1). ИМ Ki-67 и ТороIIα коррелировал с полом, наибольшим размером опухоли, гистогенезом и дифференцировкой (p < 0,01). ИП Ag-ЯОР-белков коррелировал с полом, показателем Т, наибольшим размером опухоли, показателем N, стадией заболевания, гистогенезом и дифференцировкой (p < 0,001). В НМКРЛ найдена корреляция между маркёрами пролиферации - ИП Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67 и ИМ ТороIIα (p < 0,001). Найдено увеличение пролиферации в НМКРЛ с положительной экспрессией р53. При положительной экспрессии bcl-2 уменьшается активность ядрышковых организаторов, а при положительной экспрессии bax - пролиферативная активность (см. ИМ Ki-67 и ТороIIα) (табл. 2). В НМКРЛ найдена статистически значимая корреляция между маркёрами апоптоза (p53, bcl-2, bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα, Ag-ЯОР-белков): между ИП Ag-ЯОР-белков и р53, bcl-2; между ИМ Ki-67 и р53, bax; между ИМ ТороIIα и р53, bax. Обсуждение При НМКРЛ по сравнению с патологически не измененным эпителием изменяется экспрессия маркёров апоптоза (p53, bcl-2 и bax), что, вероятно, приводит к нарушениям в процессе клеточной гибели и иммортализации раковых клеток. Также при НМКРЛ по сравнению с патологически не измененным эпителием увеличивается количество пролиферирующих клеток (по уровню ИМ Ki-67 и ТороIIα) и изменяется активность ядрышкового аппарата клетки (ИП Ag-ЯОР-белков), что в сочетании с множеством других механизмов приводит к увеличению пула опухолевых клеток. Эти данные имеют дифференциально-диагностическое значение при исследовании патогистологического материала из легкого. Аналогичные результаты получены в других исследованиях [4, 8, 13-15]. Экспрессия bax и маркёров пролиферации значимо взаимосвязана с полом больных НМКРЛ. Данных, говорящих о том, что рак лёгкого является гормонозависимым, нет, но механизмы его развития во многом связаны с гендерными особенностями образа жизни, что и приводит к гетерогенности опухолевых пулов. Данный факт необходимо учитывать при анализе данных маркёров при НМКРЛ. Экспрессия маркёров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) взаимосвязана с гистогенезом НМКРЛ, что, вероятно, отражает взаимосвязь особенностей генетических нарушений и гистогенеза опухоли. Эти результаты подтверждаются данными мировой литературы [5, 7]. В нашем исследовании найдена высокая экспрессия белка bcl-2 в опухолях без метастазов и при I стадии НМКРЛ. Аналогичные данные получены в других исследованиях [3, 6]. Нами не найдена корреляция между маркерами апоптоза p53, bcl-2 и bax, что согласуется с данными других исследований [3] и указывает на их независимую экспрессию в НМКРЛ. Пролиферативная активность (Ki-67, ТороIIα) увеличивается при увеличении размера и солидизации опухоли (умеренная/низкая по сравнению с высокой дифференцировкой), а также в плоскоклеточном раке по сравнению с аденокарциномой. Активность ядрышкового аппарата клетки взаимосвязана со всеми клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ. Наши результаты подтверждаются данными других исследований [1, 2, 9]. Эти данные могут быть использованы в качестве дополнительного дифференциально-диагностического критерия при разграничении клинико-морфологических параметров по системе TNM в НМКРЛ. Найденная нами корреляция между маркёрами пролиферации подтверждает значимость их совместного исследования при изучении пролиферативного потенциала НМКРЛ. Для p53-положительного НМКРЛ характерна высокая пролиферативная активность (Ki-67, ТороIIα) и активность ядрышковых организаторов. Y. Ohmura и соавт. также нашли взаимосвязь экспрессии p53 и Ki-67 [6]. Поскольку не менее чем в 70% p53-положительного НМКРЛ определяются точечные мутации гена p53, то возникновение мутации в гене p53 приводит как к снижению апоптоза, так и к увеличению пролиферации, что проявляется в более неблагоприятном прогнозе при таких опухолях. При bcl-2-положительном НМКРЛ найдена низкая активность ядрышковых организаторов, а при bax-положительном - низкая пролиферативная активность (Ki-67, ТороIIα). Полученные данные согласуются с благоприятным прогнозом при bcl-2-положительном НМКРЛ. Данный факт, а также высокая экспрессия bcl-2 при N0 и I стадиях рака труднообъяснимы, поскольку bcl-2 - это антиапоптотический белок. Поэтому наши данные в какой-то степени объясняют данный феномен. Таким образом, при НМКРЛ наблюдается изменение экспрессии маркёров апоптоза (p53, bcl-2, bax) и пролиферации (Ki-67, ТороIIα, Ag-ЯОР-белков) во взаимосвязи с нормой и с клинико-морфологическими параметрами опухоли. Выводы 1. При НМКРЛ изменяется экспрессия маркёров апоптоза и пролиферации по сравнению с нормой: повышается экспрессия p53, bcl-2 и снижается экспрессия bax; повышается уровень пролиферации по экспрессии Ki-67, ТороIIα и Ag-ЯОР-белков. 2. Экспрессия маркёров апоптоза (p53, bcl-2 и bax) взаимосвязана с клинико-морфологическими параметрами НМКРЛ: гистогенезом, показателем N и стадией (для bcl-2), полом (для bax). Экспрессия Ki-67 и ТороIIα взаимосвязана с полом, наибольшим размером опухоли, гистогенезом и дифференцировкой. Ag-ЯОР-белки взаимосвязаны с полом, показателями T и N, наибольшим размером опухоли, стадией, гистогенезом и дифференцировкой. 3. При НМКРЛ экспрессия маркёров апоптоза взаимосвязана с пролиферацией: в р53- положительных опухолях - высокая пролиферация (Ki-67, ТороIIα и Ag-ЯОР-белков), в bcl-2-положительных опухолях - низкая активность ядрышковых организаторов, в bax-положительных опухолях - низкая пролиферативная активность (Ki-67, ТороIIα).

About the authors

Artak U. Panasyan

Altaysky branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; Altai Oncology Center

Email: urartu26@yandex.ru
Researcher of the Department for the Development of New Methods of Treatment in Thoracic Oncology, Barnaul, 656049, Russian Federation Barnaul, 656049, Russian Federation; Barnaul, 656043, Russian Federation

D. S Kobyakov

Kogalym City Hospital

Kogalym, 62848, Russian Federation

A. M Avdalyan

Altaysky branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, 656049, Russian Federation

A. A Ivanov

Altaysky branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, 656049, Russian Federation

E. L Lushnikova

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

M. A Bakarev

Institute of Molecular Pathology and Pathomorphology

Novosibirsk, 630117, Russian Federation

A. F Lazarev

Altaysky branch of the N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Barnaul, 656049, Russian Federation

References

Supplementary files