IDENTIFICATION OF CELLS OBTAINED FROM BLOOD OF ONCOLOGICAL PATIENTS WITH HEMOCYTOFILTRATION

Full Text

Попавшие в кровь клетки злокачественного новообразования, которые начинают мигрировать в крови, получили название циркулирующих опухолевых клеток - ЦОК (circulating tumor cells, CTC). Факт обнаружения опухолевых клеток в кровяном русле известен давно. Учёные-онкологи и медицинские лабораторные работники неоднократно в мировой и отечественной практике возвращались к научным исследованиям по обнаружению и оценке опухолевых клеток в кровяном русле. ЦОК представляют собой популяцию гетерогенных клеток опухоли, попавших в кровяное русло. Проникнуть в кровяное русло опухолевые клетки могут при условии их эпителиально-мезенхимальной трансформации, когда они утрачивают межклеточную адгезию и приобретают способность аномальной подвижности и инвазивности [1-4]. Предполагается, что именно эти клетки являются основой для развития метастазов в различных органах [1-4]. Феномен эпителиально-мезенхимального перехода встречается в физиологических условиях (эмбриональный морфогенез), при различных видах воспаления, формировании фиброза, а также является неотъемлемой частью канцерогенеза (3-й тип по классификации R. Weinberg). ЦОК в периферической крови изучаются в клинических исследованиях для определения их роли в канцерогенезе, как прогностические и предиктивные показатели в клинической практике, а также как потенциальный маркёр, позволяющий оценивать эффективность системного лечения [5-7]. В научной литературе имеется множество работ, посвящённых изучению и оценке ЦОК в крови онкологических больных. Наибольшее число исследований оценки ЦОК отмечено при раке молочной железы [1, 8-10]. Исследователи пришли к выводу, что динамика ЦОК в процессе лекарственного лечения пациенток с диагнозом «рак молочной железы» является перспективным направлением в контексте раннего прогнозирования ответа на предоперационную терапию у пациенток с местно-распространёнными формами заболевания, что является дополнительным объективным критерием оценки эффективности лечения [8-10]. Имеются работы по исследованию ЦОК при раке лёгких, желудка, прямой кишки, яичника, мочевого пузыря, меланоме и других опухолях [2, 11-13]. Практически во всех клинических исследованиях указывается, что наличие ЦОК в крови коррелирует с неблагоприятными патологическими особенностями и является ценным прогностическим и предиктивным маркёром, позволяющим прогнозировать выживаемость пациентов. Изменение количества ЦОК, рассчитанное до и после лечения, является показателем ответа на терапию и прогноз, мощным инструментом для мониторинга прогрессирования заболевания и выживаемости [2, 11-14]. Существует множество различных методов обнаружения ЦОК в крови больных [15]. Однако даже в настоящее время клинические исследования, посвящённые изучению ЦОК, ограничены отсутствием доступных технологий их обнаружения. Методологических стандартов выявления ЦОК не существует, а методики, доступные для применения в практической онкологии, не обладают надежной технологической платформой, высокой пропускной способностью, чувствительностью и специфичностью, а также сложны в воспроизведении и дороги, т. е. не полностью отвечают задачам клиники [2, 16, 17]. Чувствительное и точное обнаружение ЦОК остаётся сложной проблемой в клинической онкологии [18, 19]. Новая эффективная технология - жидкостная биопсия (CancerIntercept) значительно отличается от методики определения самих ЦОК, в основе которой лежит анализ следовых количеств ДНК опухолевых клеток, свободно циркулирующих в крови. Технология автоматической цифровой микроскопии (ADM) позволяет оптическим методом оценивать количество ЦОК в образце [1]. Процесс занимает достаточно много времени при сканировании больших по площади цитологических препаратов, что для практического применения не пригодно, поэтому технологию усовершенствовали и разработали массивное оптоволоконное сканирование (FAST). Новый подход позволяет просканировать за то же время в 500 раз большую площадь по сравнению с технологией ADM без потери чувствительности [1]. Использование FAST и ADM совместно позволяет выявить редкие опухолевые клетки после предварительной обработки флуоресцентно-меченными антителами к цитокератинам [20]. Другой метод обнаружения ЦОК под названием MAINTRAC заключается в использовании сканирующей лазерной цитометрии образцов крови, прошедших процедуру окрашивания антителами против клеток, экспрессирующих эпителиальные молекулы клеточной адгезии (EpCAM), и против лейкоцитов (CD45) [1, 21]. Одним из наиболее популярных методов определения ЦОК в крови является система CellSearch компании Veridex [22]. Система является полуавтоматической, в её основе лежат методы иммунофлуоресценции, иммуномагнитного разделения и проточной цитометрии [23]. Данная технология прошла экспертизу и была одобрена для выявления уровня ЦОК у пациентов с метастазами (Food and Drug Administration, FDA, США), однако разрешения для клинического использования система до сих пор не получила. Система CellSearch позволяет не только отделить лейкоциты от эпителиальных опухолевых клеток, но и подсчитать последние. Предел чувствительности прибора составил 5 ЦОК и более на 7,5 мл крови [22, 24]. Следует отметить, что исследование ЦОК на оборудовании CellSearch дорогостоящее и трудозатратное, что ограничивает возможности более широкого его использования. Кроме описанных методов определения ЦОК, также в научных исследованиях используют иммуномагнитные методы, примером которых служат системы MACS, RosseteSep, OncoQuick+, AdnaGen [25, 26]. Обнаружение ЦОК напрямую зависит от технических характеристик метода, используемого для их выделения. В настоящее время технологии совершенствуются в сторону получения недеформированных, более сохранных клеток, поскольку часто при выделении ЦОК они деформируются и разрушаются [27]. Одной из самых сложных задач является точное определение характера циркулирующих клеток (ЦК), выделенных из крови. Необходим немалый опыт исследователя, изучающего ЦК. Также необходимо использование дополнительных методик для подтверждения злокачественной природы и типа выделенных клеток [28, 29]. Феномен эпителиально-мезенхимального перехода оказывает влияние на формирование гетерогенности ЦОК, создаёт технические трудности их обнаружения и фенотипирования. Во время эпителиально-мезенхимального перехода происходят морфологические трансформации, проявляющиеся изменением размера и формы клеток, наблюдаются полиморфизм клеток и ядер, гиперхроматоз и гиперплоидность, а также отмечается увеличение их митотической активности. Большая часть ЦОК теряет свои эпителиальные антигены и начинает экспрессировать мезенхимальные антигены [30-32]. Цитологическое обнаружение ЦОК в зависимости от размера (выделение по размеру эпителиальных опухолевых клеток [ISET]) представляется очень эффективной процедурой, обеспечивающей высокую точность и чувствительность в дополнение к её простоте, быстроте и низкой стоимости. Хотя цитологический анализ предсказуемо более точен, чем антиген-опосредованный ЦОК-захват, основанный на отсутствии специфичности антител для опухолевых клеток, всё же необходимо уточнение возможности распознавания ЦОК с помощью цитологических критериев злокачественности, которые уже используются в традиционной цитологии. При выделении крупных клеток из крови возможно выделение редких гематологических (таких как мегакариоциты или крупные моноциты) или мезенхимальных (как эндотелиальные) клеток, которые невозможно определить с помощью существующих гематологических анализов и трудно отличить от эпителиальных опухолевых клеток [30]. Исходя из вышесказанного, мы запланировали провести сравнительное цитологическое исследование образцов крови пациентов, обратившихся в онкологический диспансер, у которых цитологическим или гистологическим методом диагностирована злокачественная опухоль. Цель работы - оценить возможность цитологической идентификации клеток, полученных из крови онкологических пациентов при гемоцитофильтрации. Материал и методы Материалом для исследования служила кровь 48 пациентов с установленным онкологическим заболеванием (38 мужчин и 10 женщин) в возрасте от 34 до 84 лет. У всех пациентов было морфологическое подтверждение злокачественной опухоли. Для проведения гемофильтроцитологического исследования использовали устройство для микропросеивания венозной крови (патент на изобретение № 2414710, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений РФ 20.03.2011 года). Для выделения циркулирующих клеток всем пациентам производился забор не менее 7,5 мл венозной крови в пробирки с этилендиаминтетрауксусной кислотой, после чего в течение 30-60 мин кровь доставлялась в лабораторию. При пропускании цельной крови через фильтр с порами 6000 нм в диаметре выделяются циркулирующие клетки, которые задерживаются на фильтре. В результате микропросеивания крови на фильтре остаются клетки (или фрагменты клеток), отличимые от клеточных компонентов крови по размеру. Из осадка на фильтре готовили цитологические препараты в количестве 4-5 мазков-отпечатков, которые окрашивали по методу Паппенгейма. В некоторых случаях проводили иммуноцитохимические исследования с применением стандартных методик проведения иммуноцитохимических реакций. В этих случаях были приготовлены 5 препаратов после микрофильтрации венозной крови для стандартной микроскопии и 4 препарата с применением цитоцентрифуги Cytospin-4. Для визуализации реакции антиген/антитело использовали тест-систему REALTM EnVisionTM («ДАКО»). В качестве хромогена применяли DAB (3,3-diaminobenzidine), после проведения реакции мазки докрашивали гематоксилином. Для оценки возможностей цитологической идентификации клеток, выделенных из крови онкологических пациентов при гемоцитофильтрации, о каждом пациенте были получены необходимые клинические данные из канцер-регистра, амбулаторных карт и историй болезни. Результаты и обсуждение Гемофильтроцитологические исследования проведены у пациентов с верифицированными эпителиальными опухолями. Морфологические варианты рака лёгкого были представлены в 18 наблюдениях аденогенным раком, в восьми - плоскоклеточным и в восьми - мелкоклеточным. Рак желудка диагностирован у семи пациентов, из которых у трёх определён перстневидно-клеточный рак и у четырёх - аденокарцинома. В исследование вошли три женщины с инвазивной карциномой молочной железы неспецифического типа, два пациента с плоскоклеточным раком пищевода, по одному пациенту с аденокарциномой кишечника и аденокарциномой поджелудочной железы, у которых были проведены гемофильтроцитологические исследования (см. таблицу). 12 человек были пролечены по поводу онкологического заболевания, в остальных случаях гемоцитофильтрацию проводили у пациентов, впервые обратившихся в поликлинику онкологического диспансера. ЦК в результате микропросеивания крови на фильтре обнаружены у 21 (43,8%) пациента: у десяти из них аденогенный рак лёгкого, у двух - плоскоклеточный и у четырёх - мелкоклеточный рак, у двух - перстневидно-клеточный рак желудка, по одному наблюдению - инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа, аденокарцинома кишечника и поджелудочной железы (см. таблицу). При цитологическом исследовании на препаратах с наличием ЦК отмечали повышенное количество нейтрофильных гранулоцитов, которое составляло 12-15 в поле зрения, и большое число скоплений тромбоцитов. Количественный анализ на данном этапе исследования не проводили. Количество обнаруженных ЦК в препаратах было различным, максимальное значение 50-70 клеток. Репрезентативными считали препараты, в которых обнаруживали 5 ЦК и более. Обнаруженные ЦК в количестве более 5 клеток на препарате были представлены тремя вариантами клеток: циркулирующие фрагменты клеток в виде «голых» атипизированных ядер - у 16 (76,2%) пациентов (рис. 1, см. 2-ю полосу вклейки); одиночные сохранные опухолевые клетки наблюдали у трёх больных (14,3%) (рис. 2, см. 2-ю полосу вклейки); крупные бесформенные одиночные ЦК, вероятно, неэпителиальной природы - у двух (9,5%). Идентичными по форме и по размеру были циркулирующие фрагменты клеток в виде «голых» атипизированных ядер, специфических признаков принадлежности их к морфологическому типу клеток обнаружить не удалось. По одиночным сохранным опухолевым клеткам при тщательном исследовании можно было предполагать принадлежность клеток к типу опухоли: были отмечены признаки плоскоклеточной дифференцировки (рис. 3, см. 3-ю полосу вклейки) и специфический признак «притёртости» клеток друг к другу при мелкоклеточном раке лёгкого (рис. 4, см. 3-ю полосу вклейки). Проведено сравнение ЦОК с опухолевыми клетками первичного образования. ЦОК были идентичны первичному образованию, диагностированному при цитологическом исследовании опухоли по материалу, полученному при бронхоскопии. Крупные бесформенные одиночные ЦК, вероятно неэпителиальной природы, предположительно являются тромбобластами (инволютивные формы мегакариоцитов) (рис. 5, см. 3-ю полосу вклейки). Также на препаратах были отмечены многочисленные мономорфные клетки среди тромбоцитов, вероятно мезенхимального происхождения, которые весьма напоминают эндотелиальные клетки (рис. 6, см. 3-ю полосу вклейки). Визуализация ЦК представляет собой сложную задачу. Все обнаруженные ЦК в периферической крови имели общие черты, при цитологическом исследовании невозможно исключить, что на мембранах могла оседать примесь эпителиальных и эндотелиальных клеток. Феномен эпителиально-мезенхимальной трансформации оказывает влияние на формирование гетерогенности ЦК, тем самым обуславливает трудности их идентификации при световой микроскопии. В связи с этим фактом были проведены иммуноцитохимические исследования. Иммуноцитохимические исследования проводили с использованием моноклональных антител к эпителиальным антигенам (Epithelial Antigen Сlone Ber-EP4 и Cytokeratin Clone C MNF116), а также поликлонального антитела к раково-эмбриональному антигену (Carcinoembryonic Antigen, poly). В каждом случае были приготовлены 4 препарата с применением цитоцентрифуги Cytospin-4. В результате проведённой световой микроскопии препаратов данных пациентов установлено, что единичных клеток и единичных комплексов, наблюдаемых при микроскопии, оказалось недостаточно для проведения иммуноцитохимических исследований. В связи с этим фактом удалось провести иммуноцитохимические исследования только у пяти пациентов с наличием ЦК при гемоцитофильтрации (см. таблицу). При иммуноцитохимических исследованиях фильтратов периферической крови в трёх случаях отмечен немногочисленный клеточный состав, имеющий позитивное цитоплазматическое окрашивание на эпителиальные антитела и раково-эмбриональный антиген, подтверждающий принадлежность клеток к числу эпителиальных (рис. 7, см. 3-ю полосу вклейки). В двух наблюдениях проведения иммуноцитохимической реакции клеточного состава для интерпретации было недостаточно, а у одиночных голо-ядерных ЦК реакция с эпителиальными антителами отсутствовала. Во всех случаях для окончательного заключения была необходима микроскопическая характеристика всей клетки и её компонентов (мембраны, цитоплазмы, ядра), оценка голоядерных элементов была некорректной. Иммуноцитохимические исследования могут быть использованы для фенотипирования ЦК для выделения не только эпителиальных клеток, но также эндотелиальных клеток и мегакариоцитов. В связи с этим обязательным является и дополнительное окрашивание на общелейкоцитарный антиген CD45 (Leucocyte Common Antigen) Clonеs 2B11+PD7/26.CD45 для исключения тромбобластов, циркулирующих в периферической крови, и виментина (Vimentin Clone V9), позволяющего исключить примесь эндотелиальных клеток. Выводы 1) Полученные нами данные показывают, что цитологическое исследование, используемое в качестве диагностического метода в клинической онкологии, также актуально в области обнаружения ЦК в периферической крови. 2) Идентификация ЦК остаётся сложной задачей и до сих пор ещё недоступна в практическом здравоохранении для рутинного использования. 3) При идентификации ЦК с использованием иммуноцитохимических исследований необходимо достаточное количество (не менее 50-100) ЦК. 4) При идентификации ЦК следует учитывать присутствие в крови клеток, утративших эпителиальные и приобретших мезенхимальные антигены (феномен эпителиально-мезенхимальной трансформации). 5) При иммуноцитохимическом исследовании необходимо использовать кроме эпителиальных антигенов также общелейкоцитарный антиген и виментин.

About the authors

Olga G. Grigoruk

Altai branch of N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; Altai Regional Oncology Dispensary; The Altai State Medical University

Email: cytolakod@rambler.ru
MD, Ph.D., DSci., Head of the Department of Clinical Laboratory Diagnostics (implementation of cytological research methods), Altai Regional Oncology Dispensary, Barnaul, 656043, Russian Federation Barnaul, 656049, Russian Federation; Barnaul, 656043, Russian Federation; Barnaul, 656038, Russian Federation

A. F Lazarev

Altai branch of N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology; Altai Regional Oncology Dispensary; The Altai State Medical University

Barnaul, 656049, Russian Federation; Barnaul, 656043, Russian Federation; Barnaul, 656038, Russian Federation

A. A Chimitov

Buryat Regional Clinical Oncology Dispensary

Ulan-Ude, 670047, Russian Federation

T. D Khankhashanova

Buryat Regional Clinical Oncology Dispensary

Ulan-Ude, 670047, Russian Federation

L. M Bazulina

Altai Regional Oncology Dispensary

Barnaul, 656043, Russian Federation

Ya. N Shoykhet

The Altai State Medical University

Barnaul, 656038, Russian Federation

References

Supplementary files