In vivo antitumor effects of bis-benzimidazole derivatives in mouse melanoma and lung cancer models

Full Text

Обоснование

Бензимидазол представляет собой ароматическое соединение, состоящее из имидазольного кольца, конденсированного с бензольным циклом в 4- и 5-м положениях. Впервые синтезирован в XIX веке, а в настоящее время является компонентом 13 лекарственных препаратов, одобренных Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США (FDA) [1, 2]. В России производные бензимидазолов применяются в составе антигельминтных препаратов [3], анксиолитических [4] и спазмолитических средств [5]. Плейотропные терапевтические эффекты бензимидазола, помимо противоопухолевого действия, включают антидиабетическую, антимикробную, противогрибковую, противопаразитарную, противовирусную и противовоспалительную активность [6–9]. Широкий спектр биологических активностей бензимидазола обусловлен его химической структурой, а именно существованием 1,3-таутомерного равновесия. Типичный вид таутомерии в бензимидазоле — перенос протона между атомами азота в первом и третьем положении, известный как кольцевая таутомерия. Поскольку сродство каждого таутомера с биологической мишенью зависит от установленной биоактивной конформации, влияние таутомеров на механизм связывания лиганда с мишенью является определяющим [10]. Фармакофор бензимидазола может связываться с биологическими мишенями посредством водородных, гидрофобных, pi-связей, ван-дер-ваальсовых и электростатических взаимодействий [2]. Соединения на основе бензимидазола привлекли внимание онкологов благодаря своей значительной цитотоксической активности. Механизмы цитотоксического действия бензимидазола и его производных разнообразны. Основные — ингибирование топоизомераз I и II, интеркаляция ДНК и алкилирование, антагонизм андрогенных рецепторов, ингибирование поли(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP), протеинкиназ и дигидрофолатредуктазы, нарушение микротубулярного аппарата клеток [11]. Несколько соединений на основе бензимидазола получили клиническое одобрение или проходят клинические испытания в качестве препаратов для монотерапии и комбинированной терапии рака. Среди них биниметиниб (метастатическая меланома), бендамустин (лейкозы и неходжкинские лимфомы), селуметиниб (лексиформные нейрофибромы, рак щитовидной железы), велипариб (рак яичников, немелкоклеточный рак лёгкого), довитиниб (метастатический рак молочной железы, кастрационно-резистентный рак предстательной железы), прациностат (миелолейкозы), галетерон (рак предстательной железы), назартиниб (немелкоклеточный рак лёгкого) [2, 12, 13].

Ранее мы получили новые водорастворимые мономерные и димерные гетероциклические узкобороздочные лиганды ДНК на основе флуоресцентного бисбензимидазола Hoechst 33258, способные проникать через клеточную и ядерную мембраны, окрашивать ДНК и ингибировать ДНК-зависимые ферменты [14, 15]. На панели опухолевых клеток человека показана высокая цитотоксическая активность синтезированных веществ и один из возможных механизмов их действия [15]. Для исследования in vivo отобраны наиболее активные вещества — мономерный лиганд MB₂Py(Ac) и димер DB₂Py(3), химическая структура которых представлена на рис. 1.

 

Рис. 1. Химическая структура MB₂Py(Ac) и DB₂Py(3), полученная с помощью ПО MarvinSketch (Chemaxon Ltd., Венгрия); https://chemaxon.com/marvin.

Fig. 1. Chemical structure of monomeric ligand MB2Py(Ac) and dimeric ligand DB2Py(3) obtained using MarvinSketch software (Chemaxon Ltd., Hungary); https://chemaxon.com/marvin.

 

Цель исследования — изучение противоопухолевого эффекта MB₂Py(Ac) и DB₂Py(3) на моделях мышиной меланомы B16 и карцинома лёгкого Льюиса (LLC).

Материалы и методы

Препараты

Препараты MB₂Py(Ac) (мономер) и DB₂Py(3) (димер) были получены в виде жёлтых кристаллических порошков. Чистоту полученных соединений определяли с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках Kieselgel 60 F254 (Merck). Выход веществ составил 0,37 г (92,4%) для MB₂Py(Ac) и 61 мг (47%) для DB₂Py(3). Растворы для введения животным готовили ex tempore путём разведения в физиологическом растворе («ПанЭко, Россия») и перемешивания в ультразвуковой бане при комнатной температуре в течение 10 мин до полного растворения. Концентрации стоковых растворов составили 30 мг/мл для мономера и 18 мг/мл для димера. Иринотекан («Актавис групп», Исландия) растворяли до концентрации 20 мг/мл.

Исследуемые животные

В экспериментах использованы 8-недельные самцы и самки мышей линии С57Bl6 со средним весом 23–24 г, полученные из разведения НМИЦ онкологии им. Н.Н.Блохина. Животных содержали в виварии с естественным освещением на брикетированном корме и постоянном доступе к воде. Перед введением препаратов мышей распределили на группы (n=8). Одну группу оставили без специфического лечения и считали контрольной.

Опухолевые модели

В исследовании использованы перевиваемая мышиная LLC и меланома B16, полученные из коллекции опухолевых штаммов НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина. LLC 3-го пассажа перевивали на мышах-самцах С57Bl6 путём подкожной трансплантации 0,5 мл 10% взвеси измельчённой опухолевой ткани в среде 199 (ПанЭко, Россия). Меланому B16 на 3-м пассаже перевивали мышам-самкам С57Bl6 путём подкожной трансплантации 0,5 мл 10% взвеси опухолевой ткани в среде 199.

Дозы и режимы введения препаратов

Лечение животных начинали через 48 ч после подкожной трансплантации опухолей. Все препараты вводили однократно внутривенно в объёме 0,2 мл. MB₂Py(Ac) в дозе 60 мг/кг, DB₂Py(3) — в дозе 5 мг/кг. В качестве препарата сравнения использован иринотекан в дозе 30 мг/кг. Контрольным мышам вводили физиологический раствор в эквивалентных объёмах. В каждой группе было по 8 мышей. Измерение опухолевого узла проводили после трансплантации опухоли 2 раза в неделю в течение всего эксперимента. Объём опухолевого узла определяли по формуле: V=π/6×L×W×H, где L, W, H — линейные размеры опухоли [16].

Оценка противоопухолевого эффекта

Критериями эффективности исследуемых соединений служили показатель торможения роста опухоли (ТРО, %) и индекс прироста опухоли (ИПО), которые вычисляли по формулам:

$TPO(\%)=\frac{\left|V_k-V_o\right|}{V_k}\times 100$,

\( \)где V_к и V_о — средний объем опухоли (мм³) в контрольной и опытной группах соответственно;

ИПО_t=V_t / V_о ,

где V_t — объём опухолей в день на сутки эксперимента, V_о — объём опухолей в день первого измерения.

Этическая экспертиза

Все эксперименты проводили в соответствии с этическими требованиями к исследованиям на экспериментальных животных, утверждёнными в НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина и одобрены локальным этическим комитетом (документ № 04р-2024 от 21.05.2024).

Статистический анализ

Статистический анализ данных проводили с использованием MS Excel 2016 и GraphPad Prism версии 8.0 (GraphPad Software, Inc., США). В качестве описательных статистик в работе приведены средние арифметические значения объёмов и стандартное отклонение (Mean±SD). Выявление различий между контрольной группой и каждой лечебной группой выполняли с помощью одностороннего дисперсионного анализа ANOVA. Нормальность распределения проверяли по критерию Шапиро–Уилка, для множественных сравнений использовали апостериорный критерий Тьюки. Различия считали статистически значимыми при р <0,05.

Результаты

Лечение животных с солидными опухолями начинали через 48 ч после подкожной трансплантации взвеси измельчённой опухолевой ткани. Для лечения мышам однократно внутривенно вводили препарат иринотекан в дозе 30 мг/кг или MB₂Py(Ac) в дозе 60 мг/кг или DB₂Py(3) в дозе 5 мг/кг. Дозы рассчитывались по нашим предварительным неопубликованным данным острой токсичности. Первое измерение объёмов опухолей проводили на 5-е сутки после перевивки опухолей, что соответствовало 3-м суткам после начала лечения.

Оценка противоопухолевого эффекта MB₂Py(Ac) и DB₂Py(3) на модели мышиной меланомы B16

В контрольной группе (без лечения) после подкожной трансплантации меланомы B16 кривая роста характеризуется короткой латентной фазой продолжительностью около 8 дней (ИПО=4,7) и длительной экспоненциальной фазой роста — с 12-х по 22-е сутки (ИПО=12,0–90,4) (рис. 2, табл. 1).

 

Рис. 2. Динамика роста меланомы B16 у мышей С57Bl6 после однократного внутривенного введения иринотекана в дозе 30 мг/кг, MB2Py(Ac) в дозе 60 мг/кг и DB2Py(3) в дозе 5 мг/кг.

Fig. 2. Growth dynamics of B16 melanoma in C57Bl6 mice after single intravenous administration of irinotecan at a dose of 30 mg/kg, MB₂Py(Ac) at a dose of 60 mg/kg and DB₂Py(3) at a dose of 5 mg/kg.

 

Таблица 1. Показатели скорости роста меланомы B16 в контроле и группах с иринотеканом, MB₂Py(Ac) и DB₂Py(3)

Table 1. Growth rates of B16 melanoma in control and irinotecan, MB₂Py(Ac) and DB₂Py(3) groups

Группы	Доза, мг/кг	ИПО на сутки после трансплантации опухолей*
		5	8	12	15	19	22
Контроль	–	1	4,7	12,0	30,1	54,9	90,4
Иринотекан	30	1	4,9	19,9	50,7	88,6	136,8
MB2Py(Ac)	60	1	3,4	11,0	27,0	43,6	60,3
DB2Py(3)	5	1	5,1	15,1	41,5	79,3	90,9

Примечание. * 5, 8, 12, 15, 19 и 22-е сутки после трансплантации опухоли соответствуют 3, 6, 10, 13, 17, 20-м суткам после начала лечения.

Note. * 5, 8, 12, 15, 19 and 22 days after tumor transplantation correspond to 3, 6, 10, 13, 17, 20 days after the start of treatment.

 

Средний объём опухолей на 5-е сутки составляет 23,2±6,1 мм³, на 22-е сутки достигает максимального значения 1522,9±148,3 мм³. В группе иринотекана на 3 сутки после начала лечения средние объёмы опухолей составляют 46,5±15,0 мм³, то есть получен биологически значимый противоопухолевый эффект — ТРО=52,5% (p ≤0,05). В течение последующих сроков измерения противоопухолевый эффект иринотекана снижается с ТРО=38,4% (p ≤0,05) до 20,6%, а скорость роста опухоли увеличивается (ИПО=136,8). В группе DB₂Py(3) на 3 сутки после начала лечения наблюдается максимальный ингибирующий эффект на уровне ТРО=38,5% (p ≤0,05), который сохраняется в течение 12 суток после начала лечения и снижается до ТРО=11,9% к концу наблюдения. В группе MB₂Py(Ac) ТРО на всех сроках наблюдения не превышает 15,0%. Таким образом, иринотекан в режиме однократного введения оказывает наиболее выраженный, но кратковременный противоопухолевый эффект в отношении меланомы B16 (ТРО=48–52%, p ≤0,05). DB₂Py(3) слабо влияет на торможение роста опухоли (ТРО=38,4–35,6%, p ≤0,05), однако торможение сохраняется в течение 12 суток после начала лечения. MB₂Py(Ac) малоэффективен в исследуемой дозе и режиме лечения (см. рис. 2, табл. 1 и 2).

 

Таблица 2. Противоопухолевые эффекты иринотекана, MB₂Py(Ac) и DB₂Py(3) на модели мышиной меланомы B16

Table 2. Antitumor effects of irinotecan, MB₂Py(Ac) and DB2Py(3) in a model of B16 murine melanoma

Препараты	Доза, мг/кг	Торможение роста опухолей (ТРО) на сутки после начала лечения*
		3	6	10	13	17	20
Иринотекан	30	52,5**	48,5**	39,6**	29,3**	20,8	20,6
MB2Py(Ac)	60	0,3	15,0	10,2	7,7	6,8	8,1
DB2Py(3)	5	38,4**	37,4**	35,6**	26,5**	14,8	11,9

Примечания. * 3, 6, 10, 13, 17, 20-е сутки после начала лечения соответствуют 5, 8, 12, 15, 19 и 22-м суткам после трансплантации опухоли; ** статистически значимые отличия от контроля (p ≤0,05).

Notes. * 3, 6, 10, 13, 17, 20 the days after the start of treatment correspond to 5, 8, 12, 15, 19 and 22 days after tumor transplantation; ** statistically significant differences from the control (p ≤0.05).

 

Оценка противоопухолевого эффекта MB₂Py(Ac) и DB₂Py(3) на модели карциномы лёгкого LLC

В группе контроля динамика роста опухоли характеризуется кривой, состоящей из латентной фазы продолжительностью до 8 суток (ИПО=5,7) и экспоненциальной фазы, протекающей с 12-х по 22-е сутки (ИПО=184,0) (табл. 3). Средний объём опухолей в контроле в момент первого измерения (5-е сутки) составляет 64,3±32,0 мм³ и в конце наблюдения (22-е сутки) достигает максимального значения 2283,1±187,5 мм³ (рис. 3). В группе иринотекана максимальный эффект составляет ТРО=34,5% (p ≤0,05), который сохраняется примерно на одном уровне с 6-х по 13-е сутки после начала лечения (табл. 4). Ингибирующий эффект DB₂Py(3) ниже, чем у иринотекана, и не превышает 23,4% в течение всего периода наблюдения. MB₂Py(Ac) практически не вызывает торможение роста LLC у мышей (ТРО=8–4%). Таким образом, все 3 препарата в исследуемых дозах и режиме введения не оказывали биологически значимого противоопухолевого эффекта (ТРО<50%).

 

Рис. 3. Динамика роста карциномы лёгкого Льюиса у мышей С57Bl6 после однократного внутривенного введения иринотекана в дозе 30 мг/кг, MB2Py(Ac) в дозе 60 мг/кг и DB2Py(3) в дозе 5 мг/кг.

Fig. 3. Growth dynamics of LLC lung carcinoma in C57Bl6 mice following a single intravenous administration of Irinotecan at a dose of 30 mg/kg, MB2Py(Ac) at a dose of 60 mg/kg and DB2Py(3) at a dose of 5 mg/kg.

 

Табл. 3. Показатели скорости роста карциномы лёгкого Льюиса в контроле и группах с иринотеканом, MB2Py(Ac) и DB2Py(3)

Table 3. Growth rates of LLC carcinoma in control and irinotecan, MB2Py(Ac) and DB2Py(3) groups

Группы	Доза, мг/кг	Индекс прироста опухоли (ИПО) на сутки после трансплантации опухолей*
		5	8	12	15	19	22
Контроль	—	1	5,7	24,3	66,6	97,6	184,0
Иринотекан	30	1	2,3	11,0	29,6	41,5	49,9
MB2Py(Ac)	60	1	3,1	14,8	38,4	46,5	47,9
DB2Py(3)	5	1	3,1	16,1	46,3	53,8	47,4

Примечание. * 5, 8, 12, 15, 19 и 22-е сутки после трансплантации опухоли соответствуют 3, 6, 10, 13, 17, 20-м суткам после начала лечения.

Note. * 5, 8, 12, 15, 19 and 22 days after tumor transplantation correspond to 3, 6, 10, 13, 17, 20 days after the start of treatment.

 

Таким образом, на моделях солидных опухолей у мышей в исследованных дозах и режиме введения препараты DB₂Py(3) и MB₂Py(Ac) показали слабый противоопухолевый эффект (см. табл. 4). DB₂Py(3) демонстрировал слабо выраженное, но стабильное ингибирование роста опухолей in vivo. На модели меланомы B16 максимальное ТРО составляло 38,5%, которое сохранялось до 12-х суток и снижалось до 11,9% к 20-м суткам. На модели LLC максимальное ТРО достигало 23,4% на 3–6-е сутки. Мономер MB2Py(Ac) был малоэффективным: на модели B16 ТРО не превышал 15% в течение эксперимента, а на модели LLC был минимальным (ТРО=4–8%). Контрольный препарат иринотекан продемонстрировал самый значительный, хоть и кратковременный противоопухолевый эффект. На модели меланомы B16 максимальное ТРО достигало 52,5% на 3 сутки, но к 20-м суткам ТРО снизилось до 20,6%. На модели LLC иринотекан достиг пика ТРО (34,5%) на 6-е сутки, сохраняясь выше 30% до 12-х суток. В целом меланома B16 более чувствительна к действию всех тестируемых препаратов, включая иринотекан, по сравнению с LLC.

 

Таблица 4. Противоопухолевые эффекты иринотекана, MB2Py(Ac) и DB2Py(3) на модели карциномы лёгкого Льюиса

Table 4. Antitumor effects of irinotecan, MB2Py(Ac) and DB2Py(3) in a model of LLC lung carcinoma

Препараты	Доза, мг/кг	Торможение роста опухолей (ТРО) на сутки после начала лечения*
		3	6	10	13	17	20
Иринотекан	30	15,4	34,5**	33,0**	32,1	18,2	14,9
MB2Py(Ac)	60	8,2	4,0	7,6	8,1	6,7	5,7
DB2Py(3)	5	23,4	21,1	15,1	4,6	5,6	3,3

Примечание. *3, 6, 10, 13, 17, 20-е сутки после начала лечения соответствуют 5, 8, 12, 15, 19 и 22-м суткам после трансплантации опухоли; **статистически значимые отличия от контроля (p ≤0,05).

Note. *3, 6, 10, 13, 17, 20 the days after the start of treatment correspond to 5, 8, 12, 15, 19 and 22 days after tumor transplantation; **statistically significant differences from the control (p ≤0.05).

 

Обсуждение

Мы впервые исследовали противоопухолевый эффект производных бисбензимидазола на моделях солидных опухолей мышей. Мономерное соединение MB2Py(Ac) является производным Hoechst 33258, в котором фенольный фрагмент красителя заменён на пирролкарбокскамидный фрагмент антибиотика нетропсина. Димерное производное DB2Py(3) состоит из двух мономерных субъединиц MB2Py, соединённых глутаровой кислотой (см. рис. 1). Благодаря такому линкеру молекула димера обладает гибкой структурой и является изостеричной по отношению к винтовой геометрии ДНК. Предполагалось, что удвоение молекулы должно привести к повышению биологической активности. В качестве препарата сравнения был использован иринотекан —известный противоопухолевый препарат, ингибитор фермента топоизомеразы I, участвует непосредственно в синтезе ДНК. Выбор иринотекана основан на результатах наших предыдущих исследований, согласно которым мономер MB2Py(Ac) и особенно димерные производные бисбензимидазола обладают схожей с иринотеканом способностью эффективно подавлять каталитическую активность топоизомеразы I и индуцировать арест клеточного цикла в S-фазе после 24-часовой инкубации с опухолевыми клетками [15].

В целом мы показали, что при однократном введении оба исследуемых соединения имели слабо выраженный противоопухолевый эффект по сравнению с иринотеканом. При этом меланома B16 была более чувствительна к воздействию всех препаратов, включая иринотекан, по сравнению с карциномой LLC. Тем не менее оба препарата имеют потенциал для дальнейших исследований их эффективности в режимах многократного введения или с увеличенной дозой. Продемонстрирована способность препаратов данного класса при различных способах введения и многократном применении проявлять выраженный противоопухолевый эффект. Например, производное бензимидазола РУ-185 вызывал торможение роста опухоли на 70% и регрессию у 20% мышей с LLC при 10-кратном внутрижелудочном применении в высоких дозах (200–500 мг/кг) [17]. В другом исследовании 12-кратное внутрибрюшинное введение синтетических производных бензимидазолов приводило к подавлению ангиогенеза и остановке роста асцитной опухоли Эрлиха [18].

DB₂Py(3) представляется более перспективным кандидатом, однако высокая общая токсичность DB₂Py(3) in vivo (неопубликованные данные) значительно сужает терапевтическое окно этого соединения. Возможно, улучшение фармакологического профиля позволит снять ограничения и повысить дозировку соединения. Показано, что комплексообразование плохо растворимых в воде бензимидазолов с поливинилпирролидоном, целлюлозой или циклодекстринами улучшает их биофармацевтические свойства и биодоступность [19]. На модели ксенографтов рака яичника человека эффективность бензимидазолов, инкапсулированных в наночастицы полилактидглиголида, значительно превышала эффект исходного соединения [20].

Ограничения исследования

Ограничением данного исследования является отсутствие данных о режиме многократного введения препаратов, что станет предметом дальнейших экспериментов с этими соединениями.

Заключение

Исследование показало, что среди тестируемых препаратов на моделях меланомы и LLC наиболее перспективно димерное соединение DB₂Py(3), которое имеет тенденцию к длительному ингибированию роста опухоли. Тем не менее его высокая токсичность требует дальнейшей оптимизации для клинического использования. MB₂Py(Ac) оказался наименее эффективным, однако также может быть исследован в изменённых режимах введения.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Научное исследование проведено при поддержке гранта РНФ № 23-25-00373.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: С.Ш. Каршиева — получение и анализ данных, обзор публикаций по теме статьи, написание текста; О.Ю. Сусова — анализ данных, написание и редактирование статьи; А.Л. Жузе, А.Ф. Арутюнян — разработка дизайна, получение и анализ данных; Е.А. Зайцева, Н.М. Смирнов — анализ данных, редактирование статьи.

Additional information

Funding source. This study was supported by RNF grant No. 23-25-00373.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. The greatest contribution is distributed as follows: S.Sh. Karshieva — obtaining and analyzing data, reviewing publications on the topic of the article, writing the text; O.Y. Susova — data analysis, writing and editing of the article; A.L. Zhuze, A.F. Arutyunyan — design development, data acquisition and analysis; E.A. Zaitseva, N.M. Smirnov — data analysis, editing of the article.

About the authors

Saida Sh. Karshieva

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: skarshieva@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2469-2315
SPIN-code: 9154-7071

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

Albert F. Arutuynyan

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: abosiy@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5254-9252
Russian Federation, Moscow

Elizaveta A. Zaitseva

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: liz.zajtzeva2011@gmail.com
Russian Federation, Moscow

Nikolay M. Smirnov

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: nick7nov@yandex.ru
Russian Federation, Moscow

Alexey L. Zhuze

Engelhardt Institute of Molecular Biology of the Russian Academy of Sciences

Email: zhuze@eimb.ru
ORCID iD: 0000-0001-6230-8711
Russian Federation, Moscow

Olga Yu. Susova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: susovaolga@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8192-7913
SPIN-code: 6502-4232

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files