Association between sensitivity to L-asparaginase in human cutaneous melanoma cells and asparagine synthetase and glutamine synthetase gene expression

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

L-аспарагиназа (КФ 3.5.1.1) — фермент класса гидролаз, расщепляющий аспарагин и, в меньшей степени, глутамин и применяемый для лечения острого лимфобластного лейкоза и других гемобластозов [1–4]. В последние годы растёт количество попыток использовать аспарагиназу для лечения более обширной группы онкологических заболеваний и накапливается всё больше данных о том, что к действию этого фермента чувствительны клетки не только лейкозов и лимфом, но и различных солидных опухолей [5–8]. Однако, как и любой другой лекарственный препарат, L-аспарагиназа не всегда оказывается эффективной, и для её успешного применения целесообразно исследовать и внедрить в клиническую практику прогностические маркёры [9–10], позволяющие прогнозировать её эффективность при лечении конкретного пациента.

К настоящему времени накоплено достаточно данных о прямой зависимости между резистентностью опухолевых клеток к L-аспарагиназе и уровнем экспрессии в них генов аспарагинсинтетазы (ASNS) [11–14] и глутаминсинтетазы (GLUL) [15–18]. Однако количество исследований аспарагиназы на моделях меланомы — агрессивной и труднокурабельной опухоли — до сих пор невелико [19–21].

ЦЕЛЬ

Определить взаимосвязь между чувствительностью клеток меланомы к L-аспарагиназе и уровнями экспрессии генов ASNS и GLUL.

МЕТОДЫ

Объект исследования

Для исследований использовали препарат L-аспарагиназы E. coli («Верофарм», Россия, серия 10622). Лиофилизат разводили при помощи DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline, ScienCell, США).

Клеточные линии и условия культивирования

В исследовании использовали 35 линий меланомы кожи человека (SK-mel-2, SK-mel-28, SK-mel-30, A375, A875, Mel IL, Mel Ho, Mel Rac, Mel Si, Mel Kor, Mel Me, Mel Hn, Mel Gi, Mel JuSo, Mel Kas, Mel Lap, Mel Pet, Mel Z, Mel P, Mel Mtp, Mel BgF, Mel H, Mel Ch, Mel CherK, Mel Ibr, RVH-421, RPMI-7951, LPC-298, IGR-1, IGR-37, IGR-39, Colo-679, Colo-783, Colo-800, Colo-849), которые были получены из биоколлекции (https://biocollection.ru) ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Клетки культивировали в питательной среде RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute medium, «ПанЭко», Россия), содержащей 10% Fetal Bovine Serum (HyClone, UK), 2 мМ L-глутамина (Serva, Германия) и 0,1 мг/мл гентамицина («ПанЭко», Россия), в атмосфере 5% CO₂ при температуре 37 °С. Клеточные монослои пассировали два раза в неделю. Для снятия клеток с пластиковой поверхности использовали стандартный раствор Версена («ПанЭко», Россия).

Определение цитотоксичности L-аспарагиназы

Достигшие логарифмической фазы роста клетки пересевали в 96-луночные микропланшеты в объёме 180 мкл на лунку с плотностью 4 тысячи клеток/лунку и инкубировали в течение 24 ч в атмосфере 5% CO₂ при температуре 37 °С в среде RPMI-1640. Подсчёт клеток производили при помощи камеры Горяева после обработки раствором трипанового синего (0,4%).

Препарат L-аспарагиназы добавляли в объёме 20 мкл/лунку к преинкубированным клеткам с получением девяти конечных концентраций фермента от 0,39 до 100 МЕ/мл в трёх повторах. В качестве контроля использовали клеточную культуру, которую инкубировали в среде RPMI-1640.

Спустя 72 ч после внесения фермента в каждую лунку добавляли 20 мкл раствора МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид, «ПанЭко», Россия), который готовили в концентрации 5 мг/мл DPBS. Спустя 3 ч растворы заменяли на 200 мкл ДМСО (диметилсульфоксид, «ПанЭко», Россия) для растворения кристаллов формазана, после чего производили измерение оптических плотностей растворов при λ=540 нм на планшетном спектрофотометре Multiskan MS (Labsystems, Финляндия) при помощи программного обеспечения Skanlt 6.1 RE (Thermo Fisher Scientific, США).

Определение уровня экспрессии генов

Уровни экспрессии генов аспарагинсинтетазы (ASNS) и глутаминсинтетазы (GLUL) определяли методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в режиме реального времени.

Тотальную РНК выделяли из клеток с помощью набора для выделения суммарной РНК и микроРНК из реагента «Лира» (клетки, ткани) («Биолабмикс», Россия, кат. номер LRU-100-50) по инструкции производителя.

Комплементарную ДНК получали с помощью набора реактивов для синтеза первой цепи кДНК MMLV RT kit («Евроген», Россия, кат. номер SK021) по инструкции производителя. Выравнивание количеств РНК для обратной транскрипции осуществляли по величинам измеренных на спектрофотометре NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific, США) концентраций.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени выполняли с использованием готовой смеси 5X qPCRmix-HS SYBR («Евроген», Россия, кат. номер PK147S) по инструкции производителя. Использованные праймеры производства «Евроген» (Россия) перечислены в табл. 1. Реакционная смесь объёмом 25 мкл включала 10 мкл разведённых 1:100 кДНК-матриц, растворы праймеров по 0,3 мкл с исходной концентрацией 100 мкМ, 5 мкл 5X qPCRmix-HS SYBR и 9,4 мкл воды. Амплификацию проводили с использованием системы DTprime 5 («ДНК-Технология», Россия). Программа амплификации: предварительная денатурация 5 мин при 95 °С (денатурация 20 с при 95 °С, отжиг 20 с при 60 °С, элонгация 20 с при 72 °С) — 50 циклов с измерением интенсивности флуоресценции на этапе элонгации каждого цикла.

 

Таблица 1. Праймеры, использованные для оценки уровней экспрессии генов ASNS и GLUL методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в режиме реального времени

Table 1. Primers used to assess the expression levels of ASNS and GLUL genes by real-time reverse transcription polymerase chain reaction

Ген	Прямой праймер 5’-3’	Обратный праймер 5’-3’
ASNS	CCTCTCCAGACATTTGCAATTG	ACTTCATCCAGAGCCTGAATGC
GLUL	TCATCTTGCATCGTGTGTGTG	CTTCAGACCATTCTCCTCCGG
ACTB	CCTGGGCATGGAGTCCTGT	ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG
GAPDH	GAAGGTGAAGGTCGGAGTC	GAAGATGGTGATGGGATTTC
Ген 18S рРНК	GGATCCATTGGAGGGCAAGT	ACGAGCTTTTTAACTGCAGCAA

 

Математическая обработка результатов и статистический анализ

Статистическую обработку результатов МТТ-теста проводили с помощью пакета GraphPad Prism версии 9.0 (Graphpad Software Inc, США). Методом нелинейной регрессии определяли ингибирующую концентрацию, которая вызывала уменьшение количества живых клеток на 50% по сравнению с контролем (IC₅₀), а также коэффициент детерминации модели (R²). Количественные данные IC₅₀ представлены в виде X±SD, где X — среднее арифметическое, SD — стандартное отклонение.

Стандартные кривые эффективности ПЦР строили по серийным разведениям суммарных кДНК (1:40, 1:80, 1:160, 1:320). Уровни экспрессии целевых генов нормировали по отношению к среднему уровню экспрессии трёх генов: β-актина (ACTB), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) и 18S рРНК (их средний уровень экспрессии был принят за условную единицу).

Данные каждой из трёх выборок (резистентность к L-аспарагиназе, экспрессия гена ASNS, экспрессия гена GLUL) распределяли на четыре группы в соответствии со следующими критериями (М — медиана выборки, х — среднее арифметическое значение изучаемой величины для конкретной линии):

• очень низкая: x <0,5 M;
• низкая: 0,5 M< x 11,5 M;
• средняя: 1,5 M< x<10 M;
• высокая: x >10 M.

Взаимосвязь между изучаемыми признаками оценивали путём расчёта коэффициента корреляции Спирмена при помощи программного пакета RStudio-2022.12.0+353, уровень значимости принят за p=0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Чувствительность клеточных линий меланомы к L-аспарагиназе

Показано, что чувствительность клеточных линий меланомы к L-аспарагиназе колебалась в широких пределах: наиболее чувствительной оказалась линия RVH-421 (IC₅₀=0,01 МЕ/мл), наиболее резистентной — Mel IL (IC₅₀=199,91 МЕ/мл). Медиана выборки составляет 2,96 МЕ/мл (Mel Kas), среднее арифметическое выборки — 16,95 МЕ/мл. Результаты оценки влияния L-аспарагиназы на пролиферативную активность культур клеток представлены в табл. 2. Графики чувствительности различных культур клеток к L-аспарагиназе приведены в Приложении 1.

 

Таблица 2. Значения IC₅₀ L-аспарагиназы в культурах клеток меланомы

Table 2. IC₅₀ values of L-asparaginase in melanoma cell cultures

Культуры клеток	IC50, МЕ/мл	Резистентность
RVH-421	0,01±0,007	Очень низкая
A375	0,26±0,06
SK-mel-30	0,44±0,09
Mel Ho	0,81±0,07
Colo-783	0,85±0,17
Colo-679	0,88±0,13
Mel Rac	0,88±0,15
A875	0,94±0,12
Colo-849	1,01±0,13
Mel Si	1,23±0,24
Mel Kor	1,44±0,22
Mel Me	1,82±0,32	Низкая
Mel Hn	1,85±0,28
Mel Gi	2,24±0,33
Mel Z	2,34±0,15
Mel JuSo	2,37±0,33
IGR-39	2,78±0,29
Mel Kas	2,96±0,4
Mel Mtp	3,33±0,72
Mel H	3,65±0,59
Colo-800	3,7±0,73
SK-mel-2	3,98±0,53
Mel BgF	4,59±0,78	Средняя
IGR-37	5,31±0,75
Mel Lap	6,25±1,01
Mel Pet	7,09±1,28
Mel CherK	7,18±1,34
Mel Ibr	12,1±3,16
RPMI-7951	15,2±3,03
LPC-298	21,58±5,12
Mel Ch	49,16±9,51	Высокая
Mel P	59,3±12,9
SK-mel-28	81,07±19,05
IGR-1	84,57±24,7
Mel IL	199,91±51,59

 

Экспрессия гена ASNS

Уровень экспрессии гена ASNS в клетках меланомы (табл. 3) находился в диапазоне от 0,02 (SK-mel-30) до 7,38 (Mel IL). Медиана выборки составляет 0,4 (Colo-679), среднее арифметическое выборки — 0,98.

 

Таблица 3. Средние значения нормализованных уровней экспрессии гена ASNS в культурах клеток меланомы

Table 3. Mean values of normalized ASNS gene expression levels in melanoma cell cultures

Культуры клеток	Нормализованный уровень экспрессии гена ASNS	Экспрессия гена ASNS
SK-mel-30	0,02	Очень низкая
A375	0,04
Colo-783	0,04
Mel Lap	0,05
A875	0,08
Mel Rac	0,09
Mel Si	0,11
Mel Ho	0,13
Mel BgF	0,13
Colo-800	0,15
Mel Kor	0,17
Mel Kas	0,17
Mel Mtp	0,19
Mel Gi	0,19
Mel Me	0,22	Низкая
Mel Z	0,25
Mel Hn	0,30
Colo-679	0,40
RVH-421	0,50
Mel H	0,51
Colo-849	0,65	Средняя
SK-mel-2	0,69
Mel Pet	0,72
Mel JuSo	0,76
Mel CherK	0,98
Mel Ibr	1,04
RPMI-7951	1,07
Mel Ch	1,15
IGR-39	1,21
IGR-37	1,74
Mel P	2,16
LPC-298	2,25
SK-mel-28	3,22
IGR-1	5,39	Высокая
Mel IL	7,38

 

Экспрессия гена GLUL

Уровень экспрессии гена GLUL в клетках меланомы (табл. 4) был определён в диапазоне от 0,06 (Mel JuSo) до 14,78 (SK-mel-30). Медиана выборки составляет 0,64 (SK-mel-2), среднее арифметическое выборки — 1,41.

 

Таблица 4. Средние значения нормализованных уровней экспрессии гена GLUL в культурах клеток меланомы

Table 4. Mean values of normalized GLUL gene expression levels in melanoma cell cultures

Культуры клеток	Нормализованный уровень экспрессии гена GLUL	Экспрессия гена GLUL
Mel JuSo	0,06	Очень низкая
IGR-39	0,10
IGR-37	0,12
Colo-783	0,15
Mel Rac	0,16
RVH-421	0,18
Mel Pet	0,18
SK-mel-28	0,19
Mel Kas	0,21
Mel H	0,21
Mel Lap	0,28
Colo-800	0,42	Низкая
Mel BgF	0,46
Mel Me	0,47
Mel Gi	0,51
Mel P	0,57
Mel Z	0,57
SK-mel-2	0,64
Colo-679	0,74
Mel Ho	0,83
Mel Hn	0,86
Colo-849	0,95
Mel Ch	1,06	Средняя
Mel Kor	1,23
Mel Si	1,27
LPC-298	1,39
RPMI-7951	1,59
Mel CherK	1,77
Mel Mtp	1,77
Mel Ibr	1,79
Mel IL	2,28
A375	2,47
IGR-1	2,53
A875	6,58	Высокая
SK-mel-30	14,78

 

Корреляция чувствительности клеточных линий меланомы к L-аспарагиназе и уровня экспрессии генов ASNS и GLUL

Сильная положительная корреляция между значением IC₅₀ и нормализованным уровнем экспрессии гена ASNS (рис. 1) доказана статистически: коэффициент корреляции Спирмена r_s=0,751 (p=2,02×10^-7). Корреляции между IC₅₀ и нормализованным уровнем экспрессии гена GLUL в клетках меланомы (рис. 2) обнаружено не было: коэффициент корреляции Спирмена r_s=0,077 (p=0,66). Сравнительный анализ экспрессии генов ASNS и GLUL (рис. 3) также показал, что корреляции между уровнями экспрессии этих генов нет: коэффициент корреляции Спирмена r_s=-0,032 (p=0,85).

 

Рис. 1. Чувствительность клеточных линий меланомы к L-аспарагиназе и экспрессия гена ASNS. По оси абсцисс отложены средние значения нормализованных уровней экспрессии гена ASNS, по оси ординат — средние значения IC₅₀. a — данные по 35 клеточным линиям меланомы. Пунктиром показана линия тренда (коэффициент корреляции Спирмена r_s=0,751, (p=2,02×10^-7); b — данные по 29 клеточным линиям меланомы, средние IC₅₀ которых не превышают среднее арифметическое IC₅₀ выборки (16,95 МЕ/мл). Пунктиром показана линия тренда, изображённая на рисунке a, точками — линия тренда, построенная только для области IC₅₀ <16,95 МЕ/мл (коэффициент корреляции Спирмена r_s=0,574, p=0,001).

Fig. 1. Sensitivity of melanoma cell lines to L-asparaginase and expression of the ASNS gene. The x-axis shows the average normalized levels of ASNS gene expression, and the y-axis shows the average IC₅₀ values. a, data from 35 melanoma cell lines. The dotted line shows the trend line (Spearman correlation coefficient r_s=0,751, (p=2,02×10^-7); b, data on 29 melanoma cell lines whose average IC₅₀ values do not exceed the arithmetic mean of the sample IC₅₀ values (16.95 IU/mL). The dotted line shows the trend line depicted in Fig. a, and the dots show the trend line constructed only for the IC₅₀ <16.95 IU/mL region (Spearman correlation coefficient r_s=0,574, p=0,001).

 

Рис. 2. Чувствительность клеточных линий меланомы к L-аспарагиназе и экспрессия гена GLUL. По оси абсцисс отложены средние значения нормализованных уровней экспрессии гена GLUL, по оси ординат — средние значения IC₅₀. a — данные по 35 клеточным линиям меланомы (коэффициент корреляции Спирмена r_s=0,77, p=0,66); b — данные по 29 клеточным линиям меланомы, средние IC₅₀ которых не превышают среднее арифметическое IC₅₀ выборки (16,95 МЕ/мл) (коэффициент корреляции Спирмена r_s=-0,1, p=0,60).

Fig. 2. Sensitivity of melanoma cell lines to L-asparaginase and GLUL gene expression. The x-axis shows the average normalized GLUL gene expression levels, and the y-axis shows the average IC₅₀ values. a, data from 35 melanoma cell lines (Spearman correlation coefficient r_s=0,77, p=0,66); b, data from 29 melanoma cell lines whose average IC₅₀ values do not exceed the sample average IC₅₀ value (16.95 IU/mL) (Spearman correlation coefficient r_s=-0,1, p=0,60).

 

Рис. 3. Нормализованные уровни экспрессии генов ASNS и GLUL в культурах клеток меланомы. Ранжирование линий слева направо осуществлено по возрастанию величины IC₅₀.

Fig. 3. Mean values of normalized ASNS and GLUL gene expression levels in melanoma cell cultures. The lines are ranked from left to right in ascending order of IC₅₀ value.

 

Поскольку корреляции между значением IC₅₀ и уровнем экспрессии гена GLUL во всей выборке обнаружено не было, мы разделили данные на четыре группы (табл. 5) по величине IC₅₀ (определяющий признак), как указано в разделе «Методы». В группу с очень низким проявлением признака включены 11 линий с наименьшим значением IC₅₀, в группу с низким уровнем — также 11 линий, в группу со средним уровнем — 8 линий и в группу с высоким уровнем — 5 линий, имеющих наибольшее значение IC₅₀.

 

Таблица 5. Средние арифметические значения изучаемых признаков для групп сравнения, выделенных на основе величины IC₅₀

Table 5. The arithmetic mean values of the studied features for the comparison groups selected based on the level of IC₅₀

Уровень проявления признака	IC50, МЕ/мл	Экспрессия гена ASNS	Экспрессия гена GLUL
Очень низкий (n=11)	0,80±0,41	0,20±0,21	2,67±4,42
Низкий (n=11)	2,82±0,76	0,42±0,34	0,53±0,48
Средний (n=8)	9,91±5,94	1,00±0,74	0,95±0,75
Высокий (n=5)	94,80±60,59	3,86±2,52	1,33±1,04

 

Затем была проведена оценка корреляции признаков в сравнении сгруппированных значений. Как и ожидалось, корреляция между IC₅₀ и уровнем экспрессии гена ASNS была доказана статистически: коэффициент корреляции Спирмена r_s=0,99 (p=2,2×10^-16). Корреляция между IC₅₀ и уровнем экспрессии гена GLUL не подтвердилась и при межгрупповом сравнении: r_s=-0,07 (p=0,8). Также не подтвердилась корреляция между уровнями экспрессии двух генов: r_s=-0,014 (p=0,8). Внутригрупповые сравнения признаков отражены в табл. 6.

 

Таблица 6. Коэффициенты корреляции Спирмена для внутригрупповых сравнений IC₅₀ и уровней экспрессии генов ASNS и GLUL

Table 6. Spearman correlation coefficients for intragroup comparisons of IC₅₀ and gene expression levels of ASNS and GLUL

Уровень IC50	Экспрессия гена ASNS	Экспрессия гена GLUL
Очень низкий (n=11)	0,31 (p=0,35)	0,12 (p=0,73)
Низкий (n=11)	-0,05 (p=0,87)	-0,05 (p=0,87)
Средний (n=8)	0,60 (p=0,12)	0,62 (p=0,10)
Высокий (n=5)	0,99 (p=2,2×10-16)	0,5 (p=0,39)

 

Как видно из табл. 6, для очень низких и низких величин IC₅₀ корреляция между IC₅₀ и уровнями экспрессии генов ASNS и GLUL отсутствует. В случае высокого уровня IC₅₀ корреляция между этим признаком и уровнем экспрессии гена ASNS статистически значима, в то время как корреляция между IC₅₀ и уровнем экспрессии гена GLUL не установлена. Можно было бы предположить наличие взаимосвязи между изучаемыми признаками для группы со средними значениями IC₅₀, однако формально величины p >0,05 не дают этого сделать.

Наконец, мы разбили генеральную совокупность на две группы по величине IC₅₀: в первую группу включены линии с IC₅₀, не превышающими среднее IC₅₀ всей выборки (16,95 МЕ/мл) (n=29), во вторую — линии, IC₅₀ которых больше 16,95 МЕ/мл (n=6). Результаты внутригруппового сравнения представлены в табл. 7.

 

Таблица 7. Коэффициенты корреляции Спирмена для внутригрупповых сравнений IC₅₀ и уровней экспрессии генов ASNS и GLUL – 2

Table 7. Spearman correlation coefficients for intragroup comparisons of IC₅₀ and gene expression levels of ASNS and GLUL – 2

Уровень IC50	Экспрессия гена ASNS	Экспрессия гена GLUL
IC50 <16,95 МЕ/мл (n=29)	0,57 P=0,001	-0,10 P=0,60
IC50 >16,95 МЕ/мл (n=6)	0,83 P=0,04	0,37 P=0,47

 

Из табл. 7 видно, что корреляция между IC₅₀ и уровнем экспрессии гена ASNS статистически значима для обеих групп, в то время как корреляции между IC₅₀ и уровнем экспрессии гена GLUL по-прежнему не наблюдается.

ОБСУЖДЕНИЕ

В работе показана положительная корреляция между резистентностью клеточных линий меланомы к действию L-аспарагиназы и уровнем экспрессии в них гена аспарагинсинтетазы. Аспарагин является протеиногенной аминокислотой, следовательно, он необходим для биосинтеза белков. Опухолевые клетки, не способные в достаточной мере синтезировать аспарагин, то есть имеющие низкий уровень экспрессии ASNS, будут зависеть от поступления аспарагина извне. Установленная нами корреляция для культур клеток меланомы соответствует показанным ранее данным для клеток гемобластозов [22–25], рака поджелудочной железы [26], рака яичников [11, 27], опухолей головного мозга [12] и других. Полученные нами результаты нуждаются в подтверждении в экспериментах in vivo.

Глутаминсинтетаза катализирует реакцию образования глутамина из глутамата и аммиака, а глутамин, в свою очередь, используется для синтеза белка и является источником азота для амидной группы аспарагина в реакции, катализируемой аспарагинсинтетазой. Поскольку глутамин также может служить субстратом для аспарагиназы, снижение уровня глутамина в плазме крови ранее было описано как дополнительный биохимический механизм нарушения синтеза белка в опухолевых клетках [28], а экспрессия глутаминсинтетазы предложена в качестве второго молекулярно-генетического маркёра чувствительности опухолевых клеток к терапии аспарагиназой [15–16]. В нашем исследовании корреляции между уровнем экспрессии гена глутаминсинтетазы и чувствительностью клеток меланомы к L-аспарагиназе не обнаружено. Это может быть обусловлено тем, что уровень глутамина в клетке определяется не только активностью глутаминсинтетазы, но и функционированием транспортёров глутамина, таких как ASCT2 и SNAT5. Даже при низком уровне экспрессии гена GLUL опухолевые клетки могут получать глутамин, который гидролизуется L-аспарагиназой незначительно, извне. Целесообразно изучить сочетанное влияние низкого уровня экспрессии гена GLUL / ингибиторов глутаминсинтетазы и ингибиторов транспортёров глутамина на чувствительность клеток меланомы к действию L-аспарагиназы.

Ограничения исследования

В данном исследовании, как было упомянуто выше, не изучалась роль транспортёров глутамина в клетках меланомы. Кроме того, мы не изучали изменение генной экспрессии в ответ на действие L-аспарагиназы, что теоретически может влиять на чувствительность клеток к ферменту. Наконец, мы не проводили изучение чувствительности к ферменту в зависимости от длительности воздействия L-аспарагиназы: во всех экспериментах время инкубации составляло 72 часа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На панели культур клеток меланомы мы показали, что низкий уровень экспрессии гена ASNS коррелирует с высокой чувствительностью клеток к цитотоксическому эффекту L-аспарагиназы. Полученные результаты могут стать основой для дальнейших исследований использования L-аспарагиназы в лечении солидных опухолей.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Приложение 1. Влияние L-аспарагиназы на пролиферативную активность культур клеток меланомы.

doi: 10.17816/onco692138-4377645

Благодарности. Авторы выражают благодарность Калининой Н.А. (лаборатория молекулярно-генетической диагностики и персонализированной медицины НИИ ЭДиТО НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина) за предоставление ряда клеточных линий меланомы.

Вклад авторов. Кисляк И.А. — определение концепции, проведение исследования, анализ данных, написание черновика рукописи; Соколова Д.В. — определение концепции, проведение исследования; Бурова О.С. — определение концепции, проведение исследования; Хан И.И. — определение концепции, проведение исследования; Жданов Д.Д. — определение концепции; Покровский В.С. — определение концепции, пересмотр и редактирование текста статьи, администрирование. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации № 075-01551-23-00 (FSSF-2023-0006) «Поиск эффективных и безопасных фармакологических пар на основе низкомолекулярных соединений и ферментов с противоопухолевой активностью» (рег. номер 1022040600928-8-1.6.4;1.6.5;3.1.5;3.1.6 от 2022 г.).

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Appendix 1. Effect of L-asparaginase on the proliferative activity of melanoma cell cultures.

doi: 10.17816/onco692138-4377645

Acknowledgments: The authors express their gratitude to N.A. Kalinina (Laboratory of Molecular Genetic Diagnostics and Personalized Medicine, Research Institute for Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology) for providing melanoma cell lines.

Author contributions: I.A. Kislyak: conceptualization, investigation, formal analysis, writing—original draft; D.V. Sokolova: conceptualization, investigation; O.S. Burova: conceptualization, investigation; I.I. Khan: conceptualization, investigation; D.D. Zhdanov: conceptualization; V.S. Pokrovsky: conceptualization, project administration, writing—review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Funding sources: The work was supported as part of the State Assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation No. 075-01551-23-00 (FSSF-2023-0006) “Search for Effective and Safe Pharmacological Pairs Based on Small Molecules and Enzymes With Antitumor Activity” (registration No. 1022040600928-8-1.6.4;1.6.5;3.1.5;3.1.6 of 2022).

Disclosure of interests: The author have no relationships, activities or interests for the last three years related with for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: In creating this work, the authors did not use previously published information (text, illustrations, data).

Data availability statement: The editorial policy regarding data sharing does not apply to this work, and no new data was collected or created.

Generative AI: Generative AI technologies were not used for this article creation.

Provenance and peer-review: This paper was submitted to the journal on an unsolicited basis and reviewed according to the usual procedure. Two external reviewers, a member of the editorial board, and the scientific editor of the publication participated in the review.

About the authors

Ilya A. Kislyak

RUDN University; Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: kislyak.ilya.98@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6042-9795
Russian Federation, Moscow; Moscow

Darina V. Sokolova

RUDN University; Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: d.v.sokolova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3972-2425
SPIN-code: 2960-4800

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Olga S. Burova

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: burova-55@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8897-0172
SPIN-code: 7748-4593

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow

Irina I. Khan

RUDN University; Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: irinchek05@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2948-0872
SPIN-code: 6826-7694

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Dmitry D. Zhdanov

RUDN University; Orechovich Institute of Biomedical Chemistry

Email: zdanov_dd@pfur.ru
ORCID iD: 0000-0003-4753-7588
SPIN-code: 3845-2544

Dr. Sci. (Biology), Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

Vadim S. Pokrovsky

RUDN University; Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: v.pokrovsky@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0003-4006-9320
SPIN-code: 4552-1226

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files