Pecularities of immunocytochemical reaction on cytokeratins application in the differential diagnosis of tumor and non-tumor pleurisy and ascites

Full Text

Фундаментальная наука — практическому здравоохранению первичной манифестации опухоли в плевральной или асцитической жидкости диагностический поиск в течение 5—10 дней позволяет установить первоисточник опухоли. В некоторых случаях это оказывается невозможным и используются иммуноцитохимические исследования. В диагностическую панель при проведении иммуноци-тохимических исследований в обязательном порядке при опухолевых плевритах включают цитокератины (ЦК). ЦК — белки, из которых состоят внутриклеточные промежуточные филаменты цитоскелета эпителиальных клеток, они содержатся во всех эпителиальных клетках человека. В процессе злокачественной трансформации клеток экспрессия ЦК обычно повышается. Содержание ЦК в виде отдельных белковых фрагментов определяют в сыворотке крови или моче пациента, что позволяет проводить раннюю диагностику и мониторинг течения онкологического заболевания. При исследовании опухолевых плевритов и асцитов оценка экспрессии ЦК проводится на опухолевых клетках. Присутствие ЦК в клетке является признаком, который может быть использован для идентификации эпителия: каждому виду эпителиальных клеток с определенной функцией и локализацией соответствует характерный набор цитокератиновых полипептидов. К настоящему времени у человека обнаружено 20 типов ЦК: ЦК1-ЦК20. Обычно в эпителиальной клетке в зависимости от вида эпителия, степени дифференциров-ки клетки, ее микроокружения содержится от двух до десяти различных ЦК [1]. В неэпителиальных клетках ЦК практически не обнаруживаются. Клетки всех образований эпителиальной природы экспрессируют ЦК с низкой молекулярной массой, включая клетки эндодер-мального, нейроэктодермального и мезенхимального происхождения. Поэтому в качестве первых важнейших маркеров для идентификации клеток рака применяется широкий спектр цитокератиновых антител. Цитокератины относятся к фундаментальным маркерам эпителиальной дифференцировки [2]. ЦК условно разделены на 2 группы: низко- (40—56,5 кД) и высокомолекулярные (53—68 кД) формы, кислые и нейтрально-основные. В клетках простого однослойного эпителия экспрессируется ЦК8 и ЦК18. Аденокарциномы, возникшие из этого типа клеток, также экспрессируют ЦК однослойного эпителия — ЦК8, ЦК18, ЦК19 и часто ЦК7. В многослойном плоском эпителии базальный слой может экспрессировать ЦК5 и ЦК14, представляя ЦК высокой молекулярной массы. Средний и поверхностный слои неороговевающего многослойного плоского эпителия слизистых оболочек экспрессируют ЦК4 и ЦК13, в эпидермисе экспрессируются ЦК1 и ЦК10. Возникшие из клеток этого типа опухоли характеризуются плоскоклеточной дифференцировкой. В клетках переходного эпителия выявляются ЦК8, ЦК18, ЦК19 и ЦК7, в то время как поверхностные клетки специфически экспрессируют ЦК20. Клетки мезотелия, развивающиеся из мезодермаль-ных листков первичной полости, — целома — составляют особую группу, в которой выявляются ЦК как простого (ЦК8, ЦК18, ЦК19, ЦК7), так и многослойного эпителия (ЦК5, ЦК14, ЦК17). Нередко в работе используются «коктейли» к ЦК. Пан-ЦК клон АЕ1/АЕ3 включает в себя кератины 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 19, обнаружен в 30 типах различных нормальных тканей, в цитоплазме плоского и призматического эпителия цервикального канала, пищевода, кожи, тонкого кишечника, желудка и миндалин. Он отмечен также в железистых тканях (молочной, пред стательной, потовых, щитовидной желез). В патологических тканях, тестированных клоном АЕ1/АЕ3, он отмечен в 60 низкодифференцированных эпителиальных опухолях [3, 4]. Пан-ЦК MNF116 включает кератин 5, 6, 8, 17 и 19, реактивен в широком спектре эпителиальных тканей от простого железистого к многослойному плоскому эпителию. ЦК MNF116 окрашивает небольшое количество неэпителиальных клеток, например клетки гладкой мускулатуры и стромальные клетки в лимфатических узлах. ЦК MNF116 реагирует со значительным большинством доброкачественных и злокачественных эпителиальных опухолей. Злокачественные опухоли различных тканей, включая плоскоклеточный и мелкоклеточный рак, аденокарциному, а также мезотелио-му, положительно реагируют с этим антителом. Большинство неэпителиальных опухолей негативны с ЦК MNF116, хотя есть некоторые исключения [5, 6]. Использование ЦК при исследовании опухолевых плевритов и асцитов имеет свои особенности. Цель данной работы — изучить диагностическую ценность использования ЦК в дифференциальной диагностике плевритов и асцитов с наличием клеток опухоли без выявленного первичного очага. Материал и методы Объектом исследования служили результаты обследования 81 больного, манифестация опухолевого процесса у которых была в виде плеврита или асцита с наличием клеток злокачественных опухолей. Все пациенты проходили лечение в КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» в 2012 г. Полученные сведения о каждом пациенте сопоставили с клиническими данными, гистологическим исследованием операционного материала, а также данными канцер-регистра диспансера. Доставленные жидкости обрабатывали по стандартным методикам, наряду с рутинным окрашиванием по Паппенгейму применяли иммуноцитохимические методики. Для иммуноцитохимического анализа первичных и метастатических опухолей, а также дифференцирования злокачественных клеток и клеток реактивного мезотелия в жидкостной среде использовали широкий спектр маркеров [11, 12], в число которых входили цитокератины 5/6, 7, 18, 20, а также пан-ЦК АЕ1/АЕ3 и MNF116. Препараты готовили с использованием цитоцентрифуги, контролем наличия необходимого количества опухолевых клеток в Cytoclip-препаратах служили препараты, окрашенные рутинным способом. Иммуноцитохимические исследования проводили по стандартной методике. Для визуализации реакции антиген—антитело использовали тест-систему REALtm EnVision™. В качестве хромогена использовали DAB (3,3-диаминобензидин). Результаты и обсуждение ЦК оценены в плевральной жидкости у 55 больных, в асцитической у 26 пациентов в возрасте 28—78 лет; мужчин 39 человек, женщин 42. Было проведено 327 иммуноцитохимических исследований на цитокератины наряду с использованием мезотелиальных, эпителиальных и органоспецифических антител (табл. 1, 2). Реакция на ЦК во всех наблюдениях цитоплазматическая. Cytokeratin 5/6 (ЦК5/6), окрашивает многослойный плоский эпителий, в котором базальный эпителий в большинстве случаев экспрессирует ЦК 5/6. Для простого эпителия и неэпителиальных клеток реакция нехарактерна. Антитела к ЦК5/6 отмечены при плоскоклеточном раке легкого при необходимости дифференциальной 17 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 6, 2013 Таблица 1 Иммунореактивность ЦК, использованных для дифференцирования метастаза рака различных локализаций, эпителиоидной мезотелиомы и клеток реактивного мезотелия у мужчин в плевральной (n=35) и асцитической жидкости (n=4) Маркер РЛ РЖ РК РПЖ ЗМ РАК бду РАК искл. Иссл. неуд. C AE1/AE3 8/8 2/2 1/1 1/1 6/6 1/1 — — C MNF 116 8/8 2/2 3/3 1/1 6/6 1/1 — — CK 5/6 1/8 1/4 0/4 0/3 6/6 0/3 5/5 — CK 7 10/10 5/5 0/4 3/3 3/6 4/4 — 2/2 CK 18 9/10 5/5 4/4 3/3 3/3 2/4 5/5 2/2 CK 20 0/10 5/5 4/4 1/3 — 1/3 — 2/2 Число пациентов 10 5 4 3 6 4 5 2 Примечание. Здесь и в табл. 2: РЛ — аденогенный рак легкого, РЖ — аденокарцинома желудка, РК — аденокарцинома кишечника, РПЖ — аденокарцинома поджелудочной железы, РМЖ — протоковый рак молочной железы, РЯ — серозный рак яичника, РЭ — серозный папиллярный рак эндометрия, ЗМ — злокачественная мезотелиома, РАК бду — аденокарцинома без дальнейших указаний, РАК искл. — рак исключен, клетки соответствуют мезотелию, Иссл. неуд. — исследования неудачны. диагностики с аденогенным раком легкого. Иммуноци-тохимические исследования при плоскоклеточном раке легкого проведены лишь в одном наблюдении. При обследовании больного, кроме цитологического исследования плевральной жидкости, была проведена пункция лимфатического узла надключичной области, по которой установлен диагноз рака, предположительно светлоклеточная аденокарцинома. При исследовании цитологического и гистологического материала, полученного при бронхоскопии, клеточные характеристики соответствовали плоскоклеточному раку. Проведены иммуноцито-химические исследования клеток в плевральной жидкости. Опухолевые клетки были положительны с ЦК5/6, Ber-EP4, CEApoly, отрицательны с ЦК18, TTF-1, мезо-телином, что соответствовало плоскоклеточному раку. Экспрессия ЦК 5/6 делает его ценным при дифференцировании эпителиоидной мезотелиомы от адено-генного рака легкого наряду с использованием других маркеров мезотелиомы, таких как калретинин, мезоте-лин и тромбомодулин [7, 8]. При позитивной экспрессии ЦК5/6 — данные за плоскоклеточный рак [9]. Ценность маркера ЦК5/6 при дифференциальной диагностике плоскоклеточного рака и эпителиоидной мезотелиомы в связи с однотипной реакцией ограниченная [10, 11]. При дифференциальной диагностике злокачественной мезотелиомы и плоскоклеточного рака легкого в плевральном выпоте дополнительно желательно использовать маркеры WT1 и p63. При злокачественной эпителиоидной мезотелиоме произойдет реакция на WT1, и наоборот, негативное окрашивание на WT-1 и позитивное на p63 исключает мезотелиому [11]. Во всех наблюдениях аденокарцином легкого (n = 14) в плевральной жидкости отмечена негативная реакция на ЦК5/6, лишь в одном наблюдении у женщины отмечена слабая позитивная реакция [12]. Позитивная реакция на ЦК5/6 отмечена также в двух случаях при серозном раке яичника в асцитической жидкости. При дифференциальном диагнозе клеток эпителио-идной мезотелиомы и клеток реактивного мезотелия им-муноцитохимическая реакция позитивная в обоих случаях, отличие только в выражении окрашивания. Клетки реактивного мезотелия положительно маркируются на ЦК5/6 слабо или умеренно, в эпителиоидной мезотелио-ме реакция выраженная. Cytokeratin 7 (ЦК7) отмечен в большом количестве железистого эпителия, его используют для уточнения метастаза в плевру или брюшину аденокарциномы легкого, молочной железы, эндометрия, щитовидной железы и яичников [13]. В плевральной и асцитической жидкости ЦК7 отмечен в клетках серозного рака яичников во всех наблюдениях (n = 16; в 100%) (рис. 1). ЦК7 был позитивен при метастазе рака эндометрия, молочной и поджелудочной железы, желудка (рис. 2). В легком реакция на ЦК7 отмечена во всех аденокарциномах. Реакция на ЦК7 отмечается и при эпителиоидной ме-зотелиоме. По данным литературы, ее отмечают в 86% наблюдений [14]. В данной работе отмечена реакция на ЦК7 в половине (50%) наблюдений. Cytokeratin 18 (ЦК18) вместе с ЦК 8 относятся к основным (первичным) ЦК простого эпителия. При позитивной экспрессии ЦК18 — данные за аденокарциному [9]. Реакция на ЦК18 отмечена во всех наблюдениях ме- Таблица 2 Иммунореактивность ЦК, использованных для дифференцирования метастаза рака различных локализаций, эпителиоидной мезо-телиомы и клеток реактивного мезотелия у женщин в плевральной (n=20) и асцитической жидкости (n=22) Маркер РЯ РЭ РЛ РЖ РК РМЖ ЗМ РАК бду РАК искл Иссл. неуд. C AE1/AE3 3/3 — — 1/1 — — 6/6 2/2 — — C MNF 116 3/3 — 2/2 1/1 — 2/2 6/6 2/2 — — CK 5/6 2/7 1/1 1/5 1/1 0/2 1/3 6/6 2/2 2/2 2/2 CK 7 14/16 1/1 5/5 2/2 0/2 4/4 3/6 2/2 2/2 2/2 CK 18 14/14 1/1 5/5 2/2 2/2 4/4 3/6 2/2 — — CK 20 0/7 — 0/3 2/2 2/2 0/4 — 0/2 — — Число пациенток 16 1 5 2 2 4 6 2 2 2 18 фундаментальная наука — практическому здравоохранению Рис. 1. Позитивная реакция на ЦК7 клеток серозного рака яичников. Асцитическая жидкость. Иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. *400. Рис. 3. Позитивная реакция на ЦК18 при аденогенном раке легкого. Плевральная жидкость. Иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. *400. Рис. 5. Позитивная реакция на ЦК5/6, выраженная в клетках эпите-лиоидной мезотелиомы и слабая в клетках реактивного мезотелия. Плевральная жидкость. Иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. *400. Рис. 2. Позитивная реакция на ЦК7 клеток рака желудка. Асцитическая жидкость. Иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. *200. Рис. 4. Позитивная реакция на ЦК20 при аденогенном раке желудка. Асцитическая жидкость. Иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. *400. Rf 7V' Рис. 6. Позитивная реакция на ЦК18, выраженная в клетках эпите-лиоидной мезотелиомы и умеренная в клетках реактивного мезоте-лия. Плевральная жидкость. Иммунопероксидазный метод, докраска гематоксилином. *400. 19 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 6, 2013 тастазов аденокарциномы независимо от локализации первичного образования (рис. 3). Реакция на ЦК18 позитивная также и при злокачественной эпителиоидной мезотелиоме. При дифференциальной диагностике аденокарциномы и эпителиоидной мезотелиомы, а также клеток реактивно измененного мезотелия иммунореактивность ЦК не может являться надежным признаком без использования других маркеров [15]. Cytokeratin 20 (ЦК20) выявляется исключительно в клетках кишечника и желудочных крипт, муцинозных типах рака яичника, переходно-клеточных карциномах, а также в клетках Меркеля кожи [16]. Во всех наблюдениях рака легкого и серозного рака яичников в плевральной и асцитической жидкости отмечена негативная реакция на ЦК20, позитивная реакция отмечена во всех наблюдениях рака желудка (рис. 4), кишечника и рака поджелудочной железы (см. табл. 1, 2). При диагностике эпителиоидной мезотелиомы ЦК20 не использовали. Реакция на пан-ЦК дублировала реакцию на описанные выше ЦК. В жидкостной среде скопления опухолевых клеток, как и скопления пролиферирующего мезотелия, приобретают форму плавающих тел. При использовании им-муноцитохимических исследований в плевральной и асцитической жидкости следует помнить, что клетки ме-зотелиального происхождения — реактивный мезотелий и клетки эпителиоидной мезотелиомы — экспрессируют и низко-, и высокомолекулярные кератины. В отличие от них аденокарциномы экспрессируют только низкомолекулярные кератины. Реакция на ЦК 5/6 отсутствует в аденокарциноме. Однако при эпителиоидной мезотелио-ме на ЦК 5/6 окрашивается практически весь клеточный состав препарата, кроме иммунокомпетентных клеток. Отличие клеток эпителиоидной мезотелиомы от клеток реактивного мезотелия отмечено лишь в выражении окрашивания. В опухолевых клетках эпителиоидной ме-зотелиомы реакция на ЦК5/6 выраженная, в клетках пролиферирующего мезотелия слабая или умеренная (рис. 5). Также отмечена выраженная позитивная реакция на ЦК18 при злокачественной эпителиоидной мезотелиоме (рис. 6). Учитывая данный факт, использовать реакцию на ЦК при дифференциальной диагностике различных опухолевых процессов, а также для уточнения неопухолевого характера клеток необходимо использование ме-зотелиальных и эпителиальных маркеров (калретинин, мезотелин, тромбомодулин и эпителиальный антиген). Таким образом, при дифференциальной диагностике метастаза аденокарциномы и эпителиоидной мезотелио-мы плевры, а также для уточнения принадлежности клеток к реактивному мезотелию использование ЦК5/6, 7, 18 и 20 может помочь в определении первичной локализации с одновременным использованием других диагностических маркеров в наборе, что более информативно, чем использование пан-ЦК.

About the authors

O. G Grigoruk

Email: cytolakod@rambler.ru

V. Yu Kravtsov

L. M Bazulina

A. F Lazarev

References

Supplementary files