Canceromatosis modelling of intraperitoneal implantation of solid tumours in mice or human

Full Text

Канцероматоз брюшины (множественные им- плантационные метастазы) возникает в виде мелкобугристых высыпаний при контакте первичной опухоли (рак желудка, кишечника, яичников) с соседними органами. Возможно образование метастатических узлов на поверхности большого сальника и в малом тазу за счет оседания отделившихся от первичной опухоли клеток при свободном перемещении в брюшной полости. Одним из наиболее явных симптомов канцероматоза является асцит. Прогноз жизни пациентов прямо связан с имплан- тационным метастазированием первичных опухолей [1]. Частота имплантационного метастазирования довольно высока. Диссеминацию по брюшине при распространении опухолевой инфильтрации на серозную оболочку и/или на окружающие структуры наблюдают у каждого второго больного. Зачастую эти ранние рецидивы возникают в течение первого года наблюдения и быстро приводят к летальному исходу. Кроме того, у 40% больных раком желудка уже при обращении за медицинской помощью выявляют диссеминированные формы заболевания; причем основным проявлением диссеминации оказываются интраперитонеальные метастазы [2-5]. Для доклинического изучения новых лекарственных средств, способных при внутрибрюшинном введении ингибировать канцероматоз брюшины, нет четких рекомендаций по выбору релевантной опухолевой модели. Это послужило основанием для детального изучения наиболее подходящих по основным биологическим характеристикам интрапе- ритонеальных моделей солидных опухолей мышей и человека. В исследовании использованы имплантированные в брюшную полость перевиваемые солидные опухоли: мышиная метастазирующая в легкие эпи- дермоидная карцинома легкого Льюис (LLC) на им- мунокомпетентных мышах-самцах C57Bl6j и подкожные (п/к) ксенографты рака молочной железы человека РМЖ-1 на иммунодефицитных мышах- самках Balb/c nude [6]. LLC при внутримышечной (в/м) и п/к трансплантациях рекомендован в качестве прогностически значимой доклинической модели [7, 8]. Имплантация в брюшную полость (в/б) 2-4 • 105 клеток дает локальный солидный рост LLC с асцитом и быстрой гибелью мышей в сроки от 10,5±2,2 до 13,9±2,9 дней. Интраперитонеальная опухоль сохраняет лекарственную чувствительность, в частности к цисплатину или доксорубицину (2-кратное пролонгирование жизни мышей) [9-11]. Чувствительность в/б LLC к паклитакселу, высокоэффективному при раке яичников, не описана. Среди доступных моделей опухолей человека солидных опухолей практически нет. Мы рассмотрели как потенциально пригодный штамм п/к ксенограф- тов солидного протокового рака молочной железы человека РМЖ-1, который при в/б имплантации им- мунодефицитным крысам дает асцит [12]. Особенности интраперитонеального роста у иммунодефи- цитных мышей не описаны. Для доказательства релевантности моделей ин- траперитонеального канцероматоза необходимы количественные показатели основной симптоматики: число и диаметр солидных интраперитонеальных узлов; объем и сроки накопления асцита; локальный или тотальный характер специфического поражения брюшной полости, средняя продолжительность жизни мышей. Сравнительный анализ эффективности отобранного на модели канцероматоза средства невозможен также без сведений о лекарственной чувствительности первичной опухоли к основным препаратам, например к паклитакселу для рака яичников и молочной железы. Соответственно сформулированы цель и задачи исследования. Цель исследования - моделирование канцерома- тоза при интраперитонеальной имплантации карциномы LLC мышей и рака молочной железы РМЖ-1 человека. Задачи: 1) оценка чувствительности штаммов LLC и РМЖ-1 к паклитакселу; 2) получение интра- перитонеального солидного роста РМЖ-1 на nude мышах; 3) определение параметров развития канце- роматоза в брюшной полости мышей после интрапе- ритонеальной имплантации LLC и РМЖ-1. Материал и методы Опухолевые модели Штаммы LLC и РМЖ-1 получены из Банка опухолевых штаммов РОНЦ [12]. Криоматериал в крио- виалах размораживали ex tempore, затем определяли клеточность взвеси, после чего клетки имплантировали в 0,2 мл питательной среды 199 мышам-до- норам («1» пассаж). LLC имплантировали по 2 • 106 клеток на мышь в мышцы бедра (в/м) мышей-самцов линии OSyBlej, РМЖ-1 по 4 • 105 клеток под кожу мышей-самок Balb/c nude. Полученные опухолевые узлы дезинтегрировали в стеклянном гомогенизаторе и фильтровали через капроновый фильтр. Отфильтрованную клеточную массу разводили питательной средой 199 и использовали для приготовления ино- кулята «2» пассажа, который выполняли по 50 мг взвеси в 0,2 мл п/к (определение чувствительности штамма к паклитакселу) или в/б (формирование кан- цероматоза) соответствующих мышей. Животные В опытах с LLC использованы 60 мышей-самцов С57Bl6j массой тела 20-22 г, которых получали из питомника лабораторных животных «Столбовая» и содержали в виварии РОНЦ на брикетированных кормах. Для опытов с РМЖ-1 использованы 17 мышей-самок Balb/c nude массой тела 20-22 г собственного разведения РОНЦ, которых содержали в специализированном кондиционированном отсеке со стерилизованным на входе воздухом и избыточным притоком, на стерильном брикетированном корме (ООО «МЭСТ», Россия), воде и бумажной подстилке при нормированном температурно-влажностном режиме с соблюдением требований, предъявляемым к конвенциональным животным. Для решения перечисленных выше задач исследования составляли группы из мышей с имплантированными опухолями (n = 6-20). Оценка результатов Для изучения чувствительности опухолей к па- клитакселу использован таксол во флаконах по 30 мг (Bristol Myers Squibb, США). Инъекционный раствор цитостатика готовили путем добавления стерильного физиологического раствора хлористого натрия к содержимому флакона до концентрации BASIC RESEARCH - PRACTICAL MEDICINE « 1200 5 >s CD 3 3 5 О ш Iо 0) т 5 ц о 900 I с о 5 CD г* VO 0 >5 5 1 3 Q. О 600 300- Н РМЖ1 LLC Паклитаксел 30 мг/кг Контроль 10 8 6 4 2-\ 0 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 Сутки после трансплантации опухоли Контроль Паклитаксел 30 мг/кг Рис. 1. Чувствительность интраперитонеальных LLC и РМЖ-1 к паклитакселу в однократной дозе 30 мг/кг. Сутки после трансплантации опухоли Опыт 1 *1Й1 ф 91 81 I 8 5- о 42 3- § 2“ 3 1* о- Рис. 2. Воспроизводимая продолжительность жизни мышей с канцероматозом LLC в серии опытов. *1Й1 ф 9- I 81 I 8 5- 0 4? 3- 1 2“ 3 1* 0- 0 2 4 6 8 10121416 Сутки после трансплантации опухоли Опыт 2 0 2 4 6 8 1012141618 Сутки после трансплантации опухоли Опыт 3 1 мг/мл. Мышам с LLC паклитаксел в однократной дозе 30 мг/кг вводили внутривенно (в/в) через 48 ч после имплантации, мышам с РМЖ-1 - в/б через 24 ч. О чувствительности опухоли судили по достижению значимого ингибирующего эффекта (> 70%) в сравнении с нелеченым контролем по формуле ТРО = (Vcp контроля - Vcp опыта)/Vcp контроля • 100% при расчете объема опухолевого узла по формуле a • b • c (мм3). По той же формуле определяли увеличение продолжительности жизни (УПЖ > 25%) под действием паклитаксела, использовав вместо среднего объема среднюю продолжительность жизни (СПЖ, дни) мышей в сравнении с контролем без лечения. Для выявления канцероматоза в период наблюдения следили за появлением пальпируемых солидных узлов в брюшной полости. Визуальный контроль искомой симптоматики выполняли при аутопсии части мышей (n = 5, 20) на различные сроки (5, 10, 11-14, 21- е сутки) после имплантации опухолей. При ревизии брюшной полости определяли: наличие, число и диаметр и/или объем солидных интраперитонеаль- ных узлов; наличие, объем и сроки накопления асцита; характер поражения (локальный или тотальный) париетальной, висцеральной брюшины, брыжейки и лимфатических узлов. О выживаемости мышей судили по СПЖ части мышей (n = 10) с интраперитонеальным LLQ поскольку этот параметр показал свою значимость в похожих исследованиях. Результаты, подлежащие количественной оценке, обрабатывали статистически, рассчитывая доверительные интервалы средних сравниваемых величин, достоверными считали различия при p < 0,05. Умерщвление выполняли с использованием принятых в РФ методов гуманного обращения с лабораторными животными. Результаты Чувствительность опухолевых моделей к паклитакселу Опыт показал, что LLC и РМЖ-1 практически одинаково чувствительны к терапии паклитакселом. На 4-е сутки после лечения LLC в группе паклитаксела Vcp = 193±124 мм3 против 1187±712 мм3 в контроле (n = 6), ТРО = 84% (p < 0,05). При этом выживаемость мышей была выше, УПЖ = 46% (p < 0,05), соответственно СПЖ = 18,1±4,5 против 12,4±0,4 дня в группе контроля без лечения. На 18-е сутки после лечения РМЖ-1 в группе паклитаксела Vcp = 64± 43 мм3 против 434±198 мм3 в контроле (n = 8), ТРО = 85% (p < 0,05) (рис. 1). Таблица 1 Параметры развития канцероматоза LLC у мышей-самцов C57Bl6j Число мышей Сутки после имплантации Параметры солидные узлы характер поражения асцит, мл диаметр, мм число n = 5 5 2-3 30-40 Локальный 0 n = 5 10 5-20 единичные Тотальный 2,0-3,0 n = 20 11-14 5-20 + сливные 2,0-3,0 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ Таблица 2 Параметры развития РМЖ-1 в брюшной полости мышей-самок Balb/c nude Сутки Характер поражения* асцит (+/-) локализация пальпируемость (+/-) визуализация (+/-) размеры опухолевого узла (данные аутопсии) d, мм Vcp**, мм3 10-14 - На брюшине (имплантация) + + Не определяется 21 + + 8-17 299 [154 - 454] 434 [236 - 632] Примечание. * - m=10; ** - средняя арифметическая с доверительным интервалом в двух опытах. Параметры канцероматоза LLC Показано, что LLC на 5-14-е сутки после имплантации развивается в брюшной полости мышей с формированием большого числа быстро растущих солидных узлов (от 30-40 до сливных), достигающих диаметра соответственно от 2-3 до 5-20 мм. При этом у всех мышей по мере развития процесса наблюдают признаки локального или тотального канцероматоза париетальной и висцеральной брюшины, брыжейки и лимфатических узлов с накоплением до 2-3 мл геморрагического асцита. Выживаемость мышей с канцероматозом LLC невысокая и не превышает 14 дней, в серии опытов СПЖ = 12,4±0,4; 12,7±1,4 или 13,6±2,2 дней (табл. 1, рис. 2). Таким образом, параметры развития интрапери- тонеального LLC у сингенных иммунокомпетентных мышей-самцов C57Bl6j свидетельствуют о быстром и агрессивном течении канцероматоза. Симптоматически это проявляется солидными разрастаниями (от 30-40 до тотального) по брюшине (париетальной и висцеральной) и брыжейке с поражением лимфоидного аппарата кишечника, развитием объемного асцита (до 3,0 мл) и гибелью мышей на 12-14-е сутки. Модель интраперитонеального LLC отличается умеренной чувствительностью к в/в терапии пакли- такселом, ингибирующим локальный рост опухоли до 84%, и увеличением продолжительности жизни мышей до 46%. Полученные данные дают основания считать, что интраперитонеальный LLC целесообразно использовать в качестве чувствительной к системной химиотерапии агрессивной доклинической модели канцероматоза под контролем визуальных данных о состоянии мышей и накопления асцита с верификацией локального процесса (аутопсия брюшной полости) по следующим показателям: скорость развития солидных узлов; уровень накопления асцита; увеличение продолжительности жизни. Параметры канцероматоза РМЖ-1 Показано (табл. 2), что РМЖ-1 растет в брюшной полости nude мышей с развитием в месте имплантации пальпируемого через переднюю брюшную стенку солитарного одиночного округлого или продолговатого солидного узла. Одиночный солидный узел в течение 3 нед неагрессивно увеличивался в объеме от 299 [154 - 454] до 434 [236 - 632] мм3. Аутопсия, выполненная на этот срок, подтвердила локальный солидный рост опухоли в месте имплантации без распространения по брюшине и выявила отсутствие асцита. Признаков ухудшения качества жизни мышей или гибели мышей от опухоли в течение всего периода локального роста опухоли не отмечали. С учетом возможной спонтанной гибели до 30% мышей от генетически детерминированного иммунодефицита наблюдение за выживаемостью мышей с опухолью не проводили. Заключение Таким образом, параметры развития интрапери- тонеального LLC у сингенных иммунокомпетентных мышей-самцов C57Bl6j свидетельствуют о быстром и агрессивном течении канцероматоза. Симптоматически это проявляется солидными разрастаниями (от 30-40 до тотального) по брюшине (париетальной и висцеральной) и брыжейке с поражением лимфоидного аппарата кишечника, развитием объемного асцита (до 3,0 мл) и гибелью мышей на 12-14-е сутки. Модель интраперитонеального LLC отличается умеренной чувствительностью к в/в терапии пакли- такселом, ингибирующим локальный рост опухоли до 84%, и увеличением продолжительности жизни мышей до 46%. Параметры развития интраперитонеального РМЖ-1 у иммунодефицитных мышей-самок Balb/c nude свидетельствуют об относительно медленном и неагрессивном течении канцероматоза без ухудшения качества жизни или гибели мышей. Симптоматически процесс проявляется развитием на брюшине в месте имплантации одиночного (солитарного) солидного узла на брюшине, достигающего в течение 3 нед среднего объема до 300 мм3 без накопления асцита. Модель интраперитонеального РМЖ-1 отличается умеренной чувствительностью к в/в терапии паклитакселом, ингибирующим локальный рост опухоли до 79%. Полученные данные дают основания считать, что интраперитонеальный LLC целесообразно использовать в качестве чувствительной к системной химиотерапии агрессивной доклинической модели канцероматоза под контролем наблюдения за мышами в течение 14 дней после перевивки опухоли и данных локального процесса (аутопсия брюшной полости) по следующим показателям: развитие солидных узлов; накопление асцита; увеличение продолжительности жизни. Интраперитонеальный РМЖ-1 целесообразно использовать в качестве чувствительной к системной химиотерапии неагрессивной доклинической модели канцероматоза под контролем данных локального процесса (аутопсия брюшной полости) по скорости развития солидного узла. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

About the authors

N. V Andronova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

G. B Smirnova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

Ju. A Borisova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

M. S Kalish'yan

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

Elena M. Treshchalina

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: treshalina@yandex.ru
MD, PhD, DSc, Prof., Head of the Laboratory combination therapy of tumors of the Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors Moscow, 115478, Russian Federation

References

Supplementary files