ANALYSIS OF PROTEIN EXPRESSION OF PD-L1 IN MALIGNANT PLEURAL MESOTHELIOMA

Full Text

Существует концепция иммунного контроля роста опухоли, согласно которой клетки иммунной системы могут влиять на рост и прогрессию злокачественного новообразования путём развития локального воспаления, цитолизом (продукцией специфичных антител к опухоль-ассоциированным антигенам), цитолиза опухолевой клетки посредством NK-, NKT-клеток, CD8+ Т-лимфоцитов [1]. Однако опухолевые клетки способны подавлять направленный иммунный ответ, используя различные механизмы. Один из таких механизмов основан на передаче ингибирующего сигнала от рецепторов CTLA-4 или PD-1 на CD8+ Т-лимфоцитах к опухолевым клеткам, что вызывает ускользание от иммунного ответа [2]. Суть противоопухолевой иммунотерапии сводится к блокированию так называемых ингибирующих иммунологических контрольных точек (Immunological checkpoints) [3]. Иммунологические контрольные точки - это система рецепторно-лигандных взаимодействий, которые участвуют в регуляции активации иммунного ответа, модулируют его, ограничивают вызванные иммунными клетками повреждения в органах и тканях, а также препятствуют запуску аутоиммунных реакций [4]. Рецептор программированной клеточной смерти PD-1 экспрессируется на поверхности активированных Т- и В-лимфоцитов, играя в норме важную роль в поддержании иммунного гомеостаза [5]. На поверхности же опухолевой клетки есть специфический белок-лиганд к этому рецептору - PD-L1 и PD-L2. При их взаимодействии подавляется токсическая активность Т-клеток, и опухоль уходит от иммунного ответа [6, 7]. Н. Nishimura и соавт. в 1999 г. впервые в своей работе in vivo на мышах, дефицитных по PD-1, продемонстрировали, что PD-1 может выступать как блокатор иммунного ответа, вовлечённого в процесс уклонения множества опухолей от распознавания иммунной системой [5, 8]. При различных злокачественных опухолях (меланома, рак лёгкого, рак почки и т.д) отмечается гиперэкспрессия протеина PD-L1 [9-14]. Злокачественная мезотелиома плевры (ЗМП) - это относительно редкая злокачественная опухоль, возникающая из клеток мезотелия, выстилающих полости организма (плевральная, брюшная, полость перикарда, яичка) и характеризующаяся агрессивным течением и неблагоприятным прогнозом [15]. Стандартом системной химиотерапии ЗМП является сочетание препаратов платины и антифолатов, но результаты лечения позволили увеличить медиану выживаемости менее чем на 3 мес. За последние 14 лет новых эффективных режимов химиотерапии не выявлено [16, 17]. Мультимодальная (трёхкомпонентная) терапия - сочетание химиотерапии, хирургии и лучевой терапии - позволяет увеличить медиану общей выживаемости до 43,3 мес и двухлетнюю выживаемость у 77% больных лишь в тщательно отобранной группе пациентов с ЗМП [18, 19]. Рост заболеваемости и плохие результаты лечения ЗМП требуют обновления терапевтических стратегий. Есть некоторые доказательства того, что ЗМП является иммунозависимой опухолью [20-22]. Клинические исследования показали, что инвазия лимфоцитов в опухоль влияет на прогноз при ЗМП [20, 23]. Кроме того, ЗМП представляется чувствительной к иммунотерапии опухолью, описаны редкие случаи спонтанной регрессии, которые указывают на наличие противоопухолевого иммунитета [24-26]. Более того, уровни экспрессии иммунных молекул в некоторых случаях коррелируют с прогнозом [27, 28]. Большой проблемой является недостаточная стандартизация методов определения экспрессии PD-1 и PD-L1 из-за отсутствия подходящего человеческого анти-PD-L1-антитела, которое может окрашивать PD-L1 на фиксированном материале. Неясно, какой набор диагностических антител является оптимальным, нужно ли исследовать клетки опухоли или, кроме опухоли, учитывать иммунные клетки в окружающей строме. Собственные PD-L1-антитела были разработаны для каждого конкретного лекарственного средства (Ниволумаб, Пембролизумаб и Атезолизумаб) с собственной технической спецификой и определением уровня позитивности [29-32]. В имеющейся литературе данные о роли PD-L1 при ЗМП, методике оценки экспрессии и пороговых уровнях экспрессии очень скудны. Последние клинические исследования показали, что PD-L1 определяется у 40% пациентов с ЗМП с использованием 5H1 антител [33, 34]. Для дальнейшего изучения распространённости и роли PD-L1 при ЗМП мы измерили уровень PD-L1 белка с помощью антител anti-PD-L1 antibody [platform 28.8] (ab205921). Материал и методы За период с января 2006 г. по ноябрь 2016 г. в отделении химиотерапии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России отобрано 53 пациента, которым проведено лечение I линии пеметрекседом или гемцитабином в комбинации с препаратами платины. Средний возраст составил 52,5 года (от 29 до 76 лет). Мужчин было 28 (52,8%), женщин - 25 (47,2%). В исследование включались пациенты со II-IV cтадией заболевания. С целью верификации диагноза и классификации ЗМП в соответствии с номенклатурой последней Классификации опухолей лёгких, плевры и тимуса - 4-й пересмотр (ВОЗ, 2015) - готовые гистологические препараты всех опухолей были пересмотрены патологоанатомом с обязательным иммуногистохимическим исследованием во всех случаях [35]. Определяющим фактором включения в исследование был морфологически и иммуногистохимически верифицированный диагноз ЗМП. Иммуногистохимический анализ Образцы опухолевой ткани были получены при помощи торакоскопической биопсии первичной опухоли в момент постановки диагноза. Пациентам не проводилось никакой предварительной терапии до получения опухолевых образцов. Один и тот же метод исследования использовался для каждого пациента. Перед исследованием биопсийный материал, не содержащий опухоли, был исключен из анализа. В итоге доступными оказались 30 образцов. Согласие на исследование образцов опухолевой ткани, используемых в работе до их отправки в лабораторию, было получено от всех пациентов в письменной форме. ЗМП была представлена в трёх гистологических вариантах: эпителиоидный - 22 (73%) образца, саркоматоидный - 6 (20%) и бифазный - 2 (7%). Иммуногистохимический анализ проводили на срезах, залитых в парафин, на автоматическом иммуногистостейнере компании Ventana серии BenchMark в комплексе с диагностическими наборами. Иммуногистохимическое окрашивание обеспечивало визуализацию антигенов посредством последовательного нанесения специфичного антитела. Результаты интерпретировались при помощи оптического микроскопа патоморфологом. Все манипуляции проводили со штрих-кодированными препаратами, внесёнными в базу. На всех этапах окрашивания присутствовал положительный тканевый контроль. В качестве положительного контроля для PD-L1 использовали ткань миндалины. Эта ткань может содержать как положительно, так и отрицательно окрашивающиеся клетки или тканевые компоненты. В качестве контрольных тканей использовали свежие аутопсийные, биопсийные или операционные образцы, приготовленные и фиксированные методом, аналогичным таковому для исследуемых срезов. Такие ткани обеспечивают контроль на всех этапах процедуры - от подготовки образцов ткани до окрашивания. При оценке экспрессии PD-L1 учитывалась только мембранная окраска опухолевых клеток независимо от интенсивности и полноты окрашивания клеточной мембраны (частичная, субтотальная, полная). Окраска ядер и цитоплазмы клеток опухоли, окраска антигенпрезентирующих и лимфоидных клеток в опухоли не учитывались. Образцы с уровнем экспрессии PD-L1 в опухолевых клетках менее 5% были расценены как негативные, 6% и более - как позитивные [36]. Статистическая обработка данных Взаимосвязь экспрессии PD-L1 с клинико-патологическими признаками оценивали с помощью точных тестов Фишера и тестов Вилкоксона-Манна-Уитни. Общая выживаемость рассчитывалась с момента постановки диагноза до даты смерти от любых причин или до даты последнего контакта с пациентом. Анализ выживаемости в зависимости от экспрессии PD-L1 проводили с использованием кривых Каплана -Мейера, значение было проверено с помощью логарифмического теста. Все значения р определялись двухсторонними тестами и значения р < 0,05 считались значимыми. Многфакторный анализ проводился с использованием модели регрессии Кокса, включающей только клинические переменные и маркёры экспрессии антител, которые имели значение при однофакторном анализе. Результаты Клинико-морфологические характеристики изу-чаемой группы суммированы в табл. 1. Как видно из табл.1, в основном группа была представлена эпителиоидным типом ЗМП - 73,3%. Средний возраст больных составил 57 лет (диапазон 29-76 лет). Среди больных отмечено незначительное преобладание женщин (57%). Это несколько противоречит данным мировой литературы о преобладании мужчин. Все пациенты были разделены на две группы - А и Б. Группа А, в которой было 18 человек, получала лечение по схеме пеметрексед в комбинации с препаратами платины. Группа Б в составе 12 человек получала лечение по схеме гемцитабин в комбинации с препаратами платины. Распределение показано в табл. 2. Опухоли с положительным статусом PD-L1 встречались в большинстве случаев (различия статистически недостоверны р < 0,2) в обеих группах. Результаты анализа гистологического подтипа опухоли и экспрессии PD-L1 приведены в табл. 3. Эпителиоидный тип ЗМП отмечался у 22 (73,3%) больных из 30, в том числе с негативным статусом PD-L1 - у 55% (12/22), со средним уровнем экспрессии - у 36% (8/22), с высоким уровнем экспрессии - у 9% (2/22). При неэпителиоидном типе ЗМП (у 8 (26,6%) из 30 больных) высокий уровень экспрессии выявлен во всех случаях (100%). Экспрессия PD-L1 достоверно чаще встречалась при неэпителиоидном типе ЗМП (р < 0,001). Позитивный PD-L1 статус ЗМП дополнительно был разделён на группы в зависимости от доли окрашенных клеток. У 12 (40%) пациентов отмечалась экспрессия ниже 5% порогового значения. Высокий уровень экспрессии (более 50% опухолевых клеток экспрессировали PD-L1) отмечен у 10 (33,3% ) пациентов. В оставшихся 8 (26,7%) случаях от 6 до 50% опухолевых клеток экспрессировали PD-L1, что было расценено как средний уровень экспрессии. Выживаемость и PD-L1-статус ЗМП В нашем исследовании экспрессия PD-L1 в опухоли коррелировала с отдалёнными результатами. Пациенты с PD-L1-отрицательным статусом ЗМП демонстрировали более высокую общую выживаемость по сравнению с группой, где PD-L1-статус был выше порогового значения. Медиана общей выживаемости при позитивном статусе PD-L1составила 15,6 мес, тогда как при негативном статусе - 41,0 мес (р = 0,00026 Cox`s f-test; p = 0,00188 Long-Rank test) (см. рисунок). Показатели двух- и трёхлетней общей выживаемости больных при отрицательном PD-L1-статусе опухоли составили 100 и 73% соответственно, тогда как для положительного PD-L1 эти показатели составили 26 и 19,1%. Используя многофакторный анализ с моделью регрессии Кокса, которая включала многие переменные, мы обнаружили, что PD-L1 является важным прогностическим фактором, экспрессия которого коррелирует с общей выживаемостью пациентов со ЗМП. Дискуссия ЗМП до сих пор остаётся редкой, малоизученной опухолью с крайне неблагоприятным прогнозом и нечувствительностью к химиотерапии. За последние 10-летия отмечен неуклонный рост заболеваемости. Без лечения средняя продолжительность жизни составляет 9 мес, а 5-летняя выживаемость не превышает 3%. Поиск новых патологических путей в развитии данной опухоли поможет определить предикторы эффективности лечения и продолжительности жизни больных. Целью данного исследования является изучение экспрессии PD-L1 у пациентов с диссеминированной ЗМП и корреляции экспрессии с отдалёнными результатами. Наши данные показывают, что ЗМП экспрессирует PD-L1 в 60% случаев, что ассоциировано с плохим прогнозом. Так, при неэпителиоидном типе экспрессия PD-L1 встречается чаще, чем при эпителиоидном. Подобные данные о связи экспрессии PD-L1 с гистологией подверждают другие авторы. A. Mansfield и соавт. сообщают, что каждая саркоматоидная ЗМП экспрессирует PD-L1 [34]. Экспрессия PD-L1 в опухоли чаще всего измеряется иммуногистохимически, однако ни один тест не принимается в качестве стандарта для его количественного определения. Также неизвестна клиническая значимость локализации PD-L1. Различные антитела, используемые в клинических исследованиях, фокусируют разные локализации. Среди других характеристик, проанализированных в нашем исследовании (пол, возраст, клиническая стадия, схема химиотерапии), мы не наблюдали никакой ассоциации с экспрессией PD-L1. Таким образом, это первые данные в России, в которых представлены результаты оценки клинико-молекулярных характеристик ЗМП с учётом уровня экспрессии. Наши данные показывают, что этот параметр может быть использован как прогностический маркёр продолжительности жизни, а также предиктор ответа на анти-PD-1/PD-L1 иммунотерапию.

About the authors

Tatyana D. Karpenko

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: katan4ik@list.ru
Doctor of the Surgical Department № 13 of the Thoracal Abdominal Department ; Moscow, 115478, Russian Federation Moscow, 115478, Russian Federation

N. A Kozlov

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

L. N Lubchenko

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

L. E Rotobelskaya

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

S. G Bagrova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

V. M Safronova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

K. K Laktionov

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

M. B Bychkov

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

References

Supplementary files