ASSOCIATION OF MICRORNA EXPRESSION WITH EARLY STAGE OF BREAST CANCER METASTASIS

Full Text

Рак молочной железы (РМЖ) относится к наиболее распространённым типам рака. Каждый год РМЖ диагностируется у 2,1 миллиона женщин. По оценкам, в 2018 г. от РМЖ умерло 627 тыс. женщин - это примерно 15% всех случаев смерти от рака среди женщин. В то время как уровень заболеваемости РМЖ выше среди женщин в более развитых регионах, он увеличивается почти во всех регионах мира [1]. Серьёзным осложнением РМЖ является метастазирование опухолевых клеток в ткани других органов. Инвазивный РМЖ развивается у 240 тыс. женщин и приводит к 40 тыс. смертельных случаев в год в США [2]. Инициация данного процесса происходит в близлежащие лимфатические сосуды, и в основном данный процесс затрагивает подмышечный лимфатический узел. Несмотря на достижения высокого охвата скрининговыми методами, почти у 12% женщин с РМЖ обнаруживают метастазы. Метастазирование наиболее часто приводит к летальному исходу. В настоящее время существует ряд эффективных методов лечения РМЖ, но метастатический РМЖ редко поддаётся лечению. Хотя хирургическое вмешательство является основным методом лечения, большое значение имеет адъювантная химиотерапия. Этот факт, а также развитие персонализированной медицины приводят к задаче более точного прогнозирования течения заболевания, связанного с этим объёма хирургического вмешательства, а также выбора средств таргетной терапии у больных РМЖ. На сегодняшний день молекулярные механизмы метастазирования недостаточно изучены и требуются дальнейшие исследования. В этом плане уровень экспрессии микроРНК может дать информацию как о механизмах развития метастазирования, так и быть источником маркеров прогноза метастатического рака молочной железы. Выявление и изучение микроРНК, тесно связанных с развитием метастатического РМЖ, могут внести существенный вклад в понимание процессов, происходящих при метастазировании опухоли, и персонификацию лечения. Таким эффективным средством диагностики может быть метод, основанный на количественном определении уровня микроРНК. МикроРНК представляют собой группу небольших молекул, которые эволюционно высококонсервативны и кодируются примерно 1% генома у большинства видов. Это класс некодирующих белок РНК, которые функционируют в качестве регуляторов генов путём деградации их мРНК-мишеней и ингибирования трансляции. Было обнаружено более 2 тыс. микроРНК человека, которые регулируют около 30% всех генов [3]. В настоящей работе по данным литературы нами были отобраны 4 микроРНК (miR-34a, miR-145, miR-125b и miR-222), потенциально способных быть связанными с метастазированием, для изучения их ассоциации с метастазированием в лимфатические узлы на ранней стадии. Материалы и методы В данной работе исследовались парные свежезамороженные образцы нормальной и опухолевой ткани молочной железы больных, проходивших лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. В исследование были включены парные образцы (опухоль-норма) ткани молочной железы 40 больных РМЖ в возрасте 36-83 года, включая 10 больных с ранними метастазами в лимфатические узлы (преимущественно N1). Все образцы охарактеризованы гистологически, иммуногистохимически и классифицированы по TNM, а также указаны баллы по рецепторам эстрогена и прогестерона. Основное их число представлено инфильтративным протоковым РМЖ и 24 больных имеют более 5 баллов по рецептору эстрогена (медиана уровня экспрессии рецепторов эстрогена α в опухолевой строме) по данным иммуногистохимии. В выборке представлены в основном больные с РМЖ люминального типа А и В. Выделение РНК производили при помощи наборов: miRNeasyMiniKit (QIAGEN, США) - предназначенных для ткани. Все процедуры проводили согласно инструкции к наборам. Наличие и качество РНК проверяли, используя электрофорез в 1,8% агарозном геле. Электрофорез проводили в горизонтальном аппарате для электрофореза SUB CELL 96 BIO-RAD производства США при постоянной силе тока 130 мА в течение 30 мин. Концентрацию водного раствора РНК определяли на спектрофотометре Nanodrop 1000 (ThermoScientific, США) согласно инструкции к прибору. Обратную транскрипцию проводили, используя набор TagManMicroRNAReverseTranscriptionKit (AppliedВiosystems, США). Уровень экспрессии измеряли с помощью прибора для ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)-StepOnePlus (AppliedВiosystems, США). Каждое измерение проводили трижды. ПЦР-РВ осуществляли с использованием наборов для оценки уровня экспрессии микроРНК TaqMan® miRNAAssays hsa-miR-125b-5p,TaqMan® miRNAAssays hsa-miR-222*, TaqMan® miRNA hsa-miR-34a-5p, TaqMan® miRNAAssays hsa-miR-145. Анализ результатов проводили с помощью встроенного программного обеспечения StepOneSoftware, которое позволяет сравнить относительные количества целевой последовательности РНК в опухолевой и нормальной ткани. В качестве контрольной использовали микроРНКu48. В результате обработки измерений получены значения уровней экспрессии микроРНК в опухолевой ткани относительно нормальной. Полученный массив данных обрабатывался с использованием пакета стандартных программ Statistica 10.0 иMedCalc. Уровень значимости для выявленных различий принимали равным <0,05. Методом количественной ПЦР-РВ в парных образцах (опухоль-норма) у 40 больных были определены уровни экспрессии 4 микроРНК: miR-34a, miR-145, miR-125b и miR-222. Больные были разбиты на 2 группы по исследуемому признаку, метастазирование в лимфатические узлы. С использованием ROC-анализа были определены пороги, оптимально разделяющие метастазирующие опухоли и без метастазов по уровню экспрессии микроРНК, которые составили: для miR-34a больше 31,6, для miR-125b больше 3,6, для miR-145 больше 2, для miR-222 больше 3. Дальнейшую обработку производили с использованием данных порогов статистическим методом с использованием критерия Фишера. Уровень значимости принимали равным менее 0,05. Результаты Были исследованы особенности экспрессии 4 микроРНК (miR-34a, miR-145, miR-125b и miR-222) в парных образцах РМЖ (опухоль-норма) без метастазирования в лимфатические узлы (N0) и на ранних этапах метастазирования в лимфатические узлы (N1). Первоначально были определены частоты пониженной или повышенной экспрессии указанных микроРНК относительно нормальной ткани. В соответствии с полученными результатами, микроРНК miR-34a экспрессируется примерно в одинаковом числе случаев как пониженно, так и повышенно относительно нормы, в то время как miR-145, miR-125b и miR-222 экспрессируются в основном (65-85% случаев) пониженно по отношению к нормальной ткани (рис. 1). Также были отдельно проанализированы группы метастазирующих опухолей и без метастазов. Так как было заметно обогащение опухолей больных с метастазированием экспрессией рецептора эстрогена более 5 баллов (9 больных из 10), предварительно была проанализирована возможная связь метастазирующих опухолей с эстрогеновым статусом. Было получено, что частоты опухолей с высокими баллами эстрогена и меньше 5 не отличаются в группах с и без метастазирования в лимфатические узлы (р=0,4). То есть накопление метастатических опухолей в группе с экспрессией эстрогена является случайным. При анализе экспрессии микроРНК отдельно по группам, видно, что профиль экспрессии микроРНК в группе без метастазирования в лимфатические узлы похож на профиль экспрессии целой выборке (рис. 1 и 2а). В то же время профиль экспрессии в группе больных с ранним началом метастазирования в лимфатические узлы демонстрирует, что микроРНК miR-34a, miR-125b и miR-222 экспрессируются примерно в одинаковом числе случаев как пониженно, так и повышенно, а miR-145 экспрессируется в основном пониженно (80% случаев) (рис. 2б). Как видно при анализе указанных профилей экспрессии, наиболее значимые изменения по отношению к неметастазирующим опухолям наблюдаются для микроРНК miR-125b - повышенная экспрессия в группе с метастазированием составила большую долю случаев (40%) по сравнению с группой без метастазов (4%). Подобные отличия наблюдались и в отношении miR-222 - в группе с метастазирующими опухолями заметно больше случаев с повышенной экспрессией. Характеристики экспрессии miR-145 практически не изменились, невелики отличия экспрессии miR-34a (рис. 2 а,б). Для более детального изучения связи экспрессии микроРНК с метастазированием в лимфатические узлы были выбраны miR-125b и miR-222. С использованием точного критерия Фишера и определённых при ROC анализе пороговых значений экспрессии была найдена ассоциация экспрессии 2 микроРНК (miR-125b и miR-222) с началом метастазирования в лимфатические узлы: с одинаковым уровнем достоверности различия (р=0,01). Экспрессия этих микроРНК связана с существенным риском метастазирования РМЖ. Относительный риск (ОР) составил для miR-125b ОР = 6,00, 95%ДИ 1,39 -25,95 и для miR-222 ОР = 2,16, 95%ДИ 1,89 - 3,62. Обсуждение Хотя участие микроРНК в метастазировании РМЖ известно, их роль в развитии РМЖ на ранней стадии метастазирования изучена недостаточно. Нами исследована связь экспрессии 4 микроРНК с началом метастазирования в лимфатические узлы (N1). Экспрессия 3 из изученных микроРНК (miR-145, miR-125b и miR-222) была понижена в основном числе образцов, что согласуется с данными, полученными в других работах [4-6]. МикроРНК miR-34а в нашей выборке была экспрессирована в близком соотношении по числу образцов как повышенно, так и пониженно относительно нормальной ткани. Имеющиеся в литературе данные неоднозначны - наблюдали как пониженную экспрессию miR-34a при РМЖ [7], так и разнонаправленную экспрессию этой микроРНК в различных образцах РМЖ [8]. Такая ситуация обусловлена, видимо, разным составом выборок РМЖ. Например, при люминальном раке чаще наблюдается повышение экспрессии miR-34a относительно нормы [8]. С ранней стадией метастазирования в лимфатические узлы оказались ассоциированы 2 микроРНК (miR-125b и miR-222). Данные литературы по микроРНК miR-125b противоречивы. Эта микроРНК по-разному экспрессируется в разных типах онкологических заболеваний, однако в опухолях яичника и молочной железы - низко экспрессируется [5]. Полученные нами результаты при неметастатическом РМЖ коррелируют с данными литературы. Но при исследовании ассоциации miR-125b с ранним началом метастазирования в лимфатические узлы было выявлено статистически достоверное увеличение числа случаев с повышенной экспрессией при метастазировании. То есть, повышенная экспрессия miR-125b ассоциирована с началом метастазирования в лимфатические узлы. Эти данные указывают в пользу действия этой микроРНК в качестве онкомира. Такое действие может быть связано с её участием в процессах эпителиально-мезенхимального перехода. Эпителиально-мезенхимальный переход - это процесс молекулярного перепрограммирования и фенотипического изменения, которое проявляется переходом эпителиальных клеток, связанных друг с другом полярной связью, что позволяет им быть неподвижными и крепко сцепленными, к подвижным мезенхимальным клеткам, что повышает их инвазивные свойства. Эпителиально-мезенхимальный переход сигнализирует о ранней стадии метастазирования, так как клетки, в которых происходят молекулярные изменения для разрыва соединения «клетка-клетка», способны отделяться от первичного очага опухоли, проникать через базальную мембрану в кровоток и приобретать обратно эпителиальный фенотип с образованием метастаза [9]. Повышенная экспрессия miR-125b способна приводить к изменению фенотипа клеток РМЖ (эпителиально-мезенхимальный переход), действуя через свою прямую мишень - ген-супрессор опухоли STARD13, путем реорганизации актиновогоцитоскелета. MiR-125b оказывает положительное действие на экспрессию Vimentin и α-SMA, также участвующих в процессе эпителиально-мезенхимального перехода. Сообщалось, что микроРНК могут находиться в ломких участках хромосом, в частности, микроРНК miR-125b-1 находится в участке хромосомы 11q23. Возможно, что хромосомные транслокации могут привести к аберрантно высокой экспрессии miR-125b в молочной железе и других типах опухолей. Кроме того, микроРНК miR-125b может вмешиваться в онкогенную передачу сигналов, ингибируя ключевые компоненты сети p53, действуя как онкогенная miRNA, напрямую взаимодействуя с геном-супрессором опухоли p53 [10]. Ещё одна микроРНК - miR-222 - имела существенное различие экспрессии между группами с ранним метастазированием опухолей и без метастазирования. Данная микроРНК также оказывает влияние на эпителиально-мезенхимальный переход посредством гена-мишени TRPS1и ZEB. Нокдаун гена TRPS1 приводит к увеличению экспрессии ZEB2, что в свою очередь через ген E-cadherin приводит к потере контакта «клетка-клетка». Увеличение экспрессии miR-222 способствует усилению миграции клеток и инвазии. Негативная регуляция мРНК E-кадгерина с помощью miR-221/222 является результатом воздействия miR-221/222 на TRPS1 и, таким образом, ослабления его ингибирования ZEB2 [6]. Наша работа демонстрирует увеличение экспрессии онкомира miR-222 при метастазировании. Впервые была показана ассоциация повышенной экспрессии данной микроРНК с начальным этапом метастазирования в лимфатические узлы. Таким образом, обе микроРНК (miR-125b и miR-222) участвуют в метастазировании РМЖ, видимо, посредством воздействия на эпителиально-мезенхимальный переход. Повышенные экспрессии данных микроРНК в опухолях молочной железы по сравнению с условно-нормальной тканью указывают на их роль как онкомиров в данном типе опухолей. Вследствие их связи с ранним метастазированием РМЖ они потенциально могут выступать в качестве прогностических биомаркеров для оценки вероятности ранних метастазов в лимфатические узлы при РМЖ.

About the authors

Kristina A. Grishina

Research Centre for Medical Genetics (RCMG)

Email: grstina@yandex.ru
researcher of the Laboratory of molecular genetics of complex inherited diseases RCMG 115522, Moscow, Russian Federation

N. I Pospekhova

Research Centre for Medical Genetics (RCMG)

115522, Moscow, Russian Federation

V. A Khaylenko

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology оf the Ministry of Health of the Russian Federation

115478, Moscow, Russian Federation

A. V Karpukhin

Research Centre for Medical Genetics (RCMG)

115522, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files