Оценка функциональной активности и специфичности промотора гена hSLPI

Полный текст

ОБОСНОВАНИЕ

Рак является одной из основных причин смертности во всём мире, как среди мужчин, так и среди женщин. Несмотря на успехи в области химиотерапии, хирургии и лучевой терапии, по-прежнему существуют ограниченные возможности лечения рака на поздних стадиях, которые включают лишь паллиативные методы [1]. Согласно стандартным протоколам противоопухолевой терапии, для лечения местных неметастатических опухолей применяют хирургию и лучевую терапию, в то время как системная химиотерапия, гормональная и биологическая терапия предпочтительно используются для лечения прогрессирующих метастатических опухолей. Улучшение понимания молекулярной биологии опухолевых клеток, исключительные особенности опухолевого роста, а также токсичность, оказываемая химиотерапевтическими препаратами и вызывающая нежелательное массивное разрушение нормальных клеток организма, обусловили необходимость поиска альтернативных целенаправленных и эффективных методов лечения рака, среди которых наиболее перспективным считается генная терапия [2].

Подходы генной терапии основаны на внесении в клетки-мишени терапевтического гена с целью замены мутантных генов, ассоциированных с развитием канцерогенеза, или генов, вызывающих гибель опухолевых клеток [3–5]. Первые генотерапевтические конструкции, в которых терапевтический ген находился под контролем конститутивных промоторов цитомегаловируса (CMV) или вируса обезьян (SV-40), не обладали избирательностью действия и экспрессировали противоопухолевый агент во всех клетках организма, оказывая токсический эффект и на нормальные клетки. Достичь строгого уровня селективности генотерапевтических препаратов позволило открытие опухоль-специфичных промоторов, гиперактивных в определённых типах раковых клеток и практически не активных в нормальных клетках [6]. Среди них выделяют регуляторные области генов, кодирующих белки, гиперэкспрессированные в различных типах опухолевых клеток и ассоциированные с их злокачественной трансформацией: теломеразу (hTERT), блокаторы апоптоза (BIRC5), рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), белки гомологичной рекомбинации (Rad51), тироидный транскрипционный фактор 1 (TTF-1), ингибитор секреторной лейкоцитарной протеазы человека (hSLPI), карциноэмбриональный антиген (CEA) и другие [2, 7–9]. Кроме того, известны промоторы, гиперактивные на определённых стадиях канцерогенеза, таких как ангиогенез и метастазирование [10].

Несмотря на полученные данные, характеризующие специфичность и активность опухоль-специфичных регуляторных областей, гетерогенность раковых клеток не позволяет чётко спрогнозировать транскрипционную активность определённой промоторной области, и как следствие, эффективность терапии. Поэтому критически важным фактором в разработке селективных генотерапевтических подходов является подбор оптимального опухоль-специфичного промотора для конкретного типа опухолевой ткани.

• Цель — оценка функциональной активности и специфичности промотора ингибитора секреторной лейкоцитарной протеазы человека hSLPI для последующей разработки на его основе генетической конструкции, селективно экспрессирующей цитотоксические терапевтические гены в опухолевых клетках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные плазмиды, штаммы и условия культивирования

Промоторную область гена ингибитора секреторной лейкоцитарной протеазы человека (hSLPI) клонировали в вектор pTurboGFP-PRL (Евроген, Россия) с использованием штамма Escherichia coli NEB5α (New England Biolabs, США). Бактерии выращивали на стандартной среде LB (пептон — 1,5%, NaCl — 0,5%, дрожжевой экстракт — 0,5%) при 37 ℃ в шейкер-инкубаторе Multitron Standart (INFORS HT, Швейцария) при 160 об./мин. При выращивании штаммов, несущих плазмиды, в среду добавляли канамицин (30 мкг/мл).

Для оценки эффективности трансфекции использовали плазмиду pTurboGFP-C (Евроген, Россия), в которой репортёрный ген зелёного флуоресцентного белка TurboGFP находится под контролем конститутивного промотора цитомегаловируса CMV.

Клеточные линии

Для трансфекции использовали линии опухолевых клеток аденокарциномы лёгких человека А549, эпителиоидной карциномы шейки матки HeLa, аденокарциномы молочной железы MCF-7, полученные из коллекции АТСС (США), и культуру клеток нормальных фибробластов лёгких эмбриона человека WI-38, полученную из «Коллекции клеточных культур позвоночных» Института цитологии Российской академии наук. Клетки растили при 37 ℃ в атмосфере с 5% CO₂ на стандартной среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 2 мМ глутамина, пенициллина/стрептомицина и канамицина (по 100 ед.).

Полимеразная цепная реакция

Полноразмерный промотор гена hSLPI и его фрагменты амплифицировали с геномной ДНК фибробластов лёгкого L-68 (Сибэнзим, Россия) с использованием высокоточных Phusion (Thermo Fisher Scientific, США) и Encyclo (Евроген, Россия) ДНК-полимераз и праймеров F-hSLPI-Xho, F-hSLPIa-Xho, F-hSLPIb-Xho и R-hSLPI-Bam, последовательность которых представлена в табл. 1. Температуру отжига праймеров рассчитывали с использованием сервиса Tm Calculator (Thermo Fisher Scientific, США).

 

Таблица 1. Праймеры, используемые в работе

Table 1. Primers used in the study

Праймер	Последовательность 5’→3’
F-hSLPI-Xho	ACTATACTCGAGCTCACTGCAGCCTCAAAC
F-hSLPIa-Xho	ACTATACTCGAGAGATCTCAAATTATCTCACAGCT
F-hSLPIb-Xho	ACTATACTCGAGCTGAGACAACTGAGCTCCAG
R-hSLPI-Bam	AGATAAGGATCCGGTGAAGGCAGGAGTGAC
GFP_F	GAGATCGAGTGCCGCATCAC
GFP_R	GCCTTTGGTGCTCTTCATCTTG
GAPDH_F	CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTC
GAPDH_R	CAAAGTGGTCGTTGAGGGCAATG

 

Для оптимизации условий полимеразной цепной реакции (ПЦР) подбирали ДНК-полимеразу, варьировали состав реакционной смеси (количество матрицы, праймеров и ионов Mg₂⁺), а также режим амплификации (длительность каждого этапа реакции, температуру отжига праймеров). Оптимизированный режим амплификации полноразмерного промотора hSLPI и его фрагментов представлен в табл. 2.

Электрофорез

Горизонтальный электрофорез ДНК проводили в 1–1,5% агарозном геле в ТАЕ буфере (48,4 г/л трис-аминометана, 11,4 мл/л ледяной уксусной кислоты, 100 мл/л 0,5 М ЭДТА, рН 8,5), при напряжении 100 В, в течение 30–45 мин. Для контроля подвижности ДНК в геле, а также для детекции ДНК в ультрафиолетовом свете использовали раствор 6×DNA-Dye NonTox (AppliChem GmgH, Германия). Гель просматривали в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм. Для приблизительной оценки длин фрагментов ДНК использовали ДНК-маркёры 1 Kb (Сибэнзим, Россия) и 50 bp+ (Евроген, Россия).

Клонирование промотора

Полученный продукт амплификации промотора гена hSLPIа и вектор pTurboGFP-PRL гидролизовали по сайтам рестрикции XhoI и BamHI в течение 3 ч при 37 ℃. ПЦР-продукт до и после проведения рестрикции очищали от примесей с помощью GeneJet PCR Purification kit (Thermo Fisher Scientific, США). Рестрицированные фрагменты вектора разделяли в агарозном геле, а участки, соответствующие необходимым фрагментам, вырезали из геля и экстрагировали с использованием набора LumiPure DNA Gel Extraction Kit (Lumiprobe, Россия). Очищенные продукты рестрикции лигировали при температуре 4 ℃ в течение 14–16 ч с использованием T4 ДНК лигазы (Евроген, Россия).

Полученной конструкцией трансформировали химически-компетентные клетки E. coli NEB 5α методом теплового шока [11]. Для трансформации к 100 мкл компетентных клеток добавляли 10 мкл лигазной смеси. Далее подвергали клетки температурному шоку: инкубировали на льду в течение 40 мин, затем нагревали до 42 ℃ на водяной бане в течение 90 с, после чего снова помещали на лед на 2 мин. В каждый образец добавляли 600 мкл среды LB и инкубировали при 37 ℃ в течение 60 мин с аэрацией. После инкубации клетки высевали на чашки с L-агаром с добавлением канамицина (30 мкг/мл) и отбирали канамицин-устойчивые клоны. Правильность сборки конструкции подтверждали ПЦР и рестрикционным анализом и секвенированием по Сэнгеру.

Трансфекция клеток

Для проведения трансфекции культуры клеток A549 (10⁵ кл./лунку), HeLa (1,5×10⁵ кл./лунку) MCF-7 (2×10⁵ кл./лунку), и WI-38 (2×10⁵ кл./лунку), высевали в 24-луночные культуральные планшеты и растили до достижения клетками 70–85% конфлюентности. На следующий день клетки трансфицировали созданной репортёрной конструкцией pTurboGFP-hSLPIа и плазмидой pTurboGFP-C, применяемой для оценки эффективности трансфекции, при помощи реагента Lipofectamine-3000 (Invitrogen, США), согласно протоколу производителя. Соотношение реагента к ДНК в реакции составило 3:1, количество ДНК в лунке — 500 нг. В отдельных пробирках смешивали 1,5 мкл Липофектамина 3000 и 25 мкл среды Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific, США), и 500 нг ДНК и 25 мкл среды Opti-MEM, содержащей 1 мкл реагента P3000 (Thermo Fisher Scientific, США). Содержимое пробирок объединяли и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Полученную смесь добавляли к клеткам и инкубировали в атмосфере 5% СО₂ при 37 ℃ в течение 48 ч.

Оценка эффективности трансфекции

Эффективность трансфекции оценивали по интенсивности флуоресценции репортёрного белка TurboGFP в голубом спектре (480 нм) на флуоресцентном микроскопе Axio Imager 2.0 (Carl Zeiss, Германия). Максимум возбуждения флуоресценции для TurboGFP составляет 482 нм, максимум эмиссии — 502 нм.

Выделение суммарной рибонуклеиновой кислоты

Суммарную РНК трансфицированных клеток A549, MCF-7, HeLa и WI-38 выделяли реагентом RiZol (Диа-М, Россия) согласно протоколу производителя. Концентрацию выделенных образцов РНК измеряли на флуориметре Qubit 2.0 (Invitrogen, США). Полученную суммарную РНК обрабатывали ДНКазой I, прогревали 10 минут при 75 ℃.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени с обратной транскрипцией

Уровень экспрессии промотора hSLPa оценивали по количеству транскриптов гена зелёного флуоресцентного белка TurboGFP. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора RNAscribe RT (Biolabmix, Россия). Реакционную смесь, состоящую из 10 нг суммарной РНК и 2,5 мкМ смеси случайных нонануклеотидов и олиго(dT)18 (Biolabmix, Россия), прогревали в течение 3 минут при 70 ℃. В охлаждённую смесь добавляли 5×RT-буфер и 100 ед. RNAscribe RT ревертазы, инкубировали 5 минут при 25 ℃, а затем 30 минут при 50 ℃. Реакцию останавливали прогреванием при 85 ℃ в течение 5 минут. Полученную кДНК использовали для ПЦР в реальном времени, добавляя 2,5 мкл в реакционную смесь, состоящую из 2×ПЦР-смеси БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (Biolabmix, Россия), 0,4 мкМ прямого и обратного олигонуклеотидов. Последовательности олигонуклеотидов, используемых для амплификации генов GAPDH и TurboGFP, представлены в табл. 1. Программа ПЦР включала первичную денатурацию в течение 5 минут при 95 ℃ и 39 циклов, состоящих из денатурации (15 секунд, 95 ℃), отжига (15 секунд, 60 ℃) и элонгации (20 секунд, 72 ℃). Амплификацию проводили с использованием CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США). Режим реакции представлен в табл. 2.

 

Таблица 2. Режимы амплификации полноразмерного промотора гена hSLPI и его фрагментов

Table 2. Modes of amplification of the full-size hSLPI gene promoter and its fragments

Этапы реакции	hSLPI	hSLPIa/ hSLPb
Предварительная денатурация	95 ℃, 3 мин	95 ℃, 3 мин
Денатурация	95 ℃, 10 с	95 ℃, 1 мин
Отжиг	56 ℃, 30 с	64 ℃, 45 с
Элонгация	72 ℃, 51 с	72 ℃, 1 мин
Количество циклов	30	35
Финальная элонгация	72 ℃, 5 мин	72 ℃, 10 мин
ДНК-полимераза	Phusion	Encyclo

 

Полученные данные ПЦР анализировали с помощью стандартной программы Bio-Rad iQ5 v.2.0 (Bio-Rad Laboratories, США). Для каждого образца определяли пороговый цикл (Ct). Уровень представленности транскриптов и относительной экспрессии мРНК в опухолевых клетках нормализовали на уровень экспрессии гена домашнего хозяйства GAPDH. Уровень экспрессии промотора hSLPa оценивали относительно уровня экспрессии конститутивного промотора CMV в контроле. Для этого вычисляли уровень экспрессии TurboGFP в контрольном (ΔСtCMV=CtCMV–CtGADPH) и опытных (ΔСthSlpa=CthSlpa–CtGADPH) образцах. Изменение экспрессии TurboGFP в опытных образцах относительно контрольного вычисляли по формуле ΔΔCt=ΔСthSlpa–ΔСtCMV. Относительный уровень экспрессии GFP рассчитывали, как 2–ΔΔCt, что определяет кратное увеличение или уменьшение экспрессии исследуемого гена в опытных образцах относительно контрольного.

Статистическая обработка

Статистическую обработку и визуализацию полученных данных выполняли в программе GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, США). Для множественного сравнения нескольких независимых выборок использовали дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным тестом Тьюки. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез в данном исследовании принимался p=0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Создание генетической конструкции для экспрессии репортёрного гена под управлением промотора hSLPа

Для промотора гена ингибитора секреторной протеазы лейкоцитов человека hSLPI показано, что высокой транскрипционной активностью помимо полноразмерного участка размером 1250 пар оснований обладают и его редуцированные фрагменты протяжённостью 877 пар оснований (область с −849 до +22) и 684 пар оснований (область с −650 до +22), обозначенные как hSLPIа и hSLPIb соответственно [12]. Для получения промоторных областей гена hSLPI в данной работе использовали соответствующие праймеры, позволяющие амплифицировать участки различной протяжённости, отличающиеся 5’-областями (рис. 1, a). Поскольку промоторные области, ввиду высокого ГЦ-состава, относятся к сложноамплифицируемым матрицам [13], на первом этапе работы проводили оптимизацию условий полимеразной цепной реакции: увеличивали продолжительность первичной денатурации, варьировали концентрацию праймеров и ионов магния, изменяли температуру отжига, а также подбирали ДНК-полимеразу. В качестве матрицы использовали геномную ДНК фибробластов лёгких человека L-68. В результате высокоспецифичные фрагменты hSLPIa и hSLPIb, размером около 900 пар оснований и 700 пар оснований соответственно, удалось получить с использованием полимеразы Encyclo при увеличении первичной денатурации ДНК-матрицы до 3 минут, а концентрации магния до 2 мМ, температура отжига праймеров составила 64 ℃ (см. рис. 1, b). ПЦР-продукт полноразмерного участка промотора hSLPI содержал примесные фрагменты (см. рис. 1, b), поэтому для следующего этапа работы среди полученных участков промотора hSLPI был выбран более протяжённый — hSLPа, размером 877 пар оснований.

 

Рис. 1. Клонирование фрагментов промотора гена hSLPI в вектор pTurboGFP-PRL: a — последовательность фрагментов промотора гена hSLPI и схема плазмиды pTurboGFP-PRL; b — продукты амплификации фрагментов промотора гена hSLPI; c — рестрикционный анализ вектора pTurboGFP-PRL и вставки hSLPа, размером 4070 пар оснований и 877 пар оснований соответственно.

Fig. 1. Cloning of fragments of the hSLPI gene promoter into the pTurboGFP-PRL vector: a — nucleotide sequence of the hSLPI promoter fragments and the scheme of the pTurboGFP-PRL plasmid; b — products of amplification of the hSLPI gene promoter fragments; c — restriction analysis of the pTurboGFP-PRL vector (4070 base pairs) and the hSLPa insertion (877 base pairs).

 

Для оценки функциональной активности и специфичности промотора hSLPа его клонировали по сайтам BamHI и XhoI в беспромоторный вектор pTurboGFP-PRL, содержащий репортёрный ген зелёного флуоресцентного белка TurboGFP. Наличие вставки в составе полученной плазмиды подтверждали рестрикционным анализом (см. рис. 1, с), правильность нуклеотидной последовательности клонируемого участка — секвенированием по Сэнгеру.

Таким образом, была создана генетическая репортёрная конструкция pTurboGFP-hSLPа, содержащая ген зелёного флуоресцентного белка TurboGFP под контролем промотора hSLPIa.

Оценка функциональной активности и специфичности промотора hSLPIa

Специфичность транскрипционной активности промотора hSLPIа оценивали на опухолевых клетках аденокарциномы лёгких человека A549, рака шейки матки HeLa, рака груди MCF-7 и нормальной линии фибробластов лёгкого эмбриона человека WI-38 с помощью флуоресцентной микроскопии по интенсивности свечения зелёного флуоресцентного белка TurboGFP. Клетки-реципиенты трансфицировали созданной репортёрной конструкцией pTurboGFP-hSLPа, в качестве положительного контроля использовали вектор pTurboGFP-С, в котором репортёрный ген TurboGFP находится под управлением конститутивного промотора цитомегаловируса CMV, активного во всех клетках млекопитающих. Для трансфекции использовали метод липофекции, оптимальные условия подбирали с использованием репортёрной конструкции pTurboGFP-С. При проведении трансфекции использовали соотношение липофектамина к ДНК — 3:1, количество ДНК в лунке — 200 нг/лунку.

Флуоресценция зелёного белка TurboGFP, экспрессируемого под управлением промотора CMV, была детектирована во всех клеточных линиях, трансфицированных плазмидой pTurboGFP-С (рис. 2). При этом при трансфекции клеток созданной репортёрной конструкцией pTurboGFP-hSLPа флуоресценция белка TurboGFP, обусловленная активностью работы промотора hSLPа, активно детектировалась только в клетках рака шейки матки HeLa (см. рис. 2). В нормальных клетках WI-38 сигнал флуоресценции выявлялся лишь в единичных клетках (см. рис. 2).

 

Рис. 2. Флуоресцентный анализ специфичности работы промотора hSLPа в клетках, трансфицированных генетической конструкцией pTurboGFP-hSLPа, спустя 48 ч культивирования; увеличение ×100.

Fig. 2. Fluorescent analysis of the specificity of the hSLPa promoter in cells transfected by the pTurboGFP-hSLPa after 48 hours of cultivation; magnification ×100.

 

Количественную оценку функциональной активности промотора hSLPа в составе созданной конструкции pTurboGFP-hSLPа проводили методом ПЦР в реальном времени по уровню экспрессии мРНК репортёрного гена TurboGFP в трансфицированных клетках через 48 ч культивирования. Транскрипционную активность промотора hSLPа рассчитывали относительно конститутивного промотора CMV, активного во всех клетках. Так, повышенный уровень экспрессии мРНК гена TurboGFP был выявлен в опухолевых клетках HeLa, что говорит о наибольшей транскрипционной активности промотора hSLPа в данном типе опухолевых клеток (рис. 3). При этом в опухолевых клетках рака лёгкого А549 и рака груди MCF-7, также как в нормальных клетках WI-38, экспрессия мРНК детектировалась на низком уровне (см. рис. 3).

 

Рис. 3. Анализ экспрессии мРНК гена TurboGFP с промотора hSLPа в клетках, трансфицированных генетической конструкцией pTurboGFP-hSLPа. За единицу принят уровень экспрессии мРНК гена TurboGFP с промотора CMV в тех же клеточных линиях, трансфицированных плазмидой pTurboGFP-C; *** p=0,0002.

Fig. 3. Analysis of TurboGFP mRNA expression from the hSLPа promoter in cells transfected by the pTurboGFP-hSLPa genetic construct. The expression level of the TurboGFP mRNA from the CMV promoter in the same cell lines transfected with the pTurboGFP-C plasmid was taken as 1; *** p=0.0002.

 

Таким образом, было показано, что истинной функциональной активностью и специфичностью промотор hSLPIа обладает лишь в отношении опухолевых клеток рака шейки матки HeLa. В других исследованных в работе опухолевых линиях А549 и MCF-7 промотор hSLPа не проявлял транскрипционной активности. При этом в нормальных клетках WI-38 активность промотора также не детектировалась, что указывает на возможность разработки высокоселективной генотерапевтической конструкции на основе промотора hSLPа.

ОБСУЖДЕНИЕ

Опухоль-специфичные промоторы — одни из многообещающих инструментов в генотерапии рака, позволяющих селективно запускать экспрессию терапевтических генов исключительно в опухолевых клетках [2]. В настоящее время изучен широкий спектр промоторных областей генов, гиперэкспрессируемых в раковых клетках [7–9]. Одним из перспективных считается промотор ингибитора секреторной протеазы лейкоцитов человека (hSLPI). Целью данной работы стала оценка его функциональной активности и специфичности.

Для этого на первом этапе работы было необходимо создать репортёрную генетическую конструкцию, в которой ген зелёного флуоресцентного белка находится под контролем промотора hSLPI. Промоторные области представляют собой сложные матрицы, богатые большим количеством ГЦ-повторов, устойчивых к плавлению вторичных структур, и вызывающих остановку ДНК-полимераз, что часто приводит к неполной и неспецифической амплификации [13]. Именно поэтому для получения промотора hSLPI были использован набор праймеров, позволяющий амплифицировать его фрагменты различной протяжённости. В результате была получена репортёрная генетическая конструкция pTurboGFP-hSLPа, содержащая фрагмент промотора hSLPI, размером 877 пар оснований (см. рис. 1, b).

Известно, что промотор hSLPI обладает широким спектром функциональной активности. Гиперэкспрессия гена hSLPI обнаружена в клетках рака лёгких [14], шейки матки [15], поджелудочной железы [16] и яичников [17]. При этом в клеточной линии нормальных клеток лёгкого INR-90 детектируется низкий уровень экспрессии мРНК гена SLPI [18]. Трансфекция опухолевых клеток созданной нами репортёрной конструкцией pTurboGFP-hSLPа показала, что промотор hSLPIа способен эффективно запускать экспрессию гена флуоресцентного зелёного белка только в опухолевых клетках HeLa (см. рис. 2). В линиях опухолевых клеток рака лёгкого А549 и рака груди MCF-7 флуоресценция белка TurboGFP наблюдалась лишь в единичных клетках. Количественный анализ экспрессии мРНК гена TurboGFP показал, что активность промотора hSLPIа в клетках HeLa многократно превышает его активность как в опухолевых клетках А549 и MCF-7, так и в нормальных клетках WI-38 (см. рис. 3). При этом уровень активности опухоль-специфичного промотора hSLPIа в клетках HeLa был сопоставим с активностью неспецифичного сильного промотора CMV и составил 72% относительно активности промотора CMV в тех же клетках, которую принимали за 100%.

Таким образом, показано, что промотор ингибитора секреторной протеазы лейкоцитов человека hSLPI обладает высокой функциональной активностью и специфичностью по отношению к опухолевым клеткам рака шейки матки HeLa, что делает его перспективным инструментом для создания на его основе генотерапевтических конструкций, нацеленных на лечение рака шейки матки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на большое количество исследований, посвящённых изучению активности опухоль-специфичных промоторов, гетерогенность раковых клеток не позволяет чётко спрогнозировать транскрипционную активность той или иной промоторной области и, как следствие, эффективность терапии. Согласно данным литературы, промотор hSLPI активен в широком спектре опухолевых линий. Однако в данной работе транскрипционная активность промотора hSLPI была обнаружена только в клетках рака шейки матки HeLa. В связи с этим необходимо проводить подбор оптимального опухоль-специфичного промотора для определённой опухолевой ткани.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 21-74-10036) в рамках Программы стратегического академического лидерства Казанского федерального университета (ПРИОРИТЕТ-2030).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: Е.В. Дудкина — проведение исследований, анализ и визуализация полученных результатов, написание и редактирование текста статьи; А.С. Коснырев — проведение исследований, обработка полученных результатов и их визуализация, написание текста статьи; В.В. Ульянова — анализ полученных результатов, написание и редактирование текста статьи, подготовка текста статьи к публикации; А.И. Надырова — проведение исследований, визуализация полученных результатов, подготовка текста статьи к публикации; П.С. Морозова, Е.А. Куприянова — проведение исследований; О.Н. Ильинская — консультирование по этапам работы, редактирование текста статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

funding source. This work was supported by the Russian Science Foundation (project no. 21-74-10036) within the framework of the Strategic Academic Leadership Program of the Kazan (Volga region) Federal University (“Priority-2030”).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. Dudkina EV — performed experiments, analyzed and visualized the obtained results, wrote and edited the manuscript; Kosnyrev AS — performed experiments, processed the results obtained and visualized them, wrote and edited the manuscript; Ulyanova VV — analyzed the results obtained, wrote and edited the manuscript, prepared the manuscript for publication; Nadyrova AI — performed experiments, visualized the results obtained, prepared the text of the article for publication; Morozova PS, Kupriyanova EA — performed experiments; Ilinskaya ON — consulted on research, edited the manuscript.

Об авторах

Елена Владимировна Дудкина

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: ElVDudkina@kpfu.ru
ORCID iD: 0000-0002-2817-1384
SPIN-код: 5874-7417

канд. биол. наук, доцент

Россия, Казань, 420008, ул. Кремлёвская, д. 18

Александр Сергеевич Коснырев

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: AleSKosnyrev@kpfu.ru
ORCID iD: 0009-0008-4341-5181
SPIN-код: 8593-7837
Россия, Казань, 420008, ул. Кремлёвская, д. 18

Вера Владимировна Ульянова

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: Vera.Uljanova@kpfu.ru
ORCID iD: 0000-0003-1768-3314
SPIN-код: 8479-4593

канд. биол. наук, доцент

Россия, Казань, 420008, ул. Кремлёвская, д. 18

Алсу Ильдаровна Надырова

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: alsu.nadyrova@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-1312-0605
SPIN-код: 9618-7816
Россия, Казань, 420008, ул. Кремлёвская, д. 18

Полина Сергеевна Морозова

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: polinam0r0zz@ya.ru
ORCID iD: 0009-0006-7205-5774
Россия, Казань, 420008, ул. Кремлёвская, д. 18

Елена Андреевна Куприянова

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: elena.a.kupriyanova@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-9185-4217
SPIN-код: 9456-5596
Россия, Казань, 420008, ул. Кремлёвская, д. 18

Ольга Николаевна Ильинская

Казанский (Приволжский) федеральный университет

Email: Olga.Ilinskaya@kpfu.ru
ORCID iD: 0000-0001-6936-2032
SPIN-код: 7972-5807
Россия, Казань, 420008, ул. Кремлёвская, д. 18

Список литературы

Дополнительные файлы