Some indices of neoplastic angiogenesis in tissues of rectal tumors with various morphological structures

Full Text

Развитие и рост неоплазмы осуществляются при непосредственной ее способности продуцировать ангиогенные факторы, стимулирующие неоваску- ляризацию злокачественной опухоли. В настоящее время активно разрабатываются механизмы образования неполноценного сосудистого русла опухоли и изучаются факторы, обеспечивающие этот процесс. Установлено, в частности, что ангиогенным действием обладают компоненты плазматических мембран аденокарциномы толстой кишки, способные связываться с лектином. К проангиогенным факторам прежде всего относят факторы роста, повышение экспрессии генов которых найдено в злокачественных опухолях различного генеза [1, 2]. Вместе с тем открытым остается вопрос о том, появляется ли ангиогенная активность до начала опухолевой трансформации и роста неоплазмы или после. Сосудистая система доставляет кислород и питательные вещества, элиминирует шлаки и осуществляет паракринную стимуляцию опухолевых клеток [3]. При перевивке двух клонов аденокарциномы толстой кишки человека под кожу мышей было установлено, что образование новых сосудов предшествовало началу опухолевого роста и отмечалось уже через несколько дней после перевивки [4]. Таким образом, неоплазмы сами подготавливают себе сосудистые пути, которые необходимы для создания и поддержания в периферических клетках гипероксического и перокси- геназного состояний, необходимых для их развития. Целью настоящего исследования стало изучение показателей тканевой фибринолитической системы и уровня некоторых факторов роста в ткани полипов и злокачественной опухоли прямой кишки. Материал и методы Дизайн исследования был одобрен этическим комитетом ФГБУ «РНИОИ». Обязательным условием включения в обследование было добровольное информированное согласие всех больных. Исследовали образцы тканей, полученных от 73 больных с первичными аденокарциномами (III стадия) и 35 больных с полипами прямого отдела толстой кишки: тубулярная аденома, ворсинчатая аденома, тубулярно-ворсинчатая аденома (см. рисунок). При тубулярной аденоме определялись извитые железы. В строме отмечалась лимфоцитарная инфильтрация. В ворсинчатых аденомах определяли многочисленные тонкие ворсинки с заостренными кончиками. Сочетание тубулярных и ворсинчатых структур с преобладанием последних расценивали как тубулярно-ворсинчатые. Возраст всех больных составил от 38 до 74 лет. В ходе оперативных вмешательств производилось удаление злокачественных и доброкачественных образований кишки с последующим биохимическим исследованием образцов ткани опухоли, ткани, непосредственно прилегающей к опухолевому очагу (перифокальная зона), а также визуально неизмененных участков кишки, отступая 10 см от края опухолевой ткани (линия резекции - условно- интактная ткань). Морфологические изменения в аденомах толстой кишки. а - тубулярная аденома; б - тубулярная аденома с кистозным расширением просвета желез; в - тубулярно-ворсинчатая аденома; г - ворсинчатая аденома. Окраска гематоксилином и эозином. *200. В 10% цитозольных фракциях ткани, приготовленных на калий-фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,1% твин-20 и 1% БСА, определяли активность комплекса плазмин-антиплазмин - РАР, содержание и активность ингибитора плазминогена урокиназно- го типа (uPA), ингибитора плазминогена тканевого типа (tPA), а2-макроглобулина (Immunodiagnostik, Германия) и уровень ростовых факторов - VEGF-А и его рецептора VEGF-R, EGF (Biosource, США), IFR-1 и IFR-2 (Mediagnost, США), TGF-P1 (Bender MedSystems, Австрия) методом твердофазного им- муноферментного анализа и активность плазмино- гена (ПГ) спектрофотометрическим методом (ACTI- CHROMEPLG, США). Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel (Windows XP). Данные представлены в виде M ± m. Разницу отличий оценивали по критерию Стьюдента и считали достоверной при р< 0,05. Анализ корреляции между параметрами определяли по коэффициенту линейной корреляции Пирсона (r), корреляцию считали достоверной при р< 0,05. Результаты и обсуждение Каквидно из результатов, представленных втабл. 1, в образцах ткани злокачественной опухоли уровень VEGF-А и его рецептора превышал показатель в интактной ткани в 11,7 и 1,8 раза. При этом коэффициент VEGF-А/VEGF-R в ткани злокачественной опухоли прямой кишки, определяющий уровень свободного VEGF-А, превосходил показатель в условно интактной ткани в 6,7 раза. Выше чем в интактной ткани было содержание инсулиноподобных факторов роста IGF-I и IGF-II - в 1,6 и 2,1 раза соответственно. В ткани злокачественной опухоли прямой кишки найдено повышение, TGF-P1 относительно интактной ткани прямой кишки в 1,8 раза. Все показатели уровня изученных ростовых факторов в перифокальной зоне злокачественной опухоли прямой кишки не имели достоверных отличий от значений в ткани по линии резекции (см. табл. 1). Согласно данным литературы, уровни VEGF и его рецептора, вероятно, могут интерпретироваться как показатели злокачественности опухоли. Считается, что эти показатели играют значительную роль в проявлении и развитии рака толстой кишки [5, 6]. Это нашло подтверждение в нашем исследовании (см. табл. 1; табл. 2). Таблица 1 Уровень факторов роста в ткани новообразований прямой кишки без метастазов в печень Показатель Рак Полип опухоль перифокальная зона линия резекции опухоль перифокальная зона линия резекции VEGF-A, пг на 1 г ткани 3113,9 ± 121,4* 297,3 ± 25,6** 265,1 ± 21,9 801,8 ± 76,3* 218,7 ± 19,4** 238,1 ± 25,2 VEGF-R, пг на 1 г ткани 60,5 ± 4,2* 39,2 ± 3,6** 34,5 ± 2,8 75,7 ± 6,3* 30,9 ± 2,4** 28,0 ± 2,9 VEGF-A/ VEGF-R 51,5 ± 4,2* 7,6 ± 0,6** 7,7 ± 0,8 10,5 ± 1,2 7,1 ± 0,6** 8,5 ± 0,9 IGF-I, мкг на 1 г ткани 13,9 ± 1,4* 8,9 ± 0,9** 8,5 ± 0,7 10,1 ± 0,8 9,1 ± 0,8 9,9 ± 0,9 IGF-II, нг на 1 г ткани 7,2 ± 0,7* 3,5 ± 0,3** 3,5 ± 0,7 5,7 ± 0,5 6,5 ± 0,7 5,7 ± 0,6 TGF-P1 пг на 1 г ткани 469,7 ± 15,8* 298,2 ± 28,3** 255,4 ± 24,3 451,8 ± 32,8* 255,8 ± 21,3** 269,0 ± 21,8 EGF, пг на 1 г ткани 63,8 ± 7,4 69,8 ± 5,8 66,3 ± 5,4 80,2 ± 9,1 67,1 ± 5,8 57,2 ± 6,4 Примечание. * - достоверно по отношению к показателям в соответствующей интактной ткани; ** - в ткани соответствующей опухоли. Таблица 2 Уровень факторов роста в ткани рака прямой кишки в зависимости от метастазирования Показатель Без метастазов в печень С метастазами в печень опухоль перифокальная зона линия резекции опухоль перифокальная зона линия резекции VEGF-A, пг на 1 г ткани 3113,9 ± 121,4 297,3 ± 25,6 265,1 ± 21,9 7703,8 ± 532,4* 274,7 ± 25,3 264,1 ± 31,2 VEGF-R, пг на 1 г ткани 60,5 ± 4,2 39,2 ± 3,6 34,5 ± 2,8 65,9 ± 5,7 39,8 ± 4,1 37,8 ± 3,2 VEGF-A/VEGF-R 51,5 ± 4,2 7,6 ± 0,6 7,7 ± 0,8 150,7 ± 14,6* 6,9 ± 0,8 7,1 ± 0,6 EGF, пг на 1 г ткани 13,9 ± 1,4 8,9 ± 0,9 8,5 ± 0,7 288,2 ± 23,7* 67,7 ± 6,2* 74,1 ± 4,8* Примечание. * - достоверно по отношению к показателям в соответствующей ткани без метастазов. Так, в ткани опухоли больных раком прямой кишки, имеющих метастазы в печень, уровень VEGF-А превышал значения в ткани опухоли больных, не имеющих метастазов, в среднем в 2,5 раза (см. табл. 2). При этом уровень рецептора в ткани опухоли больных раком прямой кишки с метастазами в печень не имел достоверных отличий от значений в ткани опухоли больных, не имеющих метастазов, а коэффициент VEGF-A/ VEGF-R возрос в среднем в 2,9 раза. В опухоли больных раком прямой кишки с метастазами в печени уровень EGF был повышен в 20,7 раза относительно показателя в ткани рака без метастазов. Очевидно, что показатели VEGF-A/ VEGF-R и EGF можно считать прогностическими в плане развития прогрессирования злокачественного процесса. Анализ направленности изменения уровня VEGF, IGF-I и IGF-II в исследуемых образцах тканей показал, что оба IGF имеют прямое влияние на содержание VEGF-А в ткани злокачественной опухоли прямой кишки. Прослеживалась высокая положительная корреляционная связь уровней VEGF-А и IGF-I (г = 76;р < 0,01) и VEGF-А и IGF-II (г = 79;р < 0,01). Положительные корреляции высокой степени были выявлены между уровнем VEGF-А и TGF-P1 (г = 78; р < 0,01). Для понимания патогенетической значимости ростовых факторов интерес представляло изучение их уровня экспрессии в ткани доброкачественных образований прямой кишки (тубулярная аденома, ворсинчатая аденома, тубулярно-ворсинчатая аденома). Необходимо отметить, что мы не обнаружили достоверных различий в уровне показателей в ткани тубулярной аденомы, ворсинчатой аденомы и тубулярно-ворсинчатой аденомы, поэтому объединили их в одну группу. Было установлено, что в ткани полипов уровень VEGF-A превышал показатель в интактной ткани прямой кишки в 3,4 раза, оставаясь при этом в 3,9 раза ниже, чем в ткани злокачественной опухоли. Уровень рецептора VEGF-R в ткани полипов превышал значения показателя в интактной ткани в 2,7 раза, а ткани рака толстой кишки - в 1,3 раза. Вместе с тем уровень коэффициента соотношения VEGF-A/ VEGF-R в ткани полипов не имел достоверных отличий от показателей в интактной ткани и был в 4,9 раза ниже, чем в ткани злокачественной опухоли (см. табл. 1). Известно, что на ранних этапах малигнизации аденомы толстой кишки играет роль VEGF-А, причем рост уровня экспрессии отмечается и в участках, макро- и микроскопически не вовлеченных в патологический процесс [7]. Связывание VEGF-A с VEGF- рецептором-2 необходимо для нормального ангиогенеза и гемопоэза, и основные эффекты VEGF-A опосредованы через этот рецептор. Не обнаружено в ткани полипов изменения содержания IGF-I и IGF-II относительно интактной ткани. Повышенными по сравнению со значениями в интактной ткани были уровень TGF-P1 - в 1,7 раза и EGF - в 1,4 раза. При этом содержание TGF-P1H EGF не имело достоверных отличий от ткани такового в опухоли. Корреляционная связь была обнаружена между уровнем VEGF-A, VEGF-R, TGF-P1h EGF: положительная высокой степени - между экспрессией VEGF-A и TGF-p1(r = 81; р < 0,01) и средней - между уровнями VEGF-A и EGF (г = 62; р < 0,01), VEGF-R и EGF (г = 60; р < 0,01). Таблица 3 Показатели тканевой фибринолитической системы новообразований прямой кишки Показатель Рак Полип опухоль перифокальная зона линия резекции опухоль перифокальная зона линия резекции РАР, нг на 1 г ткани 109 ± 10,1* 64,7 ± 6,8** 77,6 ± 6,2 65,1 ± 5,4* (n = 30); 97,5 ± 3,6* (n = 5) 99 7 ± 7 5* ** 43,3 ± 3,5 Плазминоген, мМ на 1 г ткани 1,9 ± 0,14* 1,9 ± 0,2* 2,8 ± 0,3 2.9 ± 0,3 (n = 30); 1.9 ± 0,1* (n = 5) 1,7 ± 0,2*, ** 2,7 ± 0,3 t-РА акт., ед. на 1 г ткани 3,1 ± 0,73* 5,4 ± 0,5*, ** 7,1 ± 0,74 4,7 ± 0,5* 9,7±0,8*, ** 6,5 ± 0,7 t-РА содержание, нг на 1 г ткани 32,3 ± 7,8 36,2 ± 3,4 38,5 ± 6,3 46,8 ± 3,2* 71,1 ± 6,3*, ** 37,3 ± 2,4 u-РА акт., ед. на 1г ткани 0,68 ± 0,12* 0,49 ± 0,05*, ** 0,21 ± 0,05 0,28 ± 0,3 0,29 ± 0,4** 0,22 ± 0,3 u-РА содержание, нг на 1 г ткани 45,6 ± 3,2* 22,1 ± 2,1*, ** 5,7 ± 0,09 5,6 ± 0,2 5,1 ± 0,4 5,5 ± 0,6 а2-МГ, мг на 1 г ткани 8,5 ± 0,95 9,1 ± 0,7 8,95 ± 1,5 8,5 ± 0,6 47,0 ± 3,9*, ** 8,8 ± 0,9 Примечание. * - достоверно по отношению к показателям в соответствующей интактной ткани; **- в ткани соответствующей опухоли. Показатели всех изученных факторов в перифо- кальной зоне полипов достоверно не отличались от значений в интактной ткани. Полученные результаты позволяют заключить, что изменение уровня VEGF-A, VEGF-R, TGF-P1 и EGF можно считать патогенетическими факторами развития рака толстой кишки. Далее представляло интерес изучение некоторых показателей активности тканевой фибринолитиче- ской системы в опухолях прямой кишки (табл. 3). Мы обнаружили t-РА и u-PA в исследованных образцах условно-интактной ткани (по линии резекции) прямой кишки. При этом уровень и активность t-РА были выше, чем содержание и активность u-PA в 33,8 и 6,7 раза. Вместе с тем в ткани злокачественной опухоли прямой кишки уровень активаторов плазминогена имел разнонаправленный характер. Уровень активности u-PA в указанных образцах неоплазмы был повышен относительно интактной ткани в 3,2 раза, а содержание u-PA в злокачественной опухоли было выше, чем в интактной ткани, в 8 раз (см. табл. 3). Другая направленность изменений наблюдалась относительно показателей t-РА в ткани злокачественной опухоли прямой кишки. Так, уровень активности t-РА был снижен в 2,3 раза относительно интактной ткани, а содержание t-РА не отличалось от контрольных значений. Уровень плазмина в тканях опухоли была повышенной в 1,4 раза, при этом отмечалось снижение активности плазминогена в 1,5 раза (см. табл. 3). Активность а2-макроглобулина в ткани опухоли прямой кишки не имела достоверных отличий от значений в визуально не измененной ткани. Исходя из полученных результатов, очевидно, что в ткани злокачественной опухоли прямой кишки было повышено образование плазмина, а повышение уровня активаторов плазминогена связано с их важной ролью в процессе неоваскуляризации. Известно, что, активируя внеклеточный протеолиз, активаторы плазминогена участвуют в разрушении базальной мембраны и матриксных белков, создавая условия для миграции эндотелиальных клеток и формирования новых капилляров [8, 9]. Было изучено состояние тканевой фибриноли- тической активности в ткани перифокальной зоны опухоли прямой кишки (см. табл. 3). Уровень показателей плазмина и а2-макроглобулина в ткани пе- рифокальной зоны опухоли не имели достоверных отличий от значений в интактной ткани по линии резекции, а показатель активности плазминогена достоверно не отличался от значений в ткани опухоли. Все остальные исследуемые показатели занимали промежуточное положение между значениями в ткани рака и интактной ткани. В ткани 85,7% полипов уровень плазмина был в 1,5 раза выше относительно интактной ткани, но в 1,7 раза ниже, чем показатель в ткани злокачественной опухоли. При этом не отмечено снижения содержания плазминогена в ткани полипа прямой кишки относительно интактной ткани (см. табл. 3). В 5 из 35 образцов полипов прямой кишки уровень плаз- мина оказался повышенным в 2,3 раза относительно интактной ткани и не имел достоверных отличий от показателей в ткани злокачественной опухоли прямой кишки. Изменения касались и уровня плазмино- гена: в указанных 5 образцах его содержание было снижено относительно интактной ткани на 29,6% и не имело достоверных отличий от значений в ткани злокачественной опухоли. Ткань полипов и опухоли принципиально различалась по уровню активаторов плазминогена. В отличие от ткани опухоли в ткани полипов не обнаружено изменение уровня активатора плазминогена урокиназного типа по отношению к интактной ткани, вместе с тем активность 1-РА была сниженной на 27,7% на фоне повышения содержания t-РА на 25,5%. Не найдено, как и в ткани опухоли, изменения активности а2-макроглобулина. То есть в ткани полипов часть изученных показателей по направленности изменения активности были сходны с таковыми в ткани злокачественной опухоли, а часть достоверно не отличалась от интактной ткани. Интересные изменения обнаружены в ткани пе- рифокальной зоны полипов: активность РАР повышалась относительно интактной ткани в 2,3 раза и была выше в 1,5 раза, чем в ткани перифокальной зоны злокачественной опухоли. Это происходило на фоне снижения на 37% содержания плазминогена относительно нормы. Так же как и в ткани полипа, в ткани перифокаль- ной зоны не обнаружено изменения активности и содержания активатора плазминогена урокиназного типа. При этом активность и содержание активатора плазминогена тканевого типа были выше в 1,5 и 1,9 раза соответственно, чем в интактной ткани, и в 2,1 и 1,5 раза, чем в ткани полипа. Активность а2- макроглобулина в ткани перифокальной зоны полипов превосходила значения в ткани по линии резекции и полипов в среднем в 5,3 раза. Обобщая результаты изучения состояния фи- бринолитической системы в ткани доброкачественных и злокачественных новообразований прямой кишки, обнаружены общие и различные черты. К общим моментам относится повышение уровня плазмина, снижение содержания тканевого ингибитора плазминогена и неизменность активности а2-макроглобулина. При этом в ткани рака прямой кишки была значительно увеличена урокиназа при сниженном содержании плазминогена и активности тканевого его активатора. Напротив, в ткани полипов эти показатели не изменились относительно интактной ткани. Также среди различий в функционировании системы фибринолиза доброкачественных и злокачественных новообразований прямой кишки выявлено разнонаправленное изменение активности тканевого активатора плазминогена. Исходя из вышесказанного, можно предположить, что в ткани новообразований прямой кишки независимо от гистотипа происходит активация фибрино- литической системы за счет усиления образования плазмина на фоне неизменной активности ингибитора а2-макроглобулина. Однако в ткани рака активация плазминогена происходит за счет урокиназы, а в ткани полипов превалирует активатор тканевого типа. Наши результаты согласуются с многочисленными исследованиями, где указывается усиление активности урокиназы при различных процессах злокачественного характера [10-12]. Интересные результаты были получены при анализе корреляций компонентов системы фибринолиза и ростовых факторов ткани рака и полипов прямой кишки. Считается, что VEGF запускает активацию каскадов протеиназ, участвующих в деградации экс- траклеточного матрикса. Связываясь с эндотелиальными клетками, VEGF индуцирует экспрессию активаторов и ингибиторов плазминогена, урокиназных рецепторов, матриксных металлопротеиназ коллаге- назы и желатиназы A, стимулирует фосфорилирова- ние FAK (Focal adhesion kinase), в то же время снижается уровень тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ 1 и 2 [13]. Все изученные показатели при раке прямой кишки имеют четко выраженные корреляционные связи разной направленности и степени. Однако наиболее сильные положительные корреляции отмечены для уровня VEGF-А, VEGF-R, EGF, TGF-P1 с уровнем РАР и u-PA антигена и активности (для VEGF г = 78, г2 = 79, г. = 80; р < 0,05, для VEGF-R г, = 77, г = 81, г. =78; р. 3 < 0,05, для EGF г. = 77, г2 = 81, г. = 78; р < 0,05, для TGF-P1 г 1 = 78, г2 = 79, г3 = 77; р1-3 < 0,05). Сильные отрицательные корреляционные связи обнаружены в ткани рака прямой кишки между уровнем VEGF-А, VEGF-R, eGf, TGF-P1 и содержанием плазминогена и t-PA-активности: для VEGF г1 = -80, г2 = -77; р1 2 < 0,05, для VEGF-R г1 = -78, г2 = -77; р1 2 < 0,05, для EGF г1 = -79, г2 = -80; р1 , < 0,05, для TGF-P1 г1 = -80, г2 = -79; р1, 2 < 0,05. , 2Важно заметить, что для ткани полисов прямой кишки такие четкие взаимосвязи были обнаружены только для уровня РАР и факторов роста VEGF-А, VEGF-R и TGF-P1 (для VEGF-А г = 81; р < 0,01, для VEGF-R г = 80; р < 0,01, и для TGF-P1 г = 79; р < 0,01). Таким образом, мы обнаружили повышенный уровень VEGF-А и TGF-P1, а также усиленное образование плазмина в ткани рака и полипов, что является общей чертой и свидетельствует об усилении ангиогенеза и нарушении процессов пролиферации и дифференцировки клеток ткани в доброкачественных, аналогично таковым в злокачественных новообразованиях прямой кишки. Однако большее количество корреляционных связей в случае злокачественной транформации говорит о более согласованной работе изученных систем, а также об их большей вовлеченности в исследованные процессы. Можно предположить, что экспрессия факторов роста и функционирование фибринолитической системы в тканях злокачественных опухолей находится в четком взаимодействии и взаимовлиянии. В ткани полипов показатели изученных факторов в целом занимают промежуточное положение между раковой и интактной тканью, что показывает возможные пути их злокачественной транформации.

About the authors

O. I Kit

Rostov Research Institute of Oncology

344037, Rostov-on-Don, Russia

E. M Frantsiyants

Rostov Research Institute of Oncology

344037, Rostov-on-Don, Russia

E. A Nikipelova

Rostov Research Institute of Oncology

344037, Rostov-on-Don, Russia

Ekaterina F. Komarova

Rostov Research Institute of Oncology

Email: super.gormon@ya.ru
PhD, Doctor of Biological Sciences 344037, Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files