Growth factors vascular of endothelial and receptors in the dynamic of transplantable melanoma B16/F10 development

Full Text

Рост новых кровеносных и лимфатических сосудов является сложным и скоординированным процессом, в котором участвуют различные регуляторные молекулы. Наиболее важными эффекторами, обеспечивающими физиологический и патологический лимфо- и ангиогенез, являются факторы роста эндотелия сосудов - VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D [14] . Биологическое действие членов семейства VEGF на эндотелиальные клетки происходит с помощью тирозинкиназных рецепторов: VEGF-A связывается с VEGF-R1 и VEGF-R^, тогда как VEGF-С взаимодействует с VEGF-R^ и VEGF^ [3]. Помимо своего основного ангиогенного эффекта, VEGF оказывают иммунорегуляторное действие [5], влияя на активность Т- и В-лимфоцитов [6]. В ряде исследований показано, что повышенная экспрессия VEGF коррелирует с неблагоприятным прогнозом течения злокачественных опухолей [7, 8], и в частности меланомы кожи [9]. Ингибирование VEGF-C подавляло лим- фангиогенез и спонтанное метастазирование в лимфатические узлы и легкое, увеличивало выживание и модулировало инфильтрацию дендритных клеток и лимфоцитов в опухоль [10]. Маркерами лимфатических и кровеносных сосудов в том числе служат высокоаффинные тирозинкиназные рецепторы VEGF-R1, VEGF-R2, VEGF-R^, через взаимодействие с которыми реализуется биологический эффект факторов семейства VEGF [11]. Рецепторы 1 и 2 преимущественно локализованы на клетках эндотелия кровеносных сосудов, а 3-й рецептор экспрессируется в основном на клетках эндотелия лимфатических сосудов, на котором частично экспрессируется и VEGF-R2. Понимание молекулярных механизмов лимфангиогенеза может помочь в разработке новых терапевтических стратегий против распространения злокачественных опухолей [12]. Для выяснения роли факторов роста эндотелия сосудов в патогенезе развития меланомы кожи целесообразно использовать экспериментальные исследования. Перевиваемая меланома В16^10 характеризуется коротким инкубационным периодом, быстрым ростом, типичным метастазированием, что делает эту опухоль адекватной моделью для данного исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение уровня факторов ангио-, лимфангиогенеза и их рецепторов в ткани опухоли, ее перифокальной зоне и интактной коже мышей в динамике роста меланомы В16^10. Материал и методы Работа выполнена на мышах-самцах линии С57В^ (n = 40), 8-недельного возраста массой тела 24-26 г. Животные были получены из ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий "Ан- дреевка"» ФМБА (Московская область). В работе использовали штамм мышиной, метастазирующей в легкие меланомы В16^10. Культура клеток меланомы В16^10 была получена из РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). Животные содержались при естественном режиме освещения со свободным доступом к воде и пище. Все исследования проводили в соответствии с требованиями и условиями, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» и приказом Минздрава России от 19 июня 2003 г. № 267 «Об утверждении правил лабораторной практики». Перевивка меланомы В16^10 производилась под кожу правой задней лапки мышей по 0,5 мл взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса (2405 клеток опухоли в среде 199) по стандартным методикам [13]. Мышам контрольной группы осуществлялось подкожное введение 0,5 Таблица 1 Факторы роста эндотелия сосудов и их рецепторы в опухоли, перифокальной зоне и интактной коже мышей с меланомой В16/ F10 ТканЪ--- Показатель VEGF-А, пг на 1 г ткани VEGF-C, пг на 1 г ткани VEGF-R1, нг на 1 г ткани VEGF-R2, нг на 1 г ткани Интактные животные Кожа 209,1 ± 15,1 6480±128 1,5 ± 0,1 27,2 ± 1,4 1 нед роста В16 (масса опухоли 115,7 мг) Кожа 293,3 ± 16,2* 23 000 ± 500* 3 ± 0,2* 45,4 ± 3,1* Опухоль 1812,9 ± 154* 40 100 ± 1200* 2,9 ± 0,12* 222,5 ± 15,3* Перифокальная зона 783,3 ± 62* 11 500±600* 10,1 ± 0,78* 75,7 ± 5,1* 2 нед роста В16 (масса опухоли 4089,3 мг) Кожа 275,1 ± 18* 19 450 ± 700* 2,9 ± 0,11* 33,3 ± 1,4*, ** Опухоль 10139,7 ± 421*, ** 168 400 ± 1572*, ** 44,0 ± 1,1*, # 399,6 ± 20,8*, ** Перифокальная зона 1272,7 ± 95*, ** 113 800 ± 5620*, ** 9,6 ± 0,7* 72,5 ± 6,7* 3 нед роста В16 (масса опухоли 5990, 1 мг) Кожа 348,2 ± 24* 55 000 ± 782*, ** 2,9 ± 0,1* 108,9 ± 7,1*, ** Опухоль 12933,9 ± 600* 161 900 ± 2450* 38,6 ± 1,2* 351,1 ± 26,5* Перифокальная зона 5210,3 ± 232*, ** 106 900 ± 5678* 7,47 ± 0,54* 567,5 ± 31,2*, ** Примечание. * - достоверно по отношению к показателям в ткани интактных животных (p < 0,05); ** - по отношению к показателям в предыдущий срок исследования (p < 0,05). мл раствора Хенкса. Рост опухоли оценивали путем ежедневного замера в трех взаимно перпендикулярных диаметрах с последующим расчетом объема опухоли. В 1, 2 и 3-ю неделю эксперимента животных быстро декапитировали, все процедуры проводили в соответствии с международными правилами работы с животными (European Communities Council Вкссйуа, 86/609/EEC). Опухоль, перифокальную зону и кожу выделяли сразу после декапитации. Из тканей получали 10% цитозольные фракции, приготовленные на 0,1 М калий-фосфатном буфере рН 7,4, содержащем 0,1% твина-20 и 1% БСА, в которых с помощью стандартных тест-систем ИФА-методами определяли уровень: VEGF-A, VEGF-C, VEGF-R1, VEGF-R2. 1 Статистическая обработка материала проводилась с помощью программы Statistica 6,0 c определением средних значений с указанием стандартных отклонений. Значимость различий средних показателей оценивалась с помощью критерия суммы рангов Вилкоксона. Существенными считали различия при p < 0,05. Результаты и обсуждение Прежде всего обращают на себя внимание показатели факторов роста и их рецепторов в интактной коже. Установлено, что содержание VEGF-C значимо превосходило уровень VEGF-A более чем в 30 раз, также и уровень VEGF-R2 превалировал над VEGF-R1 в 18 раз. Этот факт может свидетельствовать о большей активности образования лимфатических сосудов над кровеносными сосудами в здоровой коже. После трансплантации культуры клеток меланомы В16/Р10 опухоль развилась у всех животных. В 1-ю неделю эксперимента масса опухоли составила в среднем 115,7 мг (0,41% от массы тела животного), при этом объем опухоли измерить не удалось ввиду ее малых размеров. Во 2-ю неделю масса опухоли в среднем составила 4089,25 мг (14,1% от массы тела животного), а объем - 3,1 см3. К 3-й неделе эксперимента, несмотря на отсутствие изменения объема - в среднем 3,04 см3, масса опухоли составила в среднем 5990 мг (20,66% от массы тела животного). Продолжительность жизни мышей этой серии составила 3,5 ± 0,2 нед. Результаты изучения факторов роста и их рецепторов представлены в таблице. Установлено достоверное (p < 0,05) увеличение всех исследуемых показателей во всех образцах уже в 1-ю неделю эксперимента относительно показателей в коже интактных животных. Так, в 1-ю неделю в интактной коже уровень VEGF-А возрос в 1,4 раза, VEGF- С - в 3,5 раза, VEGF-R1 - в 2 раза и VEGF-R^ - в 1,7 раза (p < 0,05). В этот срок в ткани опухоли увеличение VEGF-А, VEGF-С, VEGF-R1 и VEGF-R^ относительно интактной кожи составило соответственно 8,7; 6,2; 2 и 8,1 раза, а в перифокальной зоне опухоли - 3,7; 1,8; 6,7 и 2,8 раза (p < 0,05). Очевидно, что появление минимальной опухоли массой 115,7 мг сопровождается значительной активацией факторов неоангио- и неолимфогенеза не только в ткани самой опухоли, но и в тканях, ее окружающих, причем величина показателей зависит от степени удаления от места имплантации опухоли. Через 2 нед от момента перевивки опухоли в ин- тактной коже уровень изученных показателей не имел достоверных отличий от значений в предыдущий срок исследования. Вместе с тем в ткани опухоли показатели увеличились относительно предыдущего срока исследования: VEGF-А - в 5,6 раза, VEGF-С - в 4,2 раза, VEGF-R1 - в 15,2 раза и VEGF-R^ - в 1,8 раза (p < 0,05). В ткани перифокальной зоны найдено увеличение только факторов роста, но не рецепторов: уровень VEGF- А возрос в 1,6 раза, VEGF- С - в 9,9 раза (p < 0,05). Через 3 нед от момента перевивки изменения некоторых изученных показателей обнаружены только в интактной коже и ткани перифокальной зоны опухоли, а в ткани меланомы значения факторов роста и рецепторов не имели достоверных отличий от показателей в предыдущий срок исследования. В ткани интактной кожи уровень VEGF-А, VEGF-С и VEGF- R2 повышался относительно предыдущего срока исследования в 1,3; 2,8 и 3,3 раза соответственно (p < 0,05), а уровень VEGF-R1 не изменялся. В ткани перифокальной зоны изменения коснулись VEGF-А, уровень которого повысился относительно предыдущего срока в 4,1 раза, и VEGF-R^ уровень которого повысился в 7,8 раза, а изменения содержания VEGF- С и VEGF-R1 найдено не было. Таким образом, в динамике роста перевивной меланомы кожи мышей обнаружено стадийное изменение факторов роста и рецепторов не только в ткани опухоли, но и в регионе ее окружающей, и ткани интактной кожи. Это, на наш взгляд, важно, так как считается, что в условиях злокачественного процесса факторы роста, в частности VEGF-A, синтезируются главным образом стромальными клетками [14]. Способность опухолей создавать свою лимфатическую сеть была обнаружена сравнительно недавно, что связано с отсутствием специфических маркеров лимфатических сосудов и недостатком знаний о молекулярном регулировании развития и функции лимфатической системы [15-18]. В настоящее время установлено, что фактором, ответственным за лимфангиогенез, является VEGF-C, который синтезируется эндотелием лимфатических сосудов, опухолевыми клетками и макрофагами и стимулирует пролиферацию эндотелиоцитов лимфатических капилляров [19]. Открытие лимфатических эндотелиальных маркеров определило анализ природы и структурной организации лимфатических сосудов при неолимфангиогенезе [20, 21]. Анализируя полученные результаты, можно отметить следующее. Появление злокачественной меланомы минимальных размеров сопровождается усилением выработки факторов роста и рецепторов в ткани опухоли, ее перифокальной зоны и интакт- ной коже, что свидетельствует об активном развитии процессов неоангио- и неолимфогенеза не только в ткани опухоли. Наши результаты согласуются с данными Н.П. Бгатовой и соавт. [22], показавшими динамику развития кровеносных и лимфатических микрососудов в экспериментальной лимфосаркоме LS. Авторами было показано уже на 2-е и 3-и сутки формирование в интерстиции капиллярных сетей, заполненных эритроцитами, вокруг которых шло накопление опухолевых клеток. А по периферии опухолевого роста начиналось формирование однослойного лимфатического канала, выстланного узкими эндотелиальными клетками, также заполнявшегося опухолевыми клетками. Способность опухолевых клеток экспрессировать VEGF-А и VEGF-R связывают с активацией пролиферации опухоли, а VEGF-А отводят роль аутокринного фактора. В связи с этим A. Vartanian [23] предположила, что наблюдаемая высокая экспрессия маркеров неоангиогенеза необходима для формирования каналов васкулогенной мимикрии. Это предположение было подтверждено и показано, что VEGF-R1 является единственным рецептором VEGF-А, который регулирует образование васкуло- генной мимикрии, и этот сигнальный путь не зависит от активности VEGF-R2, экспрессия которого в свою очередь регулирует неоангиогенез с участием эндотелиальных клеток. Анализируя с этих позиций полученные нами результаты, а именно увеличение активности продукции VEGF-А и двух типов рецепторов, можно предположить существование на ранних этапах роста перевиваемой меланомы В16^10 как процесса формирования новых кровеносных сосудов из эндотелиальных клеток, так и сосудистоподобных структур. При этом оба процесса происходят не только в ткани опухоли, но и в перифокальной зоне и в интактной коже. Возможно, нечто подобное происходит и с лимфатическими сосудами, так как известно, что VEGF- R является рецептором и для VEGF-С, который также был активирован в ткани меланомы В16^10, ее перифокальной зоне и интактной коже уже на ранних этапах роста. В некоторых исследованиях было установлено, что при опухолевом лимфангиогенезе и распространении злокачественных клеток вновь образованные лимфатические сосуды вырастают преимущественно из существующей ранее местной лимфатической сети [24, 25], которая широко представлена в коже млекопитающих. По мере прогрессирования злокачественного роста меняются приоритеты в системе ростовых факторов и ткани, в которых эта система активирована. Через 2 нед после перевивки меланомы В16^10 в ткани опухоли и ее перифокальной зоне продолжает нарастать уровень VEGF-А и VEGF-С, но только в ткани меланомы нарастает гиперэкспрессия VEGF-R1 и VEGF-R^ Очевидно, на этом этапе развития меланомы В16 аутокринная функция ростовых факторов больше связана с активацией пролиферации опухоли и построением ею новой сосудистой системы, при этом выраженного влияния на экспрессию факторов роста и их рецепторов в отдаленных регионах пока не оказывает. В последнее время растет интерес к проблеме микроокружения, как оказалось, не только обеспечивающего поддерживающую функцию, но и отвечающего за особенности роста и распространения новообразования. Изучение микроокружения дает возможность понять индивидуальные особенности опухоли, такие как зависимость ее размеров от локализации в том или ином органе, закономерности метастазирования, рецидивирования и прочих форм прогрессирования [26]. В предтерминальной стадии развития меланомы В16^10, когда опухоль занимает больше 20% от массы животного, активность системы ростовых факторов в ткани неоплазмы не претерпевает дальнейших превращений. При этом значимые изменения происходили в окружающем ее регионе. Прежде всего это касалось многочисленных мелких опухолевых отсевов. При этом в коже резко возрастает активность VEGF-С и VEGF-R^ но не VEGF-А и VEGF- R1, а в перифокальной зоне - VEGF-А и VEGF-R^ но не VEGF-С и VEGF-Rj. Можно предположить, что в регионе, непосредственно прилежащем к видимому краю опухоли, интенсифицируется закладка кровеносных сосудов (неоангиогенез), а в более отдаленном регионе интенсифицируется создание лимфатических сосудов (лимфангиогенез). Однако до настоящего времени окончательно не ясно, какие лимфатические сосуды - внутриопухо- левые или расположенные в перитуморальной зоне - играют более важную роль в прогрессии опухоли. Некоторые авторы отмечают, что присутствие лимфатических сосудов в перитуморальной зоне может эффективно служить для транспорта клеток опухоли, так как они менее подвержены напряжению и обеспечивают больший объем тока лимфы [27]. В частности, это касается меланомы [28]. Таким образом, на протяжении всего развития меланомы B16/F10 в организме активно реализуются механизмы образования различных сосудов - нео- ангиогенез, неолимфогенез и васкулогенная мимикрия. Факторы роста и их рецепторы синтезируются не только опухолью, но и окружающими тканями и даже отдаленными от опухоли участками интактной кожи. До 2-й недели развития опухоли меланома является лидирующим компонентом по экспрессии факторов роста и их рецепторов, однако к 3-й неделе лидерство переходит к перифокальной зоне, в которой продолжается нарастание как уровня VEGF, так и их рецепторов. Интересен тот момент, что для отдаленных от опухоли участков кожи гораздо более активным является синтез VEGF-C и его рецептора.

About the authors

E. M Frantsiyants

Rostov Research Institute of Oncology

344037, Rostov-on-Don, Russian Federation

Valeriya A. Bandovkina

Rostov Research Institute of Oncology

Email: super.gormon@yandex.ru
MD, PhD 344037, Rostov-on-Don, Russian Federation

I. V Kaplieva

Rostov Research Institute of Oncology

344037, Rostov-on-Don, Russian Federation

L. K Trepitaki

Rostov Research Institute of Oncology

344037, Rostov-on-Don, Russian Federation

Yu. A Pogorelova

Rostov Research Institute of Oncology

344037, Rostov-on-Don, Russian Federation

N. D Cheryarina

Rostov Research Institute of Oncology

344037, Rostov-on-Don, Russian Federation

References

Supplementary files