Characteristics of distribution frequency of GSTM1 and GSTT1 polymorphic genes among residents of Mongolia

Full Text

Переход Монголии от централизованно планируемой социалистической системы к свободной рыночной экономике начался в 1990-х годах, что создало определенное давление на здоровье населения страны. При плановой экономике, просуществовавшей до 1990 г., социальная сфера, т. е. образование, здравоохранение и социальная защита, в Монголии была бесплатной и финансировалась государством. Вследствие процесса экономического реструктурирования и приватизации государство утратило способность предоставлять услуги социального обеспечения, необходимые для смягчения социальных последствий тяжелого экономического кризиса [1-3]. Интенсивная урбанизация и социально-экономическое развитие в последние годы усилили миграцию населения из сельской местности в городские и пригородные районы, что значительно измененило жизненный образ монголов, расширило и разнообразило применение химических веществ в виде пищевых добавок, лекарственных средств, кормов для животных и пестицидов, производственного, строительного и горного сырья, бытовой химии, горючего, а также увеличило их подверженность экологическим загрязнениям, образованным в результате разложения химических и промышленных отходов. В сумме все эти воздействия, негативные для здоровья населения страны, привели к быстрому изменению эпидемиологической структуры заболеваемости и смертности. С начала 1990-х годов смертность от сердечно-сосудистых заболеваний, злокачественных новообразований, травм и отравлений увеличилась, в то время как смертность от инфекционных и респираторных заболеваний снизилась. К 2010 г. среди основных причин смерти на 10 тыс. населения на 1-м и 2-м местах находились сердечно-сосудистые заболевания (23,61) и рак (13,02), а травмы и отравления (10,11) переместились на 3-е и 4-е места, заболевания системы пищеварения (5,30) и дыхания (2,72) переместились с 3-го и 4-го на последние места в этом ряду. Рождаемость снизилась вдвое в период с 2000 по 2003 г. по сравнению с 1990 г. Неонатальная смертность составляет 60,1% всей младенческой смертности. Ведущими причинами младенческой смертности были перинатальные нарушения (51,1%), болезни органов дыхания (21,6%), и врожденные пороки развития (функциональные расстройства и хромосомные нарушения) (12%) [3]. Интенсивное воздействие экологических и производственных загрязнителей способствует повреждению генетического материала: мутированию ДНК или образованию ДНК-аддуктов, что приводит в конечном итоге к развитию астмы, диабета онкологических и сердечно-сосудистых заболеваний. Генетическая предрасположенность определяется различиями в метаболизме генотоксических соединений и механизмах восстановления ДНК, и в самом деле уровни экспрессии и активности ферментов, метаболизирующих ксенобиотики, обусловлены наличием полиморфных аллелей, кодирующих эти ферменты [4]. Глутатион^-трансферазы (GSTs) - это группа ферментов биотрансформации, которые превращают широкий спектр ксенобиотиков и биологически активных эндогенных метаболитов, таких как экзотоксины, лекарственные препараты, канцерогены, в безопасные, полярные водорастворимые и потому легко выводимые из организма вещества [5, 6]. На сегодняшний день у млекопитающих идентифицировано восемь классов GSTS, т. е. альфа (GSTA), мю (GSTM), тета (GSTT), пи (ГСТП), дзета (GSTZ), сигма (GSTS), каппа (GSTK) и омега (GSTO) [7]. Наиболее значимым для генетических и биомедицинских исследований являются «нулевые» варианты GSTM1 0 и GSTT1 0, возникшие в результате протяженных делеций в этих генах, которые проявляются на уровне фенотипа полным отсутствием ферментативной активности. Гомозиготное носи- тельство делеционных вариантов этих генов часто связывают со сниженной чувствительностью инди- видумов к различным канцерогенам [8]. Несмотря на множество исследований, выявляющих связь между гомозиготным носительством «нулевых» вариантов GSTM1- и GSTT1 -генов и различных видов рака [9-14], их результаты не могут быть непосредственно экстраполированы на другие популяции в силу внутри- и межэтнических различий. Для разработки надлежащей стратегии, направленной на снижение или устранение факторов негативного влияния на здоровье населения в целом, мы считали необходимым провести научные исследования по оценке генетического фона восприимчивости и предрасположенности к болезням населения Монголии. Целью нашего исследования было выявление распределения гомозиготных вариантов «нулевых» аллелей GSTM10 и GSTT10 среди жителей Монголии. Материал и методы Праймеры, использованные для мультиплексной полимеразной цепной реакции Фрагмент гена для амплификации Праймеры мкмоль/л Размер фрагмента, п, н GSTT1 Направляющий: 5’-TCTTTTGCATAGAGACCATGACCAG-3’ Обратный: 5’-CTCCCTACTCCAGTAACTCCCGACT-3’ 0,30 969 GSm1 Направляющий: 5’-CAAATTCTGGATTGTAGCAGATCATGC-3’ Обратный: 5’-CACAGCTCCTGATTATGACAGAAGCC-3’ 0,22 625 Забор биологических образцов производился у 170 добровольцев из Туве и Баянхонгор аймаков и из Улан-Батора по международным правилам с использованием информированного согласия. Исследование проводилось с разрешения комитета по этике при Министерстве здравоохранения Монголии (заключение № 3 от 10.04.12) в секторе токсикологии, Национального Рис. 1. Образцы геномной ДНК выделенные из лейкоцитарных фракций венозной крови с использованием метода гуанидин-ги- дрохлоридной экстракции. центра общественного здравоохранения Монголии. В качестве сравнения использовались данные литературы для других этнических групп [15]. Образцы ДНК были выделены из лейкоцитарных фракций венозной крови с использованием метода гуанидин- гидрохлоридной экстракции (рис 1). Типирование образцов по генам GSTM1 и GSTT1 проводили путем мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием двух пар олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участку генов GSTM1 и GSTT1 (табл. 1) [16]. Смесь для амплификации объемом 25 мкл содержала 100-200 нг геномной ДНК, двукратную двойную мастер-смесь UTaq-ДНК полимеразы (Частная лаборатория «Чорос онош», Монголия), состоявшую из: двукратного ПЦР-буфера pH 8,7; 1,5 мкмоль MgCl2; 500 мкмоль dNTP, 0,2-0,4 мкмоль праймеров, как указано в табл. 1, и 0,7 U TAQ - ДНК-полимеразы. Программа амплификации включала 3 мин предварительной денатурации при 94°С, затем следовали 35 циклов денатурации: 94°С - 30 с, 68oC - 7 мин, 72oC - 10 мин. Продукты амплификации фракционировали в 0,8% агарозном геле с бромистым этидием в течение 25 мин при напряжении 100 Вш и визуализировали с помощью аппарата «BioSens Imaging systems». В качестве маркера молекулярной массы ДНК использовали стандарт К562 DNA High Molecular Weight, 2800 M Control DNA (10 нг/мл), фирма Bioneer. Популяционную частоту аллельных вариантов вычисляли на основе наблюдаемых частот генотипов. Оценку соответствия распределения частот генотипов равновесию Харди-Вейнберга проводили с использованием критерия %2 (Пирсона), при р > 0,05 равновесие выполняется. Таблица 1 Ladder 1 2 3 4 5 Ladder 6 7 8 9 10 Рис. 2. Пример идентификации 0/0 и + генотипов по генам GSTT1 и GSTM1 с помощью мултиплексной ПЦР-амплификации. Гомозиготность по «нулевым» аллелям (0/0) генов GSTT1 и GSTM1 определяли по отсутствию на электрофореграммах фрагментов размером 969. и 625 п.н. соответственно. Наличие этих фрагментов свидетельствовало о присутствии по крайней мере одной нормальной (без делеции) копии генов (гомо- и гетерозиготы, +/+ и +/0). Образцы под номерами 1, 2, 3, 8, 9, 10 являются примером GSTM1 (-) вариантов, а образцы под номерами 4, 5, 6, 7 являются примером GSTT1(+), GSTM1 (+) вариантов. Распределение «нулевых» генотипов GSTM1 0/0 и GSTT1 0/0 среди азиатских этнических групп Популяция Число GSTM1 0/0, % Число GSTT1 0/0, % Использованная литератур Монголы 207 46,6 207 25,6 R.S. Shaikh et al., 2010; 152 56 160 43 Данное исследование Японцы 201;220 41-56 126; 200 44-52 Sayo Kawai и соавт., 2005 Китайцы 106;187 36,8-63,6 417; 187 45,6-54,5 Sayo Kawai и соавт., 2005 Корейцы 63; 220 52,4-59,9 181; 220 42-45,9 Sayo Kawai и соавт., 2005 Тибетцы 52 60,5 33 36,1 H. Yan и соавт., 2006 Тайцы 53 30,2 53 47,2 Sayo Kawai и соавт., 2005 Таблица 2 Результаты и обсуждение Частоты «нулевых» генотипов GSTT1 0/0 и GSTM1 0/0 были определены у 160 индивидуумов для GSTT1 и 150 для GSTM1 из числа жителей Туве и Баянхонгор аймаков и Улан-Батора (рис. 2). У генов GSTT1 и GSTM1, кодирующих соответственно глутатионтрансферазы тета1 и мю1, выявлены так называемые «нулевые» аллели, обусловленные протяженными делециями, вследствие которых синтезируются лишенные активности белковые продукты [5]. Эти варианты генов достаточно широко распространены в популяциях. Сравнение полученной нами частоты распространения этих двух «нулевых» генотипов с данными исследований в других этнических группах Азии, приведенных в литературе, показало что частота распространения GSTM1 - «нулевого» генотипа в монгольской популяции (56%) была незначительно ниже, чем в популяции Тибета (60,5%) и Китая (63%), и одинаковой с частотой в популяциях Японии (56%) и Кореи (59%). Она была незначительно выше, чем результат исследования, проведенного японским исследователем Фужихара (46,6%) на монгольской популяции в 2009 г., и чем в тайской популяции (табл. 2). Частота же распространения GSTT1 - «нулевого» генотипа была почти одинаковой с частотой распространения GSTT1 - «нулевого» генотипа во всех остальных азиатских этнических группах, приведенных в табл. 2, и по нашим данным, частота GSTT1 - «нулевого» генотипа в монгольской популяции была 43% (см. табл. 2) [15, 17]. Результаты демографического анализа и распределения генотипов GSTT1 0/0 и GSTM1 0/0 в зависимости от пола индивидуума приведены в табл. 3. Из демографической характеристики распределения «нулевых» генотипов GSTM1 0/0 и GSTT1 0/0 - мы наблюдали отсутствие значительных различий в частоте распределения «нулевых» генотипов среди обследованных мужчин и женщин GSTM1 (X2 = 0,358, p = 0,081) и GSTT1 (х2 = 1,99; p = 0,079) (табл. 3). Все обследованные люди были разделены на две группы, на тех кто родился до 1990 г. (100 человек для GSTT1 -гена и 103 человек для GSTM1- гена) и тех кто родился после 1990 г. (50 человек для GSTT.1-гена и 47 человек для GSTM1 -гена). Частота Таблица 3 Распределение «нулевых» генотипов GSTT1 0/0 и GSTM1 0/0 в зависимости от пола индивидуумов в обследованной группе Показатель GSTT1 0/0 GSTM1 0/0 GSTT1 0/0 / GSTM1 0/0 абс. % абс. % абс. % Всего 69 43,1 70 46,1 69 43,1 Мужчины 34 49,3 32 45,7 34 49,3 Женщины 35 50,7 38 54,3 35 50,7 45-1 403530252015И 1050и IV □ До 1990 П После 1990 □ 2013 Рис. 3. Изменение процента смертности от химических отравлений и рака в периоды до и после 1990 г., а также различие в распределении «нулевых» генотипов по генам GSTT1 и GSTM1 у людей родившихся до и после 1990-го года. I - смертность от химического отравления, %. II - среднегодовой показатель смертности от рака на 10 тыс. человек. III - распределение «нулевого» генотипа GSTT1 0/0 у людей, родившихся до и после 1990 г., %. IV - распределение «нулевого» генотипа GSTM1 0/0 у людей, родившихся до и после 1990 г., %. V - распределение «нулевого» генотипа GSTT1 0/0 / GSTM1 0/0 у людей, родившихся до и после 1990 г., %. распределения нулевых генотипов была 21,3% для GSTM1 (х2 = 0,001; p = 0,319) и 19,4% для GSTT1 (х2 = 0,001; p = 0,257) у людей, родившихся до 1990 г., а частота распределения нулевых генотипов была 23.1% для GSTM1 (х2 = 0,003; p = 0,987) и 23.8% для GSTT1 (х2 = 0,001; p = 0,979) у людей родившихся после 1990 г. Частота же «нулевых» генотипов по обоим генам у одного и того же индивидуума составляла 18,1% у людей родившихся до 1990 г. и 1,3% (х2 = 0,001; p = 0) у людей, родившихся после 1990 г., соответственно. Как мы упоминали раньше с начала 1990-х годов интенсивная урбанизация и социально-экономическое развитие значительно изменило жизненный образ монголов и эпидемиологическую структуру заболеваемости и смертности населения страны. С начала 1990-х годов смертность от сердечно-сосудистых заболеваний, злокачественных новообразований, травм и отравлений увеличилась, в то время как смертность от инфекционных и респираторных заболеваний снизилась. Если в 1990 г. Монголия импортировала 28 т и 1000 наименований химических продуктов (в основном пестициды и лекарственные препараты), то в 2013 г. этот импорт представлял 3800 т 7300 наименований химических продуктов, не включая лекарственных препаратов [17]. По нашим представлениям, возросшая подверженность населения различного рода негативным для здоровья факторам, таким как химическое загрязнение окружающей среды, стресс и т. д., должна повлиять на частоты распределения «нулевых» генотипов для GSTT1- и GSTM1-генов в сторону их увеличения у людей, родившихся после 1990 г. Ниже мы сравниваем заболеваемость и смертность от химического отравления и от рака до 1990-х и после 1990-х годов (рис. 3). Как видно на рис. 3, на основаннии данных наших исследований наше предположение не подтвердилось. И несмотря на резкое увеличение числа отравлений химическими веществами, а также рост заболеваемости раком населения Монголии с 1990 г., частота «нулевых» генотипов генов GSTT1 и GSTM1, кодирующих ферменты детоксификации у людей, родившихся до и после 1990 г., почти не различается или различия статистически незначимы, что опровергает нашу изначальную версию о корреляции между возможным изменением частоты распределения гомозиготных рецессивных вариантов в сторону их увеличения у людей, родившихся после 1990 г., а также их возможного дисбаланса в распределении среди мужчин и женщин и увеличением негативных факторов, влияющих на здоровье и генетический фонд монгольской популяции. Резкое различие частот «нулевых» рецессивных генотипов по обоим GSTT1- и GSTM1 -генам, возможно, обусловлено непропорциональным забором биологических образцов для исследования (50 индивидуумов (31,1%), родившихся после и 110 (68,8%) до для GSTT1; 47 (31,3%), после и 103 (68,7%) до для GSTM1).

About the authors

G. Uyanga

National Center of Public Health, Ministry of Health

13381,Ulaanbaatar, Mongolia

J. Zandraa

Choros-Onosh Laboratory

Ulaanbaatar, Mongolia

S. Gandbold

National Institute of Forensic Sciences

Ulaanbaatar, Mongolia

S. Unursaikhan

National Center of Public Health, Ministry of Health

13381,Ulaanbaatar, Mongolia

O. Altanchimeg

Hospital of Bornuur soum

Tuv aimag, Mongolia

Duvjir Suvd

National Center of Public Health, Ministry of Health

Email: duvjir@yahoo.com
PhD 13381,Ulaanbaatar, Mongolia

References

Supplementary files