DEVELOPMENT OF INTRAVENOUS ADMINISTRATION OF L-LYSINE-ALPHA-OXIDASE FROM TRICHODERMA CF. AUREOVIRIDE RIFAI BKMF-4268 REGIME CONTROLLED BY SAFETY AND EFFICACY OF TREATMENT

Full Text

L-лизин-альфа-оксидаза (ЛО) представляет собой противоопухолевый фермент, продуцентами которого являются различные растения и грибы, в том числе грибы рода Trichoderma. Наиболее изучена ЛО из Trichoderma viride и Trichoderma harzianum Rifai [1-3]. Торможение роста опухолевых клеток под действием ЛО реализуется за счет блокирования перехода клеток из фазы S в фазу Gj/М клеточного цикла [2, 4]. Молекулярные механизмы антипролиферативного и побочного эффектов под действием ЛО связаны с блокированием синтеза белка в клетках в результате окислительного дезаминирования эссенциальной аминокислоты L-лизина и образования в реакции обладающего прямой цитотоксичностью H2O2 [2, 4]. На этапе доклинического изучения in vivo первоначально для ЛО был предложен режим многократного внутривенного (в/в) введения с фиксированными интервалами между инъекциями (неопубликованные данные). Период полувыведения ЛО из плазмы крови мышей (Т1/2) составляет 67-93 мин, а динамика изменения концентрации ЛО в сыворотке крови при 5-дневном ежедневном введении не зависит от количества введений [5]. Даже через 24 ч после инъекции ЛО сохраняются значительные концентрации фермента (6,3-8,4 нг/мл при введении ЛО в дозе 1-3 мг/кг), по расчетам обеспечивающие практически полное отсутствие L-лизина в крови. Поскольку L-лизин является незаменимой аминокислотой и не синтезируется в организме, длительное поддержание предельно низких концентраций L-лизина в крови животных при многократном в/в введении ЛО в постоянно высоких дозах приводит к развитию так называемого лизинового голода: потере массы тела и последующей гибели мышей из-за значимого ограничения синтеза белков. Поэтому актуальным являлся поиск таких доз ЛО, которые бы обеспечивали гибель опухолевых клеток без развития "лизинового голода". Это определило необходимость экспериментальной разработки оптимального терапевтического режима многократного в/в введения ЛО под контролем дефицита массы тела как причины гибели животных. В соответствии с этим были сформулированы цель и задачи исследования. Цель исследования - разработка оптимального режима многократной в/в терапии ЛО под контролем переносимости и эффективности. Задачи исследования: 1) определить кратность между в/в инъекциями, дозы и курс лечения ЛО под контролем переносимости и эффективности; 2) оценить эффективность ЛО при в/в введении в оптимальной схеме на чувствительных опухолях мышей. Материал и методы Животные. Опыты проведены на мышах BDFp CBA и BALB/c обоего пола массой тела 18-22 г разведения ФГБУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, которых содержали в виварии РОНЦ при естественном освещении на брикетированном корме и постоянном доступе к воде. Режимы внутривенного введения ЛО. Для исследования использована субстанция ЛО с удельной активностью 95 Ед/мг, которую разводили 0,9% раствором хлорида натрия непосредственно перед в/в введением до концентрации 2,5-25 Ед/мл (0,04-0,4 мг на 1 мл белка). Дозы для в/в терапии были выбраны на основании данных, полученных при внутрибрюшинном (в/б) введении ЛО. При многократном в/в введении ЛО изучали два режима: режим 1 " монотонный" с одинаковой разовой дозой на каждую инъекцию; режим 2 "дискретный" с относительно большой стартовой дозой и последующими разовыми дозами, составляющими / или % от стартовой дозы. Режим 1 "монотонный", интервал 48 ч или 24 ч: 3-кратно в разовых дозах от 150 до 200 Ед/кг; 4-кратно в разовой дозе 150 Ед/кг; 5-кратно в разовых дозах от 35 до 150 Ед/кг. Режим 2 "дискретный", 5-кратно, интервал 48 ч: до-зовый ряд 200-75-75-75-75 Ед/кг Суммарная доза 500 Ед/кг); дозовый ряд 150-100-100-100-100 Ед/кг Суммарная доза 550 Ед/кг); дозовый ряд 150-75-75-75-75 Ед/кг Суммарная доза 450 Ед/кг); дозовый ряд 150-50-50-50-50 Ед/кг Суммарная доза 350 Ед/кг); дозовый ряд 100-50-50-50-50 Ед/кг Суммарная доза 300 Ед/кг); дозовый ряд 100-33-33-33-33 Ед/кг Суммарная доза 232 Ед/кг). Режимы в/в введения ЛО под контролем дефицита массы тела мышей отрабатывали на чувствительных к перевиваемых опухолях: солидной аденокарциноме молочной железы Са755 и карциноме легкого Льюис (LLC), а также на в/б лимфолейкозе P388. Спектр противоопухолевого действия ЛО при в/в введении в оптимальном режиме изучали на саркоме солидных опухолях мышей: саркоме 180, АКАТОЛ, РШМ-5, МОПС-406 и меланоме В16. Опухолевые штаммы получали из Банка ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, эксперименты выполняли в соответствии с действующими требованиями [6]. Оценка переносимости в/в терапии. О переносимости ЛО судили в сравнении с группой контроля. Определяли динамику массы тела мышей и фиксировали гибель мышей при значимом уменьшении массы тела в процессе и после лечения. В процессе наблюдения фиксировали также обычные показатели здоровья животных: состояние и поведение. Оценка эффективности терапии. Эффективность лечения оценивали по стандартным критериям: торможению роста солидной опухоли (ТРО, %) и увеличению продолжительности жизни (УПЖ, %) мышей с лейкозом. Значимыми считали ТРО > 50%, УПЖ > 25% [6]. Статистическая обработка данных. Выполнена по методу Стьюдента в модификации Р.Б. Стрелкова с расчетом доверительных интервалов средних сравниваемых величин. Достоверными считали различия при p < 0,05. Завершение экспериментов. Мышей умерщвляли передозировкой эфирного наркоза с использованием гуманных методов обращения с животными, принятыми в РФ. Результаты и обсуждение Режим "монотонный". На Cа755 ЛО в разовой дозе 150 Ед/кг при 5-дневном курсе был эффективным и приводил к умеренному достоверному ТРО = 68-78% (p < 0,05), сравнимому с в/б лечением, но вызывал единичную гибель мышей от токсичности после 3-4-й инъекции на фоне резкого уменьшения массы тела. Уменьшение разовой дозы ЛО до 125 Ед/кг в этом режиме привело к улучшению переносимости лечения без гибели мышей, однако при этом эффективность снижалась до ТРО = 45-57% (p > 0,05) (табл. 1). Проведенная на в/б малочувствительном к ЛО P388 апробация сокращенного до 3 дней монотонного курса лечения в пределах эффективной суммарной дозы путем увеличения разовой дозы до 175 или 200 Ед/кг (суммарные дозы соответственно 525 и 600 Ед/кг) не дала положительного результата: УПЖ = 1% при гибели более по ловины мышей от токсичности на фоне снижения массы тела более 25% (табл. 2). Таблица 1 Результаты изучения противоопухолевой активности и переносимости ЛО на мышах с Ca755 Разовая доза на инъекцию, Ед/кг Суммарная доза, Ед/кг ТРО на сутки после окончания лечения, % Уменьшение массы тела на 3-5-е сутки после лечения, % Гибель от токсичности на фоне снижения массы тела первая последующие* 4 7-10 150 150 450 * * 6 7 58 > 25 2/10*** 150 150 750 78** 68** > 25 1/8** 125 125 625 45 47 > 15 0/10 200 75 500 80** * * 2 7 < 10 0/10 150 100 550 * * 3 8 * * 2 6 < 10 0/10 150 75 450 77** 60** < 10 0/10 Примечание. * - 2-3-я или 2-5-я, интервал 48 ч; ** - различия с контрольной группой достоверны (р < 0,05); *** - мыши пали после 3-го или 4-го введений. Таким образом, терапия ЛО при многократном монотонном в/в введении в диапазоне разовых доз 125-200 Ед/кг (суммарные дозы 500-750 Ед/кг соответственно) оказалась плохо переносимой и относительно малоактивной на Са755 или неактивной на Р388 в сравнении с в/б введением. Пик дефицита массы тела наблюдался на 3-5-е сутки после окончания в/в терапии ЛО независимо от величины суммарной дозы. Режим "дискретный". На модели Са755 в серии опытов было показано, что дискретное в/в введение ЛО с первой разовой дозой 100-200 Ед/кг и последующими дозами 75 или 100 Ед/кг (суммарные дозы 450-550 Ед/кг соответственно) дает сопоставимый с в/б терапией значимый достоверный противоопухолевый эффект на уровне ТРО = 60-90% без гибели мышей. Достигнутый эффект сохранялся в течение 10 дней на уровне ТРО = 83-77-60% (р < 0,05) при удовлетворительной переносимости и отсутствии гибели от токсичности (см. табл. 1). Определенный таким образом режим в/в введения ЛО был апробирован на Р388 и LLC. На лейкозе была подтверждена хорошая переносимость в/в ЛО без гибели мышей от токсичности при отсутствии ответа на лечение. На LLC с использованием ЛО в суммарной дозе 550 Ед/кг при удовлетворительной переносимости без гибели получен длительный достоверный противоопухолевый эффект на уровне ТРО = 74-81%. Снижение или увеличение суммарной дозы на 50-100 Ед/кг приводили к уменьшению эффекта Таблица 2 Эффективность ЛО на модели лимфолейкоза мышей Р388 Разовая доза на инъекцию, Ед/кг Дозы суммарные, Ед/кг УПЖ, % Уменьшение массы тела на 3-5-е сутки после окончания лечения Гибель от токсичности пер вая последу ющие* 150 150 600 1 > 25 3/6 175 175 525 3 > 25 2/6 200 200 600 0 > 25 2/6 200 100 600 29 < 10 0/7 150 75 450 19 < 10 0/8 150 50 350 13 < 5 0/6 100 50 300 10 0 0/6 100 33 232 13 0 0/6 Примечание. * - интервал 48 ч. до ТРО = 29-42%, что ниже минимально значимого уровня (табл. 3). Опыты на мышах с двумя солидными карциномами молочной железы и легкого показали, что режим "дискретный" с интервалом 48 ч дает возможность провести 5-кратный в/в курс лечения ЛО с характерной для в/б лечения активностью при удовлетворительной переносимости. Спектр противоопухолевой активности в/в ЛО в режиме "дискретный". Изучение показало, что при в/в терапии ЛО в режиме "дискретный", помимо Са755 и LLC, чувствительными оказались все чувствительные к в/б ЛО солидные опухоли мышей (табл. 4). Противоопухолевое действие ЛО соответствовало ТРО = 57-92% (р < 0,05), которое в случае РШМ-5 было максимальным и удерживалось не менее 14 дней. Так, при воспроизведении полученных результатов на LLC и Са755 подтвержден высокий длительный достоверный противоопухолевый эффект на уровне ТРОтах = 82 и 90% соответственно (р < 0,05). Высокочувствительной к в/в терапии ЛО оказалась также плазмоцито-ма МОПС-406, ТРОтах = 92% (р < 0,05). Умеренную чувствительность показала меланома В16, ТРОтах = 77% (р < 0,05), пограничный эффект на уровне ТРОтах = 57-59%, (р < 0,05) получен на аденокарциноме АКА-ТОЛ и раке шейки матки РШМ-5. Малочувствительной к в/в ЛО оказалась саркома 180, ТРОтах = 46%. По отношению к в/в терапии ЛО опухоли расположены в следующем порядке убывания чувствительности: МОПС-406, меланома В16, РШМ-5, АКАТОЛ, саркома-180. Во всех экспериментах динамика массы тела мышей достоверно не отличалась от таковой в контрольных Таблица 3 Результаты изучения противоопухолевой активности ЛО на мышах с карциномой Льюис (LLC) Разовая доза на инъекцию, Ед/кг Доза суммарная, Ед/кг ТРО на сутки после окончания лечения, % первая последующие* 1-3 8-11 16-17 35 35 175 56 62 36 150 150 750 53 46 13 200 100 600 42 30 30 150 100 550 81** 82** * * 4 7 150 75 450 29 29 7 100 50 300 23 3 0 Примечание. * - интервал 24 или 48 ч; ** - достоверность отличия от контроля (р < 0,05). Таблица 4 Спектр чувствительных перевиваемых солидных опухолей мышей к в/в терапии ЛО в суммарной дозе 450-550 Ед/кг при режиме "дискретный" Опухолевый штамм ТРОmax на сутки после окончания лечения, % Длительность сохранения достоверного противоопухолевого эффекта, сутки после окончания терапии Саркома 180 46 0 Меланома В16 77* 6 АКАТОЛ 57* 6 РШМ-5 59* 14 МОПС-406 92* 11 Примечание. * - результаты достоверны (р < 0,05). группах, дефицита массы тела не отмечали, переносимость терапии была удовлетворительной, гибели от токсичности не отмечали. Ранее нами было показано, что ЛО при монотонном 5-кратном в/б введении с интервалами 24 ч или 48 ч в разовых дозах 100-150 Ед/кг (суммарные дозы 500-750 Ед/кг соответственно) вызывает умеренный противоопухолевый эффект на Ca755 (ТРО = 80%) и Р388 (УПЖ = 22%) без каких-либо побочных эффектов (неопубликованные данные). Для в/в введения величина разовых доз 125 и 150 Ед/кг определена в пределах эффективных суммарных, длительность курса 3 или 5 дней с интервалом 48 или 24 ч. В результате исследования на мышах с чувствительными к в/б введению ЛО опухолями под контролем дефицита массы тела и последующей гибели животных разработан режим "дискретный" для проведения многократной в/в терапии ЛО с интервалом 48 ч. Режим заключается во введении первой относительно высокой стартовой дозы и последующих поддерживающих доз, составляющих / или % от первой. Показана эффективность и удовлетворительная переносимость режима "дискретный" при 5-кратном в/в курсе в суммарных дозах 450-550 Ед/кг. Терапия ЛО в режиме "дискретный" не вызывает значимого дефицита массы тела мышей и сопряженной с ним гибели мышей. Этот режим позволяет реализовать противоопухолевый эффект ЛО в отношении практически всего спектра чувствительных к в/б терапии опухолевых моделей: аденокарцинома молочной железы Са755, меланома В16, аденокарцинома толстой кишки АКАТОЛ, рак шейки матки РШМ-5, эпи-дермоидная карцинома легкого Льюис и плазмоцитома МОПС-406. Наиболее чувствительной к в/в ЛО оказалась плазмоцитома МОПС-406, практически не чувствительной к лечению был лимфолейкоз Р388. Сравнительный анализ биологических эффектов ЛО в разовой дозе 150 Ед/кг при монотонном и дискретном в/в режимах позволил предположить, что найденный 48-часовой интервал является оптимальным для дискретного режима. Он позволяет нивелировать влияние депрессии уровня L-лизина в плазме крови и увеличить амплитуду колебания концентрации L-лизина непосредственно перед инъекцией ЛО и после нее. Так, показано, что у мышей BDF1 в/в введение ЛО в однократной дозе 70 Ед/кг сразу и на период до 12 ч снижает уровень L-лизина в плазме крови до ничтожно малого, практически не определяемого уровня. Восстановление концентрации L-лизина наступает лишь через 24 ч [7]. Это объясняет полученный нами феномен удержания противоопухолевого эффекта без гибели мышей от дефицита лизина. Скорее всего, поддерживающие дозы ЛО позволяют обеспечить концентрацию L-лизина на уровне, минимально достаточном для жизни только нормальных клеток. Дефектное кровоснабжение опухоли не обеспечивает активно делящиеся клетки с интенсивным синтезом белка, особенно в Gj-фазе клеточного цикла, постоянным поступлением незаменимых аминокислот и соответственно делает их более уязвимыми к колебаниям концентрации L-лизина в плазме крови, чем здоровые клетки. Косвенно это подтверждается данными фармакокинетики ЛО в плазме крови у мышей [3]. Так, расчетный Т1/2 при внутривенном введении ЛО в диапазоне терапевтических доз не зависит от дозы, а снижение концентрации ЛО в крови носит ярко выраженный двухфазный характер: в начальной фазе (смешанная фаза распределения и элиминации) концентрация препарата снижается быстрее, чем в конечной (фаза элиминации). Наличие длительной фазы элиминации свидетельствует об отсроченном начале восстановления уровня L-лизина в плазме крови после введения фермента. Полученные данные позволяют считать, что улучшение переносимости ЛО при дискретном внутривенном введении связано с повышением избирательности цито-токсического действия фермента на опухолевые клетки при изменении амплитуды и характера колебаний уровня L-лизина в плазме крови. Пик дефицита массы тела мышей при ежедневном внутривенном введении ЛО, наступающий через 3-5 дней после окончания курса лечения независимо от величины суммарной дозы, подтверждает кумулятивный характер этого побочного эффекта. Более того, при внутривенной дискретной терапии в сравнении с монотонным внутрибрюшинным введением показана возможность уменьшения равноэффективной суммарной дозы на 200 Ед/кг (750 Ед/кг против 550 Ед/кг). Все вышесказанное является основанием для рекомендации использования дискретного режима для внутривенного введения ЛО при проведении доклинических и клинических исследований.

About the authors

V. S Pokrovsky

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Sciences

Email: vadimpokrovsky@yandex.ru.

E. M Treshalina

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Sciences

E. V Lukasheva

People’s Friendship University

L. A Sedakova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center of the Russian Academy of Medical Sciences

References

Supplementary files