Morphological changes during Geren carcinoma after cryoablation, a local microwave hyperthermia and their combination

Full Text

В настоящее время в клинической практике, и в част- ности в онкологии, широко используется криогенный метод, оказавшийся эффективным средством лечения различных доброкачественных и злокачественных но- вообразований [1, 2]. Тем не менее результаты низко- температурного лечения не всегда удовлетворительны, особенно при значительных размерах злокачественных опухолей, их выраженной васкуляризации, что обуслов- ливает поиск путей усиления степени криодеструкции опухолевой ткани. Перспективным направлением, спо- собствующим увеличению степени деструкции пато- логически измененных тканей и как следствие этого повышению радикализма лечения, может служить ком- бинированное использование криодеструкции с локаль- ной гипертермией [3, 4], лучевой терапией [5], ультра- звуком [6], химиотерапией [7]. При морфологическом исследовании опухолей после лечебных воздействий основными характеристиками патологических отклоне- ний считают изменения клеточного состава ткани, раз- меров клеток и ядер, структуры ядер и т.д. [8]. Однако такой традиционный подход носит субъективный ха- рактер. Поэтому для объективного суждения о наличии изменений необходимо использование количественных методов оценки параметров клеток [9, 10]. Кроме изменений клеточного состава в опухолевой ткани, важную роль играет состояние неоангиогенеза [11]. На сегодняшний день золотым стандартом оценки неоангиогенеза в тканях опухолей является показатель плотности сосудов [12, 13]. Исходя из этого, целью нашего исследования было изучение патоморфоза карциномы Герена под воздей- ствием как самостоятельного, так и комбинированного применения СВЧ-гипертермии и криодеструкции. Материал и методы Экспериментальные исследования проведены на 50 половозрелых беспородных белых крысах-самцах массой 100—150 г, полученных из вивария Киевского государственного университета им. Т.Г. Шевченко. В качестве модели опухолевого роста использован штамм карциномы Герена. Трансплантацию опухолевых клеток проводили в дозе 1 ∙ 106 клеток на животное в изотоническом растворе NaCl в объеме 0,3 мл, вводимой под кожу наружной поверхности нижней трети голени. Через 10—12 сут после трансплантации, когда средний объем опухолей достигал 3,18±0,64 см3, животных разбивали на группы таким образом, чтобы средний объем опухолей был одинаковым. Животных разделили на 4 группы по 5 крыс в группе: 1-я — криодеструкция опухоли, 2-я — криодеструкция с последующей (через 24 ч) троль в цикле замораживания-оттаивания опухолевой ткани осуществляли с помощью медьконстантановых термопар. Показания термопар оценивали с помощью потенциометра КСП-4 и коммутатора Ф-240. Замора- живание опухоли проводили до температур -10, -15ºС. Продолжительность низкотемпературного воздействия на опухоль определялась индивидуальными размерами опухолей и варьировала от 30 с до 3,5 мин. Заморажива- ние осуществлялось однократно с последующим есте- ственным оттаиванием опухолевой ткани. Локальную СВЧ-гипертермию опухоли проводили с применением генератора "Ромашка" (Россия). Мощность излучения на антенне составляла 10 Вт при частоте излучения 460 МГц. Температуру нагрева конечности с опухолью доводили до 42—43ºС с помощью тех же термодатчиков, что и при криодеструкции. Регистрацию температуры в опухоли проводили при отключении СВЧ-генератора на том же оборудовании, что и при криодеструкции опухо- ли. Экспозиция нагрева зависела от размера опухоли и составляла 40—60 мин. Все виды воздействий осущест- вляли под этаминал-натриевым наркозом (40 мг/кг, вну- трибрюшинно). Через 48 ч после воздействия животных забивали методом эвтаназии с соблюдением положений, изложенных в Европейской конвенции о защите позво- ночных животных, которые используются для исследо- вательских и других научных целей (Страсбург, 1986). Отобранные для морфологических исследований образ- цы опухолевой ткани после СВЧ-гипертермии, криоде- струкции и их комбинации фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. После стандартной проводки в спиртах возрастающей крепости материал заливали в парафин. Из парафиновых блоков изготавливали срезы опухоли толщиной 6 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином, а также азур II-эозином. Светооптическая оценка морфологической картины изменений в опухолях под воздействием использованных методов деструкции осуществлялась с помощью микро- скопа MPI 1(Польша) при увеличении ок. 10, об. 20, 40. Морфометрические исследования проводились с по- мощью микроскопа Olympus BX51 (Япония). Для коли- чественного анализа изменений в опухоли использова- ли следующие морфометрические показатели: среднюю площадь опухолевых клеток и их ядер, а также количе- ство кровеносных сосудов, т.е. плотность капилляров на единицу площади ткани опухоли (1 мм2). Для более де- тального сравнения эффективности используемых мето- дов деструкции опухоли применяли формулу Г. А. Лав- никовой [14]: Пк – По локальной СВЧ-гипертермией опухоли, 3-я — локальная СВЧ-гипертермия опухоли, 4-я — контрольная (без воз- ИП = Пк ∙ 100%, действия на опухоль). Для криогенного воздействия использовали аппликатор "Криотон-3" (Украина) с температурой на поверхности аппликатора (-160ºС). Температурный кон- Для корреспонденции: Самедов Вьюсал Хормет оглы — аспирант каф. онкологии, 04112, Украина, г. Киев, ул. Дорого- жицкая, 9, e-mail: vusal_sh@mail.ru. где ИП — индекс повреждения (объем погибшей тка- ни опухоли); Пк — средний объем опухоли в контроле; По — средний объем опухоли в опытной группе. Опухолевые клетки и эндотелий кровеносных сосу- дов считали погибшими при наличии признаков цитоли- за, кариолиза и кариопикноза. Различия между группами оценивали статистически с использованием t-критерия Стьюдента и Вилкоксона, программ MS Excel 2007 и 18 КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Т а б лица 1 Морфометрические параметры опухолевых клеток карциномы Герена после низкотемпературных и высокотемпературных воз- действий (M±m) Т а б лица 2 Плотность капилляров в участках карциномы Герена (M±m) Виды воздействия Плотность капилляров в 1 мм2 Контроль 17,3±2,4 Виды воздействия Площадь клеток, мкм2 Площадь ядер клеток, мкм2 Гипертермия 14,8±4,2 Контроль 285,4±14,9 179,4±12,6 Гипертермия 226,7±11,8* 125,3±10,2* Криодеструкция 121,8±5,7* 76,8±5,0* Гипертермия + криодеструкция 122,1±9,4*,** 79,6±4,2*,** Приме чани е. Здесь и в табл. 2: * — p <0,05 по отношению к кон- трольной группе животных; ** — p <0,05 по отношению к группе животных с гипертермией. Statistica 6.0. Достоверными считали результаты с уровнем значимости больше 95% (p <0,05). Результаты и обсуждение С помощью световой микроскопии установлено, что опухолевые клетки контрольной группы животных ха- рактеризуются солидным типом роста, т.е. растут в виде пластов, очагов с компактным расположением. Клетки до- вольно крупных размеров, цитоплазма интенсивно окра- шена, эозинофильная, ядра округлой формы с зернистой Криодеструкция 10,5±2,4* Гипертермия + криодеструкция 7,7±1,1*,** текстурой хроматина. Средняя площадь клеток состав- ляет 285,4±14,9 мкм2, а ядер — 179,4±12,6 мкм2 (табл. 1). В части из них отмечено эксцентрическое расположение ядер. Различные по величине очаги опухолевых клеток разделены между собой большими или меньшими по площади полями некробиотической ткани. Вблизи очагов некроза опухолевые клетки характеризуются дистрофи- ческими изменениями, явлениями кариолиза, из-за чего они имеют гомогенный вид и граница между ядром и ци- топлазмой четко не определяется (рис. а). Встречаются клетки-тени. В опухолевой ткани имеются множествен- ные капилляры, плотность их расположения и диаметр в разных участках опухоли не однотипны. Средняя плот- ность капилляров составила 17,3±2,4 сосуда/мм2 (табл. 2). В просвете капилляров определяются эритроциты и гра- Карцинома Герена. а — солидный рост карциномы в контрольной группе животных; б — участок некробиотической гибели опухолевых клеток после СВЧ-гипертермии; в — фор- мирование соединительной ткани в участке гибели опухолевых клеток после криодеструкции; г — участок гибели опухолевых клеток по типу коагуляционного некроза после криодеструкции и последующей СВЧ-гипертермии. Окраска гематоксилином и эозином. об. 20, ок. 10. 19 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2013 нулярные лейкоциты. Соединительнотканный компонент опухоли представлен в виде переплетающихся нежных и более грубых волокнистых структур и умеренно развитой сети капилляров. При изучении патоморфоза опухолей после СВЧ- гипертермии установлено много общих черт с контроль- ной карциномой Герена (рис. б). В целом структура опухоли и цитоархитектоника клеток мало изменены. Обращает на себя внимание очень большое количество митозов, в том числе патологических форм деления. Од- нако имеются участки, в которых границы между опухо- левыми клетками как бы размыты. В некоторых из них определяются дистрофические изменения, кариолиз. Цитоплазма части клеток базофильная. Средняя площадь клеток составила 226,7±11,8 мкм2, а ядер — 125,3±10,2 мкм2, что достоверно меньше, чем в контроле (p <0,05) (см. табл. 1). В очаге роста опухоли обнаружи- ваются локальные лимфоцитарные инфильтраты. В неко- торых участках опухоли имеются небольшие очаги по- гибших клеток, клеточный детрит. В опухолевой ткани определяется большое количество капилляров, плотность и диаметр их в разных участках опухоли различаются. Средняя плотность капилляров составила 14,8±4,2 со- суда/мм2, т. е. не имела статистически значимых отличий от показателя в контрольной группе (см. табл. 2). После криодеструкции на фоне уменьшенных в раз- мерах опухолевых клеток определяются обширные оча- ги некробиотической гибели клеток, клеточный детрит, большую площадь занимают кровоизлияния (рис. в). Непосредственно к этим участкам примыкает соеди- нительнотканный компонент с выраженной фибробла- стической реакцией в виде образования большого количества соединяющихся между собой цитоплазмати- ческими отростками фибробластов. Отмечается тенден- ция к врастанию фибробластов в очаг некроза. Средняя площадь клеток составляет 121,8±5,7 мкм2, а ядер — 76,8±5,0 мкм2, что достоверно меньше по сравнению с соответствующими показателями контрольной груп- пы (p <0,05) (см. табл. 1). Среди разрастания соедини- тельной ткани встречается большое количество мелких капилляров, часть из которых расширена и заполнена кровью. Средняя плотность расположения капилляров составила 10,5±2,4 сосуда/мм2, что значительно мень- ше по сравнению с контрольной группой животных (p <0,05) (см. табл. 2). При сочетанном воздействии на опухоль криоде- струкции и СВЧ-гипертермии установлен значительный некроз ткани опухоли, главным образом по периферии, а в центре определяется солидный пласт резко умень- шенных в размерах клеток без четкой окраски, но с со- храненным в большинстве из них хроматином ядер, что, по-видимому, является следствием коагуляционного не- кроза (рис. г). В то же время к этому очагу прилежит не- большой участок из обособленно, рыхло лежащих опу- холевых клеток с обычной эозинофильной цитоплазмой, эксцентрично расположенными пикнотичными, нечетко контурированными ядрами с различной степенью выра- женности дистрофических изменений, в основном с глу- бокими. Средняя площадь клеток составляет 122,1±9,4 мкм2, а ядер — 79,6±4,2 мкм2, что достоверно меньше (p <0,05) показателей в опухолях не только контроль- ной группы, но и группы с гипертермией (см. табл. 1). Среди некробиотической ткани встречается большое количество мелких капилляров в состоянии некроза и деструкции, часть из которых заполнена форменными элементами в состоянии гемолиза. Средняя плотность капилляров составила 7,7±1,1 сосуда/мм2, что достоверно меньше (p <0,05), чем у животных контрольной группы и после гипертермии (см. табл. 2). Оценка патоморфоза опухолей по методу Г.А. Лавниковой [14] показала, что индекс повреждения для группы с СВЧ-гипертермией составляет 18,2%, для группы с криодеструкцией опухоли — 24,5%, а в группе криодеструкция + СВЧ-гипертермия — 69,6%. Эти данные в сочетании с показателями морфологических изменений опухолевых клеток после проведенных воздействий свидетельствуют о разной степени деструкции опухолевой ткани карциномы Герена. Таким образом, самостоятельное применение локальной СВЧ-гипертермии не оказывает существенного деструктивного действия на карциному Герена. Отмечены лишь незначительные локальные очаги некроза опухоли. В отличие от гипертермии криодеструкция вызывает более обширный некроз опухолевой ткани, ангионекроз, что сопровождается обширными кровоизлияниями. В опухоли отмечаются значительные пласты погибших клеток, главным образом по периферии опухолевого узла. Комбинированное воздействие используемых методов оказывает наиболее существенный противоопухолевый эффект. Данный способ вызывает обширный некроз опухоли не только по периферии карциномы, но и в центральных ее участках. Большинство сосудов в результате криодеструкции некротизированы, регионарная гемодинамика существенно заблокирована, о чем свидетельствует стаз гемолизированной крови в кровеносных сосудах карциномы Герена. Выявленный патоморфоз опухолевой ткани карциномы Герена свидетельствует о возможности усиления степени ее деструкции при комбинированном использовании криогенного воздействия и последующей локальной СВЧ-гипертермии, что может найти клиническое применение в лечении больных со злокачественными новообразованиями.

About the authors

V. H Samedov

National Medical Academy of Postgraduate Education named after P.L.Shupyk Ministry of Health of Ukraine

Email: vusal_sh@mail.ru

L. A Naleskina

R.E.Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology of NAS of Ukraine

V. D Zakharychev

National Medical Academy of Postgraduate Education named after P.L.Shupyk Ministry of Health of Ukraine

References

Supplementary files