Immunosignature - peptide microarray for diagnostic of cancer and other diseases

Full Text

По данным ВОЗ (2013), во всем мире ежегодно заболевают раком более 14 млн человек. В России ежегодно регистрируется более 0,5 млн новых случаев рака и 0,3 млн случаев смерти, связанных с раком. Согласно последним статистическим данным, в течение последних 10 лет в мире, и в том числе в России, отмечается рост заболеваемости раком. Так, абсолютное число новых случаев заболевания раком (525 931) в 2012 г. было на 8,25% больше по сравнению с 2007 г. [1] . Всего же в России проживает около 3 млн человек - больных онкологическими заболеваниями, которые требуют постоянного наблюдения и мониторинга. Следует отметить и то, что, несмотря на развитие новых медицинских технологий и терапевтических стратегий, направленных на борьбу с раком, многие страны мира, включая Россию, сталкиваются с увеличением смертности от рака. Одной из причин высокой смертности считается позднее выявление онкологических заболеваний. В связи с этим ранняя диагностика злокачественных новообразований является актуальным и наиболее перспективным подходом для снижения инвалидности и смертности, вызванной раком. В настоящее время большое внимание уделяется поиску новых потенциальных биомаркеров рака. Так, представляет интерес использование протеом- ных подходов к идентификации сывороточных биомаркеров, используемых для оценки риска развития рака, а также в доклинической диагностике злокачественных опухолей, выборе индивидуализированной терапии, мониторинге прогрессирования и рецидивов заболевания (рис. 1) [2, 3]. Рис. 1. Для чего нужны биомаркеры? Известно, что эффективными и практичными для раннего выявления заболеваний являются те биомаркеры, которые могут быть получены с помощью малоинвазивных или неинвазивных методик. Основными характеристиками идеальных биомаркеров являются: стабильность, специфичность и возможность определения с использованием универсальных (так называемых потоковых) методов. Известные современные методы обнаружения белковых биомаркеров включают прямой анализ растворимых или клеточных опухолевых антигенов, таких как р53, PSA, CEA, BRCA1/2 и EGFR, с помощью двухмерного электрофореза, иммуноферментного анализа, методов иммуногистохимии и др. [4]. Несмотря на то что эти методы достаточно специфичные, они требуют сформировавшихся раковых опухолей (> 2,5 см), доступных для биопсии и (или) продукции высоких концентрации белков для обнаружения биомаркера в сыворотке [5]. Однако, как правило, в таких случаях опухоль может быть легко определена специалистом-онкологом в результате простого осмотра. Кроме того, используемые биомаркеры нестабильны, что приводит к противоречивым результатам при мониторинге лечения и рецидива заболевания [6, 7]. Антитела против антигенов, ассоциированных с опухолями (ТАА - «tumor associated antigens»), в настоящее время приобретают все больший интерес в качестве альтернативы циркулирующим биомаркерам, для выявления рака на локализованной и излечимой стадии. Известно, что антитела обеспечивают первую линию защиту организма, обнаруживая, нейтрализуя и удаляя чужеродные белки и микроорганизмы в антиген-специфической манере. С каждым годом набирается все больше доказательств свидетельствующих в пользу того, что в опухолях присутствуют многочисленные типы белков-антигенов как с обычной аминокислотной последовательностью (но с увеличенной экспрессией), так и мутантных (измененные формы существующих белков, или совершенно новые последовательности), которые стимулируют продукцию антиген-специфических антител В-клетками (плазматическими клетками). Изменение количества и специфичности антител в сыворотке указывает на происходящие процессы в организме, которые отражают различные физиологические и патофизиологические состояния, включая развитие онкологических заболеваний. Таким образом, мониторинг качественных изменений циркулирующих антител представляет собой перспективный способ диагностики и прогноза онкологических заболеваний. Примеры антител против известных ТАА, найденных в сыворотке больных раком, представлены в таблице. Однако наличие антител против ТАА не обязательно говорит о защитных противоопухолевых механизмах, а скорее отражает иммунологическую реакцию на развитие опухоли. На настоящий момент не совсем ясно, как ТАА (часто внутриклеточные) индуцируют продукцию антител. Предполагают, что избыточная экспрессия и посттрансляционные модификации в сочетании с воспалением при аномальной гибели опухолевых клеток могут усиливать иммуногенность ТАА [8, 9]. Независимо от их биологической роли антитела в сыворотке онкологических больных представляют значительный интерес в качестве раннего индикатора развития рака. Практичность антител в качестве биомаркеров онкологических заболеваний особо подчеркивается их стабильностью, специфичностью и ранней продукцией в ответ на антиген. Для определения антител против ТАА в настоящее время используют методы: кДНК экспрессии, библиотеки фагового дисплея, двухмерный вестерн- блоттинг, двухмерную иммуноаффинную хроматографию и белковые микрочипы [21-23]. Несмотря на множество интересных и обнадеживающих результатов, полученных с помощью этих методов, они занимают много времени и не могут быть легко автоматизированы для клинической диагностики рака. Плюсы и минусы этих методов обсуждаются ниже. Опухолевые антигены, распознаваемые циркулирующими антителами Белок Функция Опухоль Ссылка HSP60 Клеточный стресс Молочной железы 10 p53 Онкосупрессор Молочной железы, поджелудочной железы, легкого 11, 12, 13, 14 NY-ESO-1 Дифференцировка Легкого, предстательной железы 15, 16 CAGE Геликаза Легкого 13 EGFR Рецептор Молочной железы, кишечника 17, 18 p62 Регуляция РНК Предстательной железы, поджелудочной железы, легкого 12, 14, 19 BRCA-1/2 Деление клеток Молочной железы 20 SEREX (Serological analysis of tumor antigens by recombinant cDNA expression cloning - серологический анализ опухолевых антигенов с помощью клонирования рекомбинантной кДНК). Первоначально методы клонирования рекомбинантной кДНК, или фаговый дисплей, использовались для идентификации новых ТАА путем скрининга библиотек кДНК, полученных из опухолевых тканей и сыворотки от онкологических пациентов [24]. Для сравнения антител против ТАА, контрольные сыворотки и сыворотки от пациентов проверяют на связывание с продуктами кДНК, которые обычно экспрессируют в прокариотических клетках. Используя такой подход, были проанализированы профили антител в сыворотках пациентов с глиомой, раком предстательной железы и раком легкого [25-27]. Одним из недостатков этого метода является то, что кДНК, как правило, получают из образца опухоли одного пациента. Учитывая неоднородность экспрессии генов в различных опухолях, этого не достаточно, чтобы сравнить антитела разнообразной специфичности. Кроме того, при использовании кДНК в основном экспрессируются белки, которые часто встречаются в опухолевой ткани, а минорные белки остаются незамеченными. Еще одним часто используемым методом для скрининга антител является SERPA (serological proteome analysis - серологический анализ протеома), который использует достаточно трудоемкую технику двухмерного электрофореза для разделения лизатов опухолевых клеток с последующим блоттингом и зондированием с сыворотками от здоровых людей или онкологических пациентов [28]. В дополнение перед электрофорезом из лизатов опухолевых клеток белки, реагирующие с иммуноглобулинами из сывороток здоровых людей, могут быть удалены на иммуноаффинных колонках, этот метод называется MAPPing (multiple affinity protein profiling - многоаффинное профилирование белков) [29, 30]. Эти методы применялись для изучения многих видов рака, таких как меланома, рак предстательной железы, почек и кишечника [25, 31-33]. Среди недостатков этих методов можно перечислить ограничения, присущие двухмерному электрофорезу, такие как невозможность анализа некоторых классов белков (например, мембранных) и трудности в получении воспроизводимых двухмерных гелей [21, 22]. Кроме того, эти процедуры занимают много времени, дорогостоящие и плохо поддаются стандартизации. Методами, которые подходят для анализа большого количества образцов и имеют высокую пропускную способность, являются микрочипы. В настоящее время используются два вида микрочипов. Первые включают белковые микрочипы, покрытые известными опухолевыми антигенами, на которых можно сравнивать профиль связывающих антител в различных сыворотках [34]. Другие микрочипы используют стратегию обратного захвата, когда на микрочипах иммоболизированы моноклональные антитела против ТАА, которые захватывают белки из экстрактов опухолевых клеток и могут быть зондированы с мечеными IgG из контрольных или онкологических сывороток [35]. Понятно, что микрочипы, использующие коммерческие антитела или антигены, не могут обнаружить взаимодействия с неизвестными белками [36]. Несмотря на определенные ограничения, исследования показали, что микрочипы, содержащие множество белков, имеют более высокую диагностическую ценность, чем единичный маркер [37]. Основной проблемой для использования известных антигенов при оценке опухоль-специфических антител является крайняя нехватка кандидатов. Наши знания о процессе развития опухоли еще недостаточны, чтобы предугадать, какие антигены являются наиболее важными для широкого скрининга антител. Многие антигены, описанные в литературе, являются индивидуальными для одного пациента; найти те, которые присутствуют и характеризуют опухоли у разных пациентов, требует долгих и дорогостоящих исследований. Что можно сделать, не зная специфических антигенов? Представьте себе липкую ленту, на которую наносятся все сывороточные антитела. Если бы эта липкая лента могла отсортировать миллиарды антител, было бы относительно просто выделить группы, например соответствующие индивидуальным особенностям пациента антитела, общие для всех людей и общие только для людей с определенным заболеванием. Именно этот, несколько стохастический метод, мог бы предложить диагностику, которая обладает высокой чувствительностью, достаточной специфичностью и простотой для клинического использования. Метод, названный «иммуносигнатурой» (immu- nosignature), использующий именно такой (стохастический) подход, был недавно описан [38]. Данный метод основан на применении микрочипов, где пептиды со случайными аминокислотными последовательностями, ковалентно связанные с предметным стеклом, используются для обнаружения болезней в зависимости от изменения в профиле циркулирующих антител [39]. В иммуносигнатуре пептиды служат частичным или полным подобием эпитопов антигена (мимео- топ). Использование множества пептидов, представляющих вероятные аминокислотные последовательности белков, делает возможным определение связывающего партнера для многих антител, даже если точное совпадение для эпитопа отсутствует. Использование нескольких пептидов значительно увеличивает диагностическую и прогностическую ценность этого анализа, так как это имитирует панель потенциальных ТАА, необходимых для оптимальной чувствительности и специфичности. Первое поколение микрочипов для определения иммуносигнатуры производится методом прямой печати (нанесения) синтезированных пептидов (всего 10 000 пептидов, длиной в 20 аминокислот) на предметные стекла [40]. Микрочипы второго поколения, находящиеся в стадии разработки, содержат 350 000 пептидов в среднем 11 аминокислот. Принципы технологии фотолитографического производства пептидных микрочипов второго поколения представлены на рис. 2. Алгоритм для синтеза пептидов на микрочипах рассчитан на то, чтобы представить максимально возможное количество комбинаторных аминокислотных последовательностей белков, а не фокусируется на конкретном патогене или организме, позволяя использование тех же микрочипов для диагностики любого заболевания и инфекций у мышей, собак, людей и других животных. Используя a Ф ляллллллл I I I I I I I I I ЩЩЩЩЦЩ! t t t * t t 4 f 1 GGGEEEGGG AAAAAAAAA t f t 1 r f i I I GGGEEEGGG AAAAAAAAA ft щщцщиши шшш i ч ч i ч * ifi GGGE EEGGG AAAAAAAAA f f f ...... QQQ £ £ £ £ 116 6 6 AAAAAAAAA J I I L 10l ► I I I AAAAAAAAA _J I I I I I I I L_ ЛЛЛлллЛЛЛ I I I I I I I I 1_ И l ППН i i i i F F F i i i D D D i i i G G G H H H R R R i i i G G G шШш ф I I I I I LJ I I шШш _! l_l l_l LJ I L_ AAAAAAAAA i i i s s s I I I s s s I I I QQQ E E E G G G J I I I и Y Y Y i i Рис. 2. Фотолитографический метод синтеза пептидов. Первая аминокислота (А) ковалентно присоединена к подложке микрочипа; шаг 1 - чип облучают светом определенной длины волны через шаблон (или маску), в результате чего светочувствительная защита снимается в определенных точках на чипе; шаг 2 - раствор, содержащий аминокислоту (Е) добавляют на чип; шаг 3 - аминокислоты присоединяются только в точках с удаленной защитной; шаги 4-10 иллюстрируют использование различных шаблонов, которые открывают другие позиции на чипе для присоединения следующей аминокислоты. После того когда все предполагаемые аминокислоты первого слоя связались, цикл повторяется. Всего требуется до 20 циклов (в зависимости от количества аминокислот, используемых для синтеза) с применением соответствующих шаблонов для снятия светочувствительной защиты с последующим добавлением одной из 20 аминокислот. Все циклы повторяются до тех пор все пептиды не достигли желаемой длины и аминокислотной последовательности. набор комбинаторных пептидов-лигандов, с которыми могут связываться сывороточные антитела, нет необходимости знать специфический антиген, чтобы поставить диагноз. Измененные белки, которые возникают из-за геномных или транскрипционных модификаций в опухолевых клетках, не должны быть представлены на микрочипе. Антитела против таких неканонических белков будут связываться с пептидами, представленными на микрочипах иммуносигнатуры [36]. Информативные пептиды (мимеотопы) не должны совпадать с аминокислотной последовательностью белков, для того чтобы обнаружить взаимодействующие антитела. Моноклональные антитела, полученные против линейных, конформационных и углеводных эпитопов, показали совершенно определенные иммуносигнатуры на микрочипах [38]. Следует отметить, что чем больше число пептидных последовательностей на микрочипе, тем выше вероятность нахождения естественного линейного эпитопа. 10 000 пептидов для этого слишком мало, но 330 000 пептидов (в каждом 11 аминокислот) содержат большую часть линейных эпитопов (обычно 4 и 5 аминокислот), распознаваемых сывороточными антителами. Хотя это необязательно для клинической диагностики, наличие мимеотопов на микрочипе может быть полезным инструментом для исследования и создания новых терапевтических средств. Принцип экспериментального анализа пептидных микрочипов прост и напоминает протокол иммуноферментного анализа (рис. 3, см. 3-ю полосу обложки). Микрочипы изготавливаются на стандартных предметных стеклах, что позволяет использование стандартного лабораторного оборудования. Пептидные микрочипы сначала инкубируют с разведенной сывороткой (1:20 000) пациента или животного. После троекратной промывки добавляются вторичные флюоресцентные антитела, распознающие определенные изотипы иммуноглобулинов. После отмывки несвязанных вторичных антител микрочипы сканируют с использованием высокоскоростного конфокального двухлазерного сканера и фиксируют уровень флюоресценции для каждой точки, представляющей определенный пептид. Анализ данных и статистическая оценка результатов - наиболее важная и сложная часть каждого эксперимента с использованием микрочипов (рис. 4, см. 3-ю полосу обложки). Первоначально интенсивность флюоресценции нормализуется и микрочипы проверяют с использованием алгоритма контроля качества. Этот алгоритм определяет микрочипы с артефактами сканированных изображений без необходимости просматривать каждое изображение вручную. Числовые значения флюоресценции повторов изображений без артефактов усредняются и используются для определения иммуносигнатуры. Информативные пептиды, представляющие иммуносигнатуру заболевания, выбираются с помощью Т-теста (обычно р < 10-7) с последующей выборкой максимально отличающихся значений и кластерным анализом образцов, чтобы усилить контраст между контролем и экспериментом. Перекрестную проверку иммуносигнатуры проводят с использованием алгоритма машинного обучения, обычно с помощью метода опорных векторов (Support vector machine; SVM), на небольшой выборке пациентов. Аккуратность прогноза, специфичность и чувствительность иммуносигнатуры определяются с помощью обучающего алгоритма, используя группу доноров, не включенных в отбор, и перекрестную проверку иммуносигнатуры. Когда набор пептидов, которые обнаруживают и классифицируют определенное заболевание, установлен, дальнейший выбор иммуносигнатуры не нужен. Если, однако, дополнительные заболевания добавляются к диагностической панели иммуносигнатур, необходимо обеспечить, чтобы эти пептиды могли определить новые болезни. Без экспериментального анализа сывороток пациентов, никто не может знать a priori, имеет ли новая болезнь перекрывающиеся иммуносигнатуры с другими заболеваниями. На сегодняшний день иммуносигнатуры были использованы для классификации более 40 различных заболеваний у людей и животных (собак). Точность прогнозирования и диагностики обычно превышает 94% [41]. Опубликованные результаты указывают, что иммуносигнатура может различить различные виды опухолей головного мозга, в том числе агрессивные формы глиобластомы [41]. У пациентов с глиобластомой метилирование промотора О6-метил- гуанин-ДНК метилтрансферазы (MGMT) коррелирует с увеличенной выживаемостью после лечения с темозоломидом [42, 43]. Это эпигенетическое изменение имеет четкое отражение в иммуносигнатуре, иллюстрирующее, что гуморальный иммунный ответ может не только имитировать существующие молекулярные биомаркеры, но также расширяет их диагностические возможности [41]. С помощью иммуносигнатур можно также определить, в каком органе развивается онкологическое заболевание; иммуносигнатуры рака молочной железы и опухоли мозга хорошо различимы [41]. Более того, даже в одном органе различные заболевания могут приводить к развитию характерных иммуносигнатур. Ранние стадии рака поджелудочной железы - PanIN (Pancreatic Intraepithelial Neoplasia) хорошо отличимы от диабета, панкреатита, аденокарциномы протоков поджелудочной железы с помощью иммуносигнатуры [44]. Возможность обнаружения PanIN показывает, что иммуносигнатуру можно использовать в диагностике рака на начальных стадиях, еще до метастазирования, когда лечение может быть эффективным. Болезнь Альцгеймера (БА) является еще одним хроническим заболеванием, которое развивается и прогрессирует в течение многих лет. В работах L. Restrepo и соавт. [45] было показано, что иммуносигнатура пациентов с БА отличается от иммуносигнатуры здоровых доноров соответствующей возрастной группы и пациентов с деменцией, не обусловленной БА. Также примером раннего выявления БА может служить и «мышиная» модель болезни Альцгеймера - используя иммуносигнатуру, можно отличить трансгенных мышей, которые экспрессируют человеческий пресенилин I и химерный предшественник Р-амилоида (Ap), от обычных мышей еще до развития амилоидных бляшек и снижения когнитивных функций [45]. Кроме того, в «мышиной» модели гриппа было показано, что с помощью иммуносигнатуры можно обнаружить инфекцию на 3 дня раньше, чем используя стандартные методы, такие как иммуноферментный анализ [39]. Так как онкологи продолжают требовать все более чувствительные методы для ранней диагностики, это обусловливает снижение интереса к ДНК- и белковым биомаркерам. Масс-спектрометрия когда-то была очевидным методом для обнаружения биомаркеров, однако сегодня интерес к этому методу снижается из- за разброса результатов между лабораториями, технологических ошибок и чувствительности [5, 7]. Для того чтобы улучшить мониторинг здоровья среди населения, а это как раз то, что требуется для раннего выявление рака, нужен надежный, недорогой и простой тест, который можно воспроизвести в любой лаборатории. Именно микрочипы с синтетическими пептидами обладают такими качествами. В отличие от ДНК-чипов, где методы выделения РНК из опухолевых клеток серьезно влияют на качество теста, циркулирующие антитела очень стабильны и не требуют длительной подготовки проб. Использование пептидов со случайными аминокислотными последовательностями также дает возможность избежать ошибок, связанных с дизайном диагностического теста и выбором онкомаркеров, которые меняются с развитием наших знаний о патофизиологии опухолей. Это также позволяет создать наборы диагностических характеристик (иммуносигнатур) для многих заболеваний простым сравнением групп пациентов с подходящими контрольными группами. Онкологическое сообщество обещало системы раннего обнаружения рака в течение многих десятилетий. Наконец, мы имеем технологии, чтобы выполнить это обещание. Работа выполнена в рамках государственного задания «Комбинаторная биология как платформа для создания медико-биологических препаратов». Шифр: 303.

About the authors

Andrei I. Chapoval

Altai State University

Email: andreichapoval@gmail.com
cand. biol. sciences, director of the Russian-American Anti-Cancer Center 656049, Barnaul, Russian Federation

J. B Legutki

Arizona State University

Biodesign Institute, Arizona State University Tempe, AZ 85287, USA

P. Stafford

Arizona State University

Biodesign Institute, Arizona State University Tempe, AZ 85287, USA

A. V Trebukhov

Altai State University

Russian-American Anti-Cancer Center, Altai State University 656049, Barnaul, Russian Federation

S. A Johnston

Arizona State University

Biodesign Institute, Arizona State University Tempe, AZ 85287, USA

Ya. N Shoykhet

Altai State University; Altai State Medical University

Russian-American Anti-Cancer Center, Altai State University 656049, Barnaul, Russian Federation

A. F Lazarev

Altai State University; N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under Russian Academy of Medical Science

Russian-American Anti-Cancer Center, Altai State University; Altai branch of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under Russian Academy of Medical Science 656049, Barnaul, Russian Federation

References

Supplementary files