Metabolomic research in oncology

Full Text

По данным Всемирной организации здравоохранения, каждый год от онкологических заболеваний в мире умирают более 7,5 млн человек. В России на конец 2012 г. на учете в онкологических учреждениях состояли более 3,0 млн больных. Заболевание в 60 % случаев диагностируется в III-IV стадиях. Высокий уровень смертности в России от онкологических заболеваний обусловлен поздним выявлением недугов [1]. Для обнаружения опухолевого процесса необходимо применение разнообразных методов диагностики, каждый из которых имеет свои возможности и ограничения. На сегодня скрининговые исследования сосредоточились, прежде всего, на методиках отображения, таких как компьютерная томография, магнитно-резонансная томография, эндоскопия и ультрасонография, в сочетании с клиническими анализами; однако эти методы отнимают много времени и дискомфортны для пациентов, требуют квалифицированного штата врачей и дорогого оборудования. Золотым стандартом для диагностики и определения стадии раковых заболеваний является гисто- патология. Развитие молекулярных аналитических методов, таких как иммуногистохимия и флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) расширили микроскопическое исследование и способствовали открытию биомаркеров. Оба метода были широко приняты в практике патологии. Совсем недавно были предложены молекулярные аналитические методы определения нецелевых РНК, ДНК и белка. Дополнительной для этих подходов является метаболоми- ка - область науки, изучающая конечные и промежуточные продукты обмена веществ в биологической системе, будь то клетка, орган или организм в целом [2] . Метаболом или метаболический профиль представляет собой совокупность всех низкомолекулярных метаболитов (< 1500 Da) биологического образца, являясь уникальным химическим «отпечатком пальцев», специфичным для процессов, протекающих в живых клетках [3]. Последние исследования показали, что метаболомика может выявить специфические признаки болезни, так называемые биомаркеры, которые в будущем сыграют большую роль в диагностике и прогнозе заболевания [4-6]. Еще в 1971 г. L. Pauling и соавт. [7] выдвинули идею применения метаболического профиля в диагностике заболеваний. Они предложили производить анализ выдыхаемого воздуха пациентов методом газовой хроматографии для выявления метаболических изменений при определенных заболеваниях и обнаружили более 200 различных летучих органических соединений (ЛОС). В январе 2007 г. ученые университета Альберта и университета Калгари завершили исследование метаболомического профиля человека. Они каталогизировали около 2500 метаболитов, 1200 лекарств и 3500 компонентов пищи, которые могут быть найдены в биологических образцах человека [8]. Исследования метаболомического профиля образцов выполняются с использованием гибридного метода анализа - сочетания газовой (ГХ) или жидкостной (ЖХ) хроматографии и масс-спектрометрии (МС) или спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопия). ГХ - универсальный метод разделения смеси веществ, испаряющихся без разложения [9, 10]. Биологические жидкости (кровь, моча и мокрота), выдыхаемый пациентом воздух - источники, богатые летучими органическими метаболитами, которые могут использоваться в качестве потенциальных биомаркеров заболеваний. Для сбора метаболомических данных используются две основные технологии: МС и ЯМР- спектроскопия, обе достигли высокого уровня по сбору данных [11, 12]. Основным преимуществом МС является чувствительность: современный уровень масс-спектрометров может обнаружить анали- ты в фемтомолярном (10-15) и аттомолярном (10-18) диапазоне. Связь МС с ЖХ или ГХ позволяет измерять сотни отдельных метаболитов в пределах одного образца, и вместе с постоянно пополняемыми базами данных делает идентификацию этих метаболитов более рутинной [13]. Основной сильной стороной ЯМР-спектроскопии является возможность очень точного количественного определения вещества в сложной смеси. Другой важной характеристикой ЯМР-спектроскопии является его универсальность для анализа метаболитов в жидком состоянии (сыворотка крови, моча и т. д.), в неповрежденных тканях (например, опухоль) или в естественных условиях (in vivo) [13]. Хотя метаболомика менее зрелая, чем геномика и протеомика, она уже применяется в разнообразных областях медицины, в том числе скрининге патологии новорожденных, токсикологии, фармакологии. В сравнении с геномикой и протеомикой на ме- таболомику возлагаются большие надежды в поиске биомаркеров заболеваний, и в первую очередь онкологических. Исследования уже показали потенциальную перспективу метаболомики в этой области. A. Sreekumar и соавт. [6] исследовали метаболический профиль 42 образцов ткани, 110 образцов мочи и 110 образцов плазмы с целью выявить особенности такой патологии, как рак предстательной железы. На основе данных ГХ и ЯМР-спектроскопии в общей сложности ими были идентифицированы 1126 метаболитов различных химических классов. Из них только 87 метаболитов отличали биообразцы больных раком предстательной железы от доброкачественной патологии. Концентрация шести метаболитов - саркозина, урацила, кинуренина, глицерин- 3-фосфата, лейцина и пролина значительно повышалась в образцах больных по мере озлокачествления и прогрессирования заболевания предстательной железы. Также ими установлено, что концентрация конкретного метаболита - саркозина - была существенно увеличена на этапе метастатического прогрессирования изучаемой патологии. Этот повышенный уровень саркозина может быть обнаружен в моче. Авторами сделан вывод, что саркозин может стать маркером метастазирования рака предстательной железы. В продолжение исследования Мичиганские ученые планируют разработать анализ мочи, который позволит недорого и надежно измерять уровень саркозина [6]. В исследовании рака яичника, лаборатория доктора Fiehn провела метаболомический скрининг тканей 66 образцов инвазивной формы рака и 9 образцов доброкачественных опухолей яичников [14]. Исследователи обнаружили различие между данными группами образцов по более чем 50 определенным метаболитам. Многие из этих метаболитов играют важную роль в обмене пуринов, пиримидинов, гли- церолипидов и в энергетическом обмене. R. Xue и соавт. использовали этот метод для исследования ЛОС крови, связанных со злокачественной патологией печени. Было установлено, что группа пациентов, страдающих раком печени, и контрольная группа отличались девятнадцатью ЛОС крови (р < 0,05). Из этих девятнадцати соединений 3 (гексанал, 1- октен-3-ол и октан) были найдены в повышенных концентрациях в крови группы больных раком печени по сравнению с контрольной группой [15]. Чтобы исследовать летучие метаболиты мочи, как потенциальные биомаркеры рака C. Silva и соавт. [10] качественно и количественно проанализировали образцы мочи 33 онкологических больных (14 больных лейкемией, 12 - колоректальным раком и 7 - лимфомой) и 21 здорового пациента, используя ТФМЭ-ГХ-МС. В общей сложности в онкологической и контрольной группах идентифицировано 82 летучих метаболита, принадлежащих различным химическим классам. Производные бензола, терпе- ноиды и фенолы были наиболее распространенными классами в онкологической группе, тогда как кетоны и серосодержащие вещества оказались основными классами соединений, выделенными из мочи здоровых пациентов [10]. Метод идентификации летучих биомаркеров дает возможность повысить гистопатологическую диагностику опухоли в образце ткани метаболомиче- скими данными. M. Brown и соавт. [16] разработали методику параллельного выделения метаболитов и гистологического анализа биоптатов. Особенность их технологии заключалась в регистрации метаболо- мического профиля неповрежденных биоптатов, что позволяет проводить оба метода диагностики на одном образце. Изучая также здоровые ткани, ученым впервые удалось описать метаболомический профиль тонкого кишечника, надпочечника и селезенки человека. Были выделены метаболиты, принадлежащие ко всем важнейшим биохимическим классам: аминокислотам, пептидам, углеводам, липидам, нуклеотидам, кофакторам, ксенобиотики. Ими также было обнаружено 69 метаболитов отличающих раковую опухоль почки от образцов доброкачественной опухоли, и определены 83 метаболита, значительно отличающих (р < 0,05) биоптаты рака от доброкачественных образований простаты. Сравнивая результаты, M. Brown и соавт. [16] сделали предположение, что метаболомический профиль опухоли может характеризовать ее стадию и степень злокачественности. Так, некоторые образцы доброкачественных форм опухоли предстательной железы имели сходный с раком набор летучих метаболитов. Авторы связали данный факт с высокой агрессивностью доброкачественной опухоли (быстрый рост, озлокачествление и метастазирование) [16]. Эти исследования демонстрируют реальную взаимосвязь между определенными ЛОС в биологических образцах и злокачественными заболеваниями. Метаболомика находит широкое применение в различных областях науки, в том числе в экспериментальной медицине. M. Hartmann и др. [17] исследовали обнаруженный летучий метаболом культивируемых клеток опухоли толстой кишки линии SW-480 на предмет влияния искусственных добавок в питательную среду на рост и метаболизм опухолевых клеток. Сегодня различные клеточные культуры in vitro широко используются в науке. Эксперименты in vitro применяются в таких фундаментальных исследованиях, как характеристика метаболизма клетки [18] или анализ митоза [19]. В других научных работах культивированные клетки используются как тест-системы для исследования воздействия химиотерапевтических препаратов на клетку [20]. Однако для клеточных культур необходимо добавление в питательные среды животной сыворотки, например сыворотки эмбриона теленка. К сожалению, животные сыворотки имеют ряд недостатков, таких как возможное загрязнение образцов и высокая себестоимость. Для определения влияния искусственных заменителей сыворотки на жизнедеятельность и метаболизм культивируемых клеток M. Hartmann и соавт. [17] использовали метод определения летучих метаболомов клеток методом ГХ-МС. В целом были проанализированы около 50 ЛОС и установлено, что метаболизм культивируемых клеток сильно меняется при добавлении в питательную среду заменителя животной сыворотки. Таким образом, ученые пришли к выводу, что для роста и метаболизма опухолевых клеток и соответственно достоверности экспериментов с культурами клеток линии SW-480 необходимо добавление в питательную среду животной сыворотки [17]. Таким образом, цель метаболомики - расширить возможность ее применения в клинической практике для оценки и мониторинга состояния здоровья населения. Метаболомические исследования летучих соединений сыворотки крови, мочи и прочих биообразцов развиваются в геометрической прогрессии на протяжении ряда последних лет с целью разработки новых быстрых, простых, недорогих методик, которые могут помочь в диагностике и/или прогнозировании различных заболеваний, в первую очередь онкологических. Обнаруживая и измеряя индивидуальные метаболомические профили с повышением специфичности и чувствительности методов, метаболомика подходит к развитию персонализированной медицины. ГХ в сочетании с МС является наиболее «естественной» комбинацией для исследования метабо- ломического профиля. ГХ - универсальный метод разделения смеси испаряющихся веществ. Из двух основных технологий идентификации и количественного анализа метаболитов, МС более предпочтительна, чем ЯМР-спектроскопия. Основным преимуществом МС является чувствительность. Несмотря на то, что большинство клинических МС- анализов проведены в референс-лабораториях, эта картина может измениться в течение ближайших нескольких лет, так как масс-спектрометры стали стандартным инструментом лабораторий и число ученых и врачей, знакомых с этой технологией, продолжает увеличиваться. По сравнению с геномикой или протеомикой ме- таболомика имеет ряд преимуществ, так как биологически максимально близка к фенотипу и, следовательно, имеет возможность быстрого наблюдения за системными изменениями в метаболоме. Хотя аналитические платформы для метаболомики дороги, затраты на образцы низки, и в сочетании с высокой пропускной способностью (время анализа обычно менее 30 мин), они делают возможным проводить метаболическое профилирование как скрининговое исследование большого количества образцов за низкую общую стоимость по сравнению с другими «-омика»-платформами (например, геномикой или протеомикой) [21].

About the authors

Raisa R. Furina

Republican clinical hospital

Email: furina_raisa@mail.ru
doctor-endoscopist 424030, Yoshkar-Ola, Russia Federation

References

Supplementary files