Preclinical results of gemcitabinebased regimens for preoperative chemotherapy of spontaneous feline breast cancer

Full Text

Применение доксорубицина (ДОКС) при неоперабельном раке молочной железы (РМЖ) кошек в предоперационном периоде ограничено относительно низкой чувствительностью и дозолимитирующим побочным действием. В настоящей работе оценена возможность повышения эффективности лечения этой патологии путем использования схемы ДОКС + гемцитабин (ГЕМЦ), хорошо зарекомендовавшей себя при лечении РМЖ человека [1]. Цель исследования - доклиническая оценка эффективности комбинации ДОКС+ГЕМЦ для предоперационной химиотерапии РМЖ кошек. 43 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2015 Задачи: 1. Отработка оптимальных доз ГЕМЦ в комбинации с ДОКС. 2. Патоморфологический контроль эффективности комбинированной химиотерапии. 3. Сравнительная эффективность комбинированного лечения по схеме ДОКС + ГЕМЦ с монохимиотерапией ДОКС. Материал и методы Опухолевая модель. Использован штамм мышиной перевиваемой аденокарциномы молочной железы Ca755 (3-4-й пассаж) из коллекции РОНЦ. В соответствии с действующими в РФ рекомендациями трансплантацию опухоли выполняли мышам сам- кам-гибридам BDF1 под кожу бока по 50 мг опухолевой ткани в 0,5 мл питательной среды 199 [2]. Животные. В качестве доноров опухолевого материала использованы 10 особей мышей самок C57BL/6j, для проведения эксперимента - 70 особей гибридов BDF1 [C57BL/6j • DBA/2] массой тела 2021 г. Мышей получали из питомника «Столбовая» ГУ НЦ БМТ и содержали в отделе лабораторных животных ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» (РОНЦ) при обычном световом дне на экструзированном корме и постоянном доступе к воде. Перед началом опытов всех мышей с перевитыми опухолями распределяли по группам (n=10), одну группу оставляли без специфического лечения и использовали для контроля роста опухоли (КРО). Комбинанты Доксорубицин («Тева», Нидерланды), лиофилизат по 10 мг/фл вводили мышам однократно внутрибрюшинно в разовой дозе 7,5 мг/кг. Гемзар (Lilly, Франция), лиофилизат по 200 мг/фл вводили мышам внутрибрюшинно в двух режимах: 1) однократно в разовых дозах 50,100 и 200 мг/кг; 2) 3-кратно с интервалом 7 дней в суммарных дозах 100 и 200 мг/кг. Комбинированное лечение. На Са755 с относительно коротким периодом роста до гибели (максимально 19 дней после трансплантации) первичная оценка эффективности комбинации выполнена при развившейся опухоли (n=40) с V 595,5±166,7 мм3 на 9-е сутки после трансплантации. ГЕМЦ вводили внутрибрюшинно однократно в дозах 50, 100 и 200 мг/кг. Для проведения комбинированного лечения, аналогичного клинической схеме [4], ГЕМЦ вводили 3-кратным курсом на 2, 9 и 16-е сутки после трансплантации опухоли в разовых дозах 30, 30 и 40 мг/кг (суммарно 100 мг/кг) или в разовых дозах 70, 70 и 60 мг/кг (суммарно 200 мг/кг). ДОКС всегда вводили первым однократно внутрибрюшинно в оптимальной дозе 7,5 мг/кг. В качестве объекта сравнения использован ДОКС в монотерапии - стандарт лечения РМЖ кошек [5-10]. Мыши контрольных групп получали физиологический раствор в адекватном объеме и режимах. Оценка эффективности лечения. У всех мышей после окончания лечения определяли размеры опухоли с помощью электронного измерителя и рассчитывали объем по формуле V=a • b • c. После чего определяли V в каждой группе и стандартный показатель эффективности торможение роста опухоли ТРО^М-V^ • 100%, где Vо и V - величина V„D в опыте и контроле. В качестве минимального критерия эффективности принимали ТРО > 50% длительностью не менее недели. По уменьшению размера опухолевого узла относительно предыдущего обЪема регистрировали регрессию. В опыте с 3-кратным курсом ГЕМЦ дополнительно определяли стандартный показатель увеличения продолжительности жизни УПЖ=СПЖо-СПЖк/СПЖк • 100%, а также число полных ремиссий (ПР). ПР считали отсутствие признаков опухолевого роста в месте трансплантации в течение 60 дней. Методика патоморфологического исследования опухоли По 5 мышей с развившимися опухолями умерщвляли на 20-е сутки после трансплантации (11-е сутки после лечения для соответствующих групп), опухоли извлекали, фиксировали в 10% нейтральном формалине и заключали в парафин. Затем на микротоме готовили срезы толщиной 8-10 мк, которые окрашивали гематоксилином и эозином, просматривали и фотографировали в световом микроскопе «Поливар» (Австрия). На срезах оценивали число клеток с признаками апоптоза, число митозов и площадь некрозов. Соотношение морфологических признаков пролиферации и гибели клеток определяли как степень лечебного патоморфоза (ЛП). Для градации ЛП по степени выраженности использовались, помимо перечисленных количественных показателей, визуальные качественные критерии: степень полиморфизма клеток и степень развития склероза соответствовала требованиям ветеринарной практики для данной патологии. Оценка переносимости воздействия. Проведена по состоянию и поведению мышей в процессе эксперимента, следили за гибелью от токсичности. Статистическая обработка результатов. Результаты исследования подвергнуты статистической обработке путем расчета критерия Фишера с помощью компьютерных программ Бхсс1 2013 и Бхсс1 для Windows 2007. Значимыми считали различия при p<0,05. Расчетные статистические величины приведены в таблицах. Завершение экспериментов. Павших или умерщвленных мышей с соблюдением гуманных методов подвергали аутопсии для выявления визуальных патологических изменений внутренних органов [3, 4]. Результаты и обсуждение Эффективность комбинации ДОКС + однократный ГЕМЦ Показано, что Са755 после трансплантации мышам BDF1 находится в экспоненциальной фазе роста до 13 сут с увеличением объема более чем в 6 раз, переходя затем в стационарную фазу роста. На 9-е сутки роста опухоль достигает среднего объема 595,5 мм3 (n=50). Эффективность комбинации ДОКС + ГЕМЦ с однократным введением препаратов на 9-й день роста Са755 при стартовом среднем 44 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ Эффективность комбинации ДОКС + ГЕМЦ на запущенной аденокарциноме молочной железы мышей Са755 Таблица 1 Группа Однократная доза, мг/кг Средний объем опухоли (в мм3), сутки после трансплантации опухоли Сутки после лечения ТРО% Регр. 9-е* 13-е 17-е 23-и** 4-е 8-е 14-е 8 КРО 0,5 мл 626 3857 6431 8849 - - - 0/10 (522-730) (3239-4475) (5559-7303) (7703-9995) ДОКС + 7,5 50 633 301 560 1312 92*** 91*** 85 7/10 ГЕМЦ (585-681) (206-396) (307-813) ДОКС + 7,5 100 540 239 242 1078 94*** 96*** 88 8/10 ГЕМЦ (461-619) (198-280) (121-369) ДОКС + 7,5 200 583 140 148 698 96*** 98*** 92 8/10 ГЕМЦ (533-633) (98-212) (51-245) Примечание: * - Vcp 595,5 ± 166,7 мм3 ; ** - в леченых группах большой разброс показателя; *** - различия с группой КРО достоверны, р < 0,05. объеме опухоли от 540 до 633 мм3 показана в табл. 1. Видно, что комбинация с использованием ГЕМЦ в однократных дозах 50-200 мг/кг высокоэффективна и в течение 8 дней после окончания лечения достоверно ингибирует рост опухолей. На 4-е и 8-е сутки наблюдения в леченых группах средний объем опухолей уменьшался более чем наполовину пропорционально величине примененной дозы ГЕМЦ. В эти сроки ТРО 91-98% (p<0,05), а на 8-е сутки у 80% мышей отмечена регрессия опухолей. К 14-му дню ингибирующее действие снижалось по числу регрессий до нуля, а по ингибированию - до ТРО 85-92% с увеличением вариабельности объема опухолей, исключающей оценку достоверности различий с контролем, несмотря на n=10. Патоморфологическая верификация эффективности Показано, что Са755 без лечения (рис. 1) имеет строение дольковой аденокарциномы на большем протяжении, в отдельных участках встречаются разрастания рака, имеющие протоковое строение или смешанное протоково-дольковое. Опухолевые клетки полиморфны, различного размера, чаще крупные, образуют в участках долькового рака солидные разрастания, в участках протоково-железистые структуры, Рис. 1. Са755 без лечения. 20-е сутки после трансплантации мышам самкам BDF1. а - участок долькового рака солидного строения. Видно несколько клеток с признаками апоптоза и клетки в состоянии митоза. Опухолевые клетки полиморфные. *200; б - опухоль имеет смешанное дольково-протоковое строение. Опухолевые клетки образуют солидные скопления и протоки. Опухолевые клетки полиморфные, между их скоплениями располагаются тонкие прослойки соединительнотканных. Некоторые клетки с признаками дистрофии, апоптоза и в состоянии некроза. *200; в - участки опухоли протокового строения, состоящие из железисто-подобных структур. Видны полнокровные сосуды. *100; г - обширный участок некроза опухолевой ткани. Видны сохранившиеся небольшие очаги опухоли, сосуды полнокровны. *100. 45 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2015 Рис. 2. Са755. 20-е сутки после трансплантации, 11-е сутки после лечения ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 50 мг/кг. а - опухолевые клетки образуют протоковые структуры, видны единичные митозы, некоторые клетки с признаками апоптоза. *200; б - неправильной формы очаг некроза. Сохранившийся участок опухоли долькового строения с отдельными протокового типа структурами. *100. Рис 3. Са755. 20-е сутки после трансплантации, 11-е сутки после лечения ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 100 мг/кг. а - опухолевые клетки образуют солидные скопления и протоковые структуры. Видны единичный митоз и несколько клеток в состоянии апоптоза. Часть клеток имеет мономорфное строение. *200; б - обширный участок разрастания соединительной ткани. Сохранившиеся опухолевые клетки мономорфны. *200; в - участок некроза опухолевой ткани, окруженный сохранившимися клетками, преимущественно мономорфного строения. *200. которые встречаются и в солидных разрастаниях. Количество митозов в так называемых горячих точках (местах их наибольшего образования) колеблется в пределах 1-1,5%. Опухолевые клетки с признаками апоптоза в виде скоплений хроматина. На месте расположения ядер встречаются в пределах 0,1- 0,3%. В участках и долькового, и протокового рака имеются неправильной формы различного размера некрозы, занимающие до 10-15% площади среза. Строма в опухоли развита слабо. В результате комбинированного лечения по схеме ДОКС + ГЕМЦ 50 мг/кг (рис. 2, а, б) видно, что количество митозов в «горячих точках» составляет 0,5-0,8%. Явления апоптоза обнаружены в 0,2-0,6% клеток. Участки некроза занимают 9-10% площади среза. Строма в опухоли развита умеренно. ЛП выражен слабо, степень I. Под влиянием комбинированной химиотерапии по схеме ДОКС + ГЕМЦ 100 мг/кг (рис. 3, а-в) число митозов уменьшилось до 0,3-0,5%. Клетки с признаками апоптоза составляют 0,5-0,8%. Участки некроза занимают 10-12% среза. Строма в опухоли развита умеренно. ЛП выражен также умеренно, степень II. В группе, получившей лечение по схеме ДОКС + ГЕМЦ 200 мг/кг (рис. 4, а-г), в опухоли развиты явления склероза в виде различного размера участков соединительной ткани, расположенных среди скоплений опухолевых клеток. Количество митозов в «горячих точках» не превышает 0,2-0,5% от общего числа клеток. Клетки с признаками апоптоза составляют 1-1,5%. Некроз Таблица 2 Результаты морфологического исследования Са755 после комбинированной химиотерапии ДОКС + ГЕМЦ в диапазоне доз Группа Митоз, Апоптоз, Некроз, Степень % % % полиморфизм клеток развитие склероза ЛП КРО 1,0-1,5 0,1-0,3 10-15 +++ + - ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 50 мг/кг 0,5-0,8 0,2-0,6 8-10 +++ ++ 1 ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 100 мг/кг 0,3-0,5 0,5-0,8 10-12 ++ +++ 2 ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 200 мг/кг 0,2-0,5 1,0-1,5 12-15 ++ +++ 2-3 46 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ Рис. 4. Са755. 20-е сутки после трансплантации, 11-е сутки после лечения ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 200 мг/кг а - опухоль имеет дольково-протоковое строение. В поле зрения имеются несколько клеток с признаками апоптоза (скопление в ядре хроматина). *200; б - опухолевые клетки крупные, преимущественно мономорфные, образуют протоковые структуры и солидные скопления. *400; в - обширные участки склероза. Небольшой очаг опухоли состоит из мономорфных клеток, образующих протоки. *200; г - участки некроза опухолевой ткани, часть прилежащих к некрозу опухолевых клеток сохранена, часто в состоянии дистрофии. *200. занимает 12-15% среза. ЛП выражен, степень II-III. Сравнительные анализ морфологических показателей ЛП в Са755 на 11-е сутки после комбинированной химиотерапии по схеме ДОКС + ГЕМЦ в диапазоне доз представлен в табл. 2. Из табл. 2 видно, что по сравнению с опухолью без лечения после применения комбинации ДОКС + ГЕМЦ на фоне уменьшения в 1,5 раза степени полиморфизма клеток и соответственно усиления процессов цитодифференцировки в 3-4 раза уменьшается число митозов и в 5-10 раз увеличивается количество клеток с признаками апоптоза. Поскольку терапия не оказала влияния на развитие некрозов, можно считать, что основное антипролиферативное действие комбинации связано с подавлением пролиферации и активацией апоптоза при инициации ци- тодифференцировки и развития процесса склероза в опухоли. Наблюдаемые изменения возрастали при увеличении дозы ГЕМЦ в комбинации. Проведенные на развившейся Са755 исследования позволили считать комбинацию более эффективной при дозах ГЕМЦ 100 и 200 мг/кг. С учетом удов- Таблица 3 Выживаемость мышей с аденокарциномой молочной железы Са755 при комбинированном лечении по схеме ДОКС + ГЕМЦ (3-кратный курс) Группа Длительность лече- Доза, мг/кг* ТРО max СПЖ, УПЖ, ПР, ния после трансплантации опухоли, сут разовая суммарная % сут % число КРО (физиологический раствор) 2, 9, 16 0,5 мл 1,5 мл - 17,2 ± 0,4 (n = 10) - 0/10 ДОКС + ГЕМЦ 2 (2, 9, 16) 7,5 (30, 30, 40) 100 100** 31,8 ± 7,8 (n = 10) 85** 0/10 ДОКС + ГЕМЦ 2 (2, 9, 16) 7,5 (70, 70, 60) 200 100** 45,3 ± 5,6 (n = 7) 163** 3/10 ДОКС 2 7,5 7,5 96** 31,7 ± 0,9 (n = 10) 84** 0/10 Примечание: * - Внутрибрюшинное введение; СПЖ - средняя продолжительность жизни; УПЖ - увеличение продолжительности жизни; ПР - полная ремиссия. ** -р < 0,05 от группе КРО. 47 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2015 летворительной переносимости лечения эти дозы использованы в качестве суммарных для 3-кратного курса ГЕМЦ при комбинированном лечении. Эффективность комбинации ДОКС + 3-кратный курс ГЕМЦ Результаты исследования демонстрирует табл. 3. Видно, что при СПЖ 17,2±0,4 дня в группе КРО комбинированное лечение с использованием ГЕМЦ в суммарной дозе 200 мг/кг существенно пролонгировало продолжительность жизни мышей с опухолями, УПЖ 163% против 84-85% (р<0,05) в других леченых группах. Полная ремиссия с отсутствием опухолевых узлов у 30% мышей достигнута также только при этой схеме. Соотношение доз препаратов в эффективной комбинации ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 200 мг/кг суммарно при 3-кратном курсе составило 26,6 мг/кг. Переносимость всех комбинаций была удовлетворительной. Заключение Доклиническое изучение комбинированной химиотерапии по схеме ДОКС + ГЕМЦ, ориентированной на предоперационное лечение РМЖ кошек, выполнено на перевиваемой аденокарциноме молочной железы мышей Са755 у мышей BDF1 в сравнении со стандартом лечения ДОКС. При развившейся Са755 Vcp 595,5 мм3 (моделирование предоперационного лечения) в качестве суммарных доз для 3-кратного курса ГЕМЦ в сочетании с ДОКС в однократной дозе 7,5 мг/кг отобраны дозы 100 или 200 мг/кг. Комбинированное лечение показало преимущество схемы ДОКС + ГЕМЦ в суммарной дозе 200 мг/кг (70, 70 и 60 мг/кг соответственно) перед другими лечеными группами по ингибирующему действию (ТРОтах 100% против 96%; число полных ремиссий 30% против 0%, УПЖ 163% против 84-85%). Лучший режим демонстрировал дозозависимый лечебный патомор- фоз II-III степени на фоне уменьшения в 1,5 раза степени полиморфизма клеток и усиления процессов цитодифференцировки, уменьшения в 3-4 раза числа митозов и увеличения в 5-10 раз числа клеток с признаками апоптоза. Сделано заключение о перспективности комбинации для проведения предоперационной комбинированной химиотерапии местно-распространенного рака молочной железы кошек по схеме доксорубицин+гемцитабин с сохранением дозового соотношения комбинантов и рекомендовать ее для клинической апробации при данной патологии.

About the authors

Elena M. Treshalina

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: treshalina@yandex.ru
MD, PhD, DSc, Prof. 115478, Moscow, Russian Federation

M. N Yakunina

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

M. O Antar

Veterinary clinic «Polar bear»

117042, Moscow, Russian Federation

Ju. A Borisova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

G. B Smirnova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

N. T Raichlin

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

References

Supplementary files