Preclinical results of gemcitabinebased regimens for preoperative chemotherapy of spontaneous feline breast cancer



Cite item

Abstract

Comparative preclinical study of chemotherapy regimen doxorubicin (DOX) + gemcitabine (GEM) for preoperative chemotherapy of spontaneous feline breast cancer and standard monochemotherapy with DOX alone was performed on transplantable murine mammary adenocarcinoma Ca55 in BDF1 hybrid mice model. The total GEM doses of 100 and 200 mg/kg for the triple course in combination with the single injection of 7.5 mg/kg of DOX were chosen to treat the established Ca755 tumor of 595.5 mm 3 average volume (preoperative treatment modeling). The combined chemotherapy showed an advantage of DOX + GEM regimen with GEM course dose of 200 mg/kg (70, 70 and 60 mg/kg, accordingly) as compared to other groups in terms of Tumor Growth Inhibition (TGI max=100% versus 96%; number of complete remissions (CR) 30% versus 0%, and enhanced Life Expectancy (LE) 163% versus 84-85%). The most effective regimen demonstrated dose-dependent therapeutic pathomorphism of grade II-III with 1.5-fold decrease of cell polymorphism and increase of cell differentiation. At the same time, the number of cells in mitosis decreased in 3-4 times and the number of apoptotic cells increased in 5-10 times. The results suggest that DOX + GEM combination with the unchanged components doses ratio has good potential for preoperative chemotherapy of locally advanced feline breast cancer and may be recommended for clinical study of this disease.

Full Text

Применение доксорубицина (ДОКС) при неоперабельном раке молочной железы (РМЖ) кошек в предоперационном периоде ограничено относительно низкой чувствительностью и дозолимитирующим побочным действием. В настоящей работе оценена возможность повышения эффективности лечения этой патологии путем использования схемы ДОКС + гемцитабин (ГЕМЦ), хорошо зарекомендовавшей себя при лечении РМЖ человека [1]. Цель исследования - доклиническая оценка эффективности комбинации ДОКС+ГЕМЦ для предоперационной химиотерапии РМЖ кошек. 43 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2015 Задачи: 1. Отработка оптимальных доз ГЕМЦ в комбинации с ДОКС. 2. Патоморфологический контроль эффективности комбинированной химиотерапии. 3. Сравнительная эффективность комбинированного лечения по схеме ДОКС + ГЕМЦ с монохимиотерапией ДОКС. Материал и методы Опухолевая модель. Использован штамм мышиной перевиваемой аденокарциномы молочной железы Ca755 (3-4-й пассаж) из коллекции РОНЦ. В соответствии с действующими в РФ рекомендациями трансплантацию опухоли выполняли мышам сам- кам-гибридам BDF1 под кожу бока по 50 мг опухолевой ткани в 0,5 мл питательной среды 199 [2]. Животные. В качестве доноров опухолевого материала использованы 10 особей мышей самок C57BL/6j, для проведения эксперимента - 70 особей гибридов BDF1 [C57BL/6j • DBA/2] массой тела 2021 г. Мышей получали из питомника «Столбовая» ГУ НЦ БМТ и содержали в отделе лабораторных животных ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» (РОНЦ) при обычном световом дне на экструзированном корме и постоянном доступе к воде. Перед началом опытов всех мышей с перевитыми опухолями распределяли по группам (n=10), одну группу оставляли без специфического лечения и использовали для контроля роста опухоли (КРО). Комбинанты Доксорубицин («Тева», Нидерланды), лиофилизат по 10 мг/фл вводили мышам однократно внутрибрюшинно в разовой дозе 7,5 мг/кг. Гемзар (Lilly, Франция), лиофилизат по 200 мг/фл вводили мышам внутрибрюшинно в двух режимах: 1) однократно в разовых дозах 50,100 и 200 мг/кг; 2) 3-кратно с интервалом 7 дней в суммарных дозах 100 и 200 мг/кг. Комбинированное лечение. На Са755 с относительно коротким периодом роста до гибели (максимально 19 дней после трансплантации) первичная оценка эффективности комбинации выполнена при развившейся опухоли (n=40) с V 595,5±166,7 мм3 на 9-е сутки после трансплантации. ГЕМЦ вводили внутрибрюшинно однократно в дозах 50, 100 и 200 мг/кг. Для проведения комбинированного лечения, аналогичного клинической схеме [4], ГЕМЦ вводили 3-кратным курсом на 2, 9 и 16-е сутки после трансплантации опухоли в разовых дозах 30, 30 и 40 мг/кг (суммарно 100 мг/кг) или в разовых дозах 70, 70 и 60 мг/кг (суммарно 200 мг/кг). ДОКС всегда вводили первым однократно внутрибрюшинно в оптимальной дозе 7,5 мг/кг. В качестве объекта сравнения использован ДОКС в монотерапии - стандарт лечения РМЖ кошек [5-10]. Мыши контрольных групп получали физиологический раствор в адекватном объеме и режимах. Оценка эффективности лечения. У всех мышей после окончания лечения определяли размеры опухоли с помощью электронного измерителя и рассчитывали объем по формуле V=a • b • c. После чего определяли V в каждой группе и стандартный показатель эффективности торможение роста опухоли ТРО^М-V^ • 100%, где Vо и V - величина V„D в опыте и контроле. В качестве минимального критерия эффективности принимали ТРО > 50% длительностью не менее недели. По уменьшению размера опухолевого узла относительно предыдущего обЪема регистрировали регрессию. В опыте с 3-кратным курсом ГЕМЦ дополнительно определяли стандартный показатель увеличения продолжительности жизни УПЖ=СПЖо-СПЖк/СПЖк • 100%, а также число полных ремиссий (ПР). ПР считали отсутствие признаков опухолевого роста в месте трансплантации в течение 60 дней. Методика патоморфологического исследования опухоли По 5 мышей с развившимися опухолями умерщвляли на 20-е сутки после трансплантации (11-е сутки после лечения для соответствующих групп), опухоли извлекали, фиксировали в 10% нейтральном формалине и заключали в парафин. Затем на микротоме готовили срезы толщиной 8-10 мк, которые окрашивали гематоксилином и эозином, просматривали и фотографировали в световом микроскопе «Поливар» (Австрия). На срезах оценивали число клеток с признаками апоптоза, число митозов и площадь некрозов. Соотношение морфологических признаков пролиферации и гибели клеток определяли как степень лечебного патоморфоза (ЛП). Для градации ЛП по степени выраженности использовались, помимо перечисленных количественных показателей, визуальные качественные критерии: степень полиморфизма клеток и степень развития склероза соответствовала требованиям ветеринарной практики для данной патологии. Оценка переносимости воздействия. Проведена по состоянию и поведению мышей в процессе эксперимента, следили за гибелью от токсичности. Статистическая обработка результатов. Результаты исследования подвергнуты статистической обработке путем расчета критерия Фишера с помощью компьютерных программ Бхсс1 2013 и Бхсс1 для Windows 2007. Значимыми считали различия при p<0,05. Расчетные статистические величины приведены в таблицах. Завершение экспериментов. Павших или умерщвленных мышей с соблюдением гуманных методов подвергали аутопсии для выявления визуальных патологических изменений внутренних органов [3, 4]. Результаты и обсуждение Эффективность комбинации ДОКС + однократный ГЕМЦ Показано, что Са755 после трансплантации мышам BDF1 находится в экспоненциальной фазе роста до 13 сут с увеличением объема более чем в 6 раз, переходя затем в стационарную фазу роста. На 9-е сутки роста опухоль достигает среднего объема 595,5 мм3 (n=50). Эффективность комбинации ДОКС + ГЕМЦ с однократным введением препаратов на 9-й день роста Са755 при стартовом среднем 44 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ Эффективность комбинации ДОКС + ГЕМЦ на запущенной аденокарциноме молочной железы мышей Са755 Таблица 1 Группа Однократная доза, мг/кг Средний объем опухоли (в мм3), сутки после трансплантации опухоли Сутки после лечения ТРО% Регр. 9-е* 13-е 17-е 23-и** 4-е 8-е 14-е 8 КРО 0,5 мл 626 3857 6431 8849 - - - 0/10 (522-730) (3239-4475) (5559-7303) (7703-9995) ДОКС + 7,5 50 633 301 560 1312 92*** 91*** 85 7/10 ГЕМЦ (585-681) (206-396) (307-813) ДОКС + 7,5 100 540 239 242 1078 94*** 96*** 88 8/10 ГЕМЦ (461-619) (198-280) (121-369) ДОКС + 7,5 200 583 140 148 698 96*** 98*** 92 8/10 ГЕМЦ (533-633) (98-212) (51-245) Примечание: * - Vcp 595,5 ± 166,7 мм3 ; ** - в леченых группах большой разброс показателя; *** - различия с группой КРО достоверны, р < 0,05. объеме опухоли от 540 до 633 мм3 показана в табл. 1. Видно, что комбинация с использованием ГЕМЦ в однократных дозах 50-200 мг/кг высокоэффективна и в течение 8 дней после окончания лечения достоверно ингибирует рост опухолей. На 4-е и 8-е сутки наблюдения в леченых группах средний объем опухолей уменьшался более чем наполовину пропорционально величине примененной дозы ГЕМЦ. В эти сроки ТРО 91-98% (p<0,05), а на 8-е сутки у 80% мышей отмечена регрессия опухолей. К 14-му дню ингибирующее действие снижалось по числу регрессий до нуля, а по ингибированию - до ТРО 85-92% с увеличением вариабельности объема опухолей, исключающей оценку достоверности различий с контролем, несмотря на n=10. Патоморфологическая верификация эффективности Показано, что Са755 без лечения (рис. 1) имеет строение дольковой аденокарциномы на большем протяжении, в отдельных участках встречаются разрастания рака, имеющие протоковое строение или смешанное протоково-дольковое. Опухолевые клетки полиморфны, различного размера, чаще крупные, образуют в участках долькового рака солидные разрастания, в участках протоково-железистые структуры, Рис. 1. Са755 без лечения. 20-е сутки после трансплантации мышам самкам BDF1. а - участок долькового рака солидного строения. Видно несколько клеток с признаками апоптоза и клетки в состоянии митоза. Опухолевые клетки полиморфные. *200; б - опухоль имеет смешанное дольково-протоковое строение. Опухолевые клетки образуют солидные скопления и протоки. Опухолевые клетки полиморфные, между их скоплениями располагаются тонкие прослойки соединительнотканных. Некоторые клетки с признаками дистрофии, апоптоза и в состоянии некроза. *200; в - участки опухоли протокового строения, состоящие из железисто-подобных структур. Видны полнокровные сосуды. *100; г - обширный участок некроза опухолевой ткани. Видны сохранившиеся небольшие очаги опухоли, сосуды полнокровны. *100. 45 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2015 Рис. 2. Са755. 20-е сутки после трансплантации, 11-е сутки после лечения ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 50 мг/кг. а - опухолевые клетки образуют протоковые структуры, видны единичные митозы, некоторые клетки с признаками апоптоза. *200; б - неправильной формы очаг некроза. Сохранившийся участок опухоли долькового строения с отдельными протокового типа структурами. *100. Рис 3. Са755. 20-е сутки после трансплантации, 11-е сутки после лечения ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 100 мг/кг. а - опухолевые клетки образуют солидные скопления и протоковые структуры. Видны единичный митоз и несколько клеток в состоянии апоптоза. Часть клеток имеет мономорфное строение. *200; б - обширный участок разрастания соединительной ткани. Сохранившиеся опухолевые клетки мономорфны. *200; в - участок некроза опухолевой ткани, окруженный сохранившимися клетками, преимущественно мономорфного строения. *200. которые встречаются и в солидных разрастаниях. Количество митозов в так называемых горячих точках (местах их наибольшего образования) колеблется в пределах 1-1,5%. Опухолевые клетки с признаками апоптоза в виде скоплений хроматина. На месте расположения ядер встречаются в пределах 0,1- 0,3%. В участках и долькового, и протокового рака имеются неправильной формы различного размера некрозы, занимающие до 10-15% площади среза. Строма в опухоли развита слабо. В результате комбинированного лечения по схеме ДОКС + ГЕМЦ 50 мг/кг (рис. 2, а, б) видно, что количество митозов в «горячих точках» составляет 0,5-0,8%. Явления апоптоза обнаружены в 0,2-0,6% клеток. Участки некроза занимают 9-10% площади среза. Строма в опухоли развита умеренно. ЛП выражен слабо, степень I. Под влиянием комбинированной химиотерапии по схеме ДОКС + ГЕМЦ 100 мг/кг (рис. 3, а-в) число митозов уменьшилось до 0,3-0,5%. Клетки с признаками апоптоза составляют 0,5-0,8%. Участки некроза занимают 10-12% среза. Строма в опухоли развита умеренно. ЛП выражен также умеренно, степень II. В группе, получившей лечение по схеме ДОКС + ГЕМЦ 200 мг/кг (рис. 4, а-г), в опухоли развиты явления склероза в виде различного размера участков соединительной ткани, расположенных среди скоплений опухолевых клеток. Количество митозов в «горячих точках» не превышает 0,2-0,5% от общего числа клеток. Клетки с признаками апоптоза составляют 1-1,5%. Некроз Таблица 2 Результаты морфологического исследования Са755 после комбинированной химиотерапии ДОКС + ГЕМЦ в диапазоне доз Группа Митоз, Апоптоз, Некроз, Степень % % % полиморфизм клеток развитие склероза ЛП КРО 1,0-1,5 0,1-0,3 10-15 +++ + - ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 50 мг/кг 0,5-0,8 0,2-0,6 8-10 +++ ++ 1 ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 100 мг/кг 0,3-0,5 0,5-0,8 10-12 ++ +++ 2 ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 200 мг/кг 0,2-0,5 1,0-1,5 12-15 ++ +++ 2-3 46 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ Рис. 4. Са755. 20-е сутки после трансплантации, 11-е сутки после лечения ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 200 мг/кг а - опухоль имеет дольково-протоковое строение. В поле зрения имеются несколько клеток с признаками апоптоза (скопление в ядре хроматина). *200; б - опухолевые клетки крупные, преимущественно мономорфные, образуют протоковые структуры и солидные скопления. *400; в - обширные участки склероза. Небольшой очаг опухоли состоит из мономорфных клеток, образующих протоки. *200; г - участки некроза опухолевой ткани, часть прилежащих к некрозу опухолевых клеток сохранена, часто в состоянии дистрофии. *200. занимает 12-15% среза. ЛП выражен, степень II-III. Сравнительные анализ морфологических показателей ЛП в Са755 на 11-е сутки после комбинированной химиотерапии по схеме ДОКС + ГЕМЦ в диапазоне доз представлен в табл. 2. Из табл. 2 видно, что по сравнению с опухолью без лечения после применения комбинации ДОКС + ГЕМЦ на фоне уменьшения в 1,5 раза степени полиморфизма клеток и соответственно усиления процессов цитодифференцировки в 3-4 раза уменьшается число митозов и в 5-10 раз увеличивается количество клеток с признаками апоптоза. Поскольку терапия не оказала влияния на развитие некрозов, можно считать, что основное антипролиферативное действие комбинации связано с подавлением пролиферации и активацией апоптоза при инициации ци- тодифференцировки и развития процесса склероза в опухоли. Наблюдаемые изменения возрастали при увеличении дозы ГЕМЦ в комбинации. Проведенные на развившейся Са755 исследования позволили считать комбинацию более эффективной при дозах ГЕМЦ 100 и 200 мг/кг. С учетом удов- Таблица 3 Выживаемость мышей с аденокарциномой молочной железы Са755 при комбинированном лечении по схеме ДОКС + ГЕМЦ (3-кратный курс) Группа Длительность лече- Доза, мг/кг* ТРО max СПЖ, УПЖ, ПР, ния после трансплантации опухоли, сут разовая суммарная % сут % число КРО (физиологический раствор) 2, 9, 16 0,5 мл 1,5 мл - 17,2 ± 0,4 (n = 10) - 0/10 ДОКС + ГЕМЦ 2 (2, 9, 16) 7,5 (30, 30, 40) 100 100** 31,8 ± 7,8 (n = 10) 85** 0/10 ДОКС + ГЕМЦ 2 (2, 9, 16) 7,5 (70, 70, 60) 200 100** 45,3 ± 5,6 (n = 7) 163** 3/10 ДОКС 2 7,5 7,5 96** 31,7 ± 0,9 (n = 10) 84** 0/10 Примечание: * - Внутрибрюшинное введение; СПЖ - средняя продолжительность жизни; УПЖ - увеличение продолжительности жизни; ПР - полная ремиссия. ** -р < 0,05 от группе КРО. 47 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 3, 2015 летворительной переносимости лечения эти дозы использованы в качестве суммарных для 3-кратного курса ГЕМЦ при комбинированном лечении. Эффективность комбинации ДОКС + 3-кратный курс ГЕМЦ Результаты исследования демонстрирует табл. 3. Видно, что при СПЖ 17,2±0,4 дня в группе КРО комбинированное лечение с использованием ГЕМЦ в суммарной дозе 200 мг/кг существенно пролонгировало продолжительность жизни мышей с опухолями, УПЖ 163% против 84-85% (р<0,05) в других леченых группах. Полная ремиссия с отсутствием опухолевых узлов у 30% мышей достигнута также только при этой схеме. Соотношение доз препаратов в эффективной комбинации ДОКС 7,5 мг/кг + ГЕМЦ 200 мг/кг суммарно при 3-кратном курсе составило 26,6 мг/кг. Переносимость всех комбинаций была удовлетворительной. Заключение Доклиническое изучение комбинированной химиотерапии по схеме ДОКС + ГЕМЦ, ориентированной на предоперационное лечение РМЖ кошек, выполнено на перевиваемой аденокарциноме молочной железы мышей Са755 у мышей BDF1 в сравнении со стандартом лечения ДОКС. При развившейся Са755 Vcp 595,5 мм3 (моделирование предоперационного лечения) в качестве суммарных доз для 3-кратного курса ГЕМЦ в сочетании с ДОКС в однократной дозе 7,5 мг/кг отобраны дозы 100 или 200 мг/кг. Комбинированное лечение показало преимущество схемы ДОКС + ГЕМЦ в суммарной дозе 200 мг/кг (70, 70 и 60 мг/кг соответственно) перед другими лечеными группами по ингибирующему действию (ТРОтах 100% против 96%; число полных ремиссий 30% против 0%, УПЖ 163% против 84-85%). Лучший режим демонстрировал дозозависимый лечебный патомор- фоз II-III степени на фоне уменьшения в 1,5 раза степени полиморфизма клеток и усиления процессов цитодифференцировки, уменьшения в 3-4 раза числа митозов и увеличения в 5-10 раз числа клеток с признаками апоптоза. Сделано заключение о перспективности комбинации для проведения предоперационной комбинированной химиотерапии местно-распространенного рака молочной железы кошек по схеме доксорубицин+гемцитабин с сохранением дозового соотношения комбинантов и рекомендовать ее для клинической апробации при данной патологии.
×

About the authors

Elena M. Treshalina

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: treshalina@yandex.ru
MD, PhD, DSc, Prof. 115478, Moscow, Russian Federation

M. N Yakunina

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

M. O Antar

Veterinary clinic «Polar bear»

117042, Moscow, Russian Federation

Ju. A Borisova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

G. B Smirnova

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

N. T Raichlin

N.N.Blokhin Russian Cancer Research Center

115478, Moscow, Russian Federation

References

  1. Переводчикова Н.И., Филоненко Д.В. Гемцитабин (Гемзар) в современной терапии рака молочной железы. В кн.: Гемзар и Алимта в лечении злокачественных опухолей / Под ред. М.Б. Бычкова. 2009: 78-106.
  2. Трещалина Е.М., Жукова О.С., Герасимова Г.К., Андронова Н.В., Гарин А.М. Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К.; 2012: 642-57.
  3. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. ЕЭС, Страсбург, 1985 г. Ланималогия. 1993; 1: 29.
  4. Большаков О.П., Незнанов Н.Г., Бабаханян Р.В. Доклинические и этические аспекты проведения исследований на биомоделях и на лабораторных животных. Качественная клиническая практика. 2002; 1: 58-61.
  5. Переводчикова Н.И., Горбунова В.А., ред. Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний. М.: Практическая медицина; 2015.
  6. Якунина М.Н., Трещалина Е.М. Анализ эффективности адъювантной химиотерапии доксорубицином спонтанного рака молочной железы собак и кошек. Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. 2009; 4: 23-7.
  7. Якунина М.Н. Таксотер и доксорубицин в предоперационной (неоадьювантной) химиотерапии первично-неоперабельного рака молочной железы кошек. Ветеринарная медицина. 2010; 5: 43-5.
  8. Якунина М.Н. Предварительные результаты изучения эффективности гемцитабина (гемзара) при диссеминированном раке молочной железы у животных. Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. 2011; 1: 23-4.
  9. Фомичева Д.В., Концевая С.Ю., Трещалина Е.М. Возможности адъювантной химиотерапии рака молочной железы у кошек. В кн.: Сборник тезисов четвертой Всероссийской конференции по вопросам онкологии и анестезиологии мелких домашних животных. М.: 2008; 27-31.
  10. Novosad C.A., Bergman P.J., O’Brien M.G. Retrospective evaluation of adjunctive doxorubicin for the treatment of feline mammary gland adenocarcinoma: 67 cases. J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 2006; 42 (2): 10-20.
  11. McNeill C.J., Sorenmo K.U., Shofer L. et al. Evaluation of adjuvant doxorubicin-based chemotherapy for the treatment of feline mammary carcinomа. J. Vet. Intern. Med. 2009; 23: 123-9.

Copyright (c) 2015 Eco-Vector



This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies