THE ROLE OF ALPHA-FETOPROTEIN RECEPTOR IN THE DELIVERY OF TARGETED PREPARATIONS IN ONCOLOGY

Full Text

Биологическая характеристика АФП Альфа-фетопротеин (АФП) - онкофетальный гликопротеин с молекулярной массой около 70 кД - широко исследован в 70-90-х гг. прошлого века. На уровне организма АФП - это многофункциональный белок с селективной клеточной стимулирующей и ингибирующей активностью. Это основной компонент эмбриональной сыворотки крови млекопитающих, который синтезируется висцеральной энтодермой желточного мешка и клетками эмбриональной печени. Сразу после рождения уровень АФП в сыворотке снижается на несколько порядков. Синтез АФП возобновляется при возникновении опухолей печени, а также герминогенных тератобластом и в меньшей степени - при химических и механических повреждениях печени, сопровождающихся регенерацией, например при остром вирусном гепатите. Изменение уровня АФП в сыворотке является важным диагностическим признаком опухолей печени и широко используется в клинической практике. АФП впервые выявлен при электрофорезе эмбриональной человеческой сыворотки в первом (альфа-1) положении после сывороточного альбумина [1]. В нормальной сыворотке взрослых людей этого белка не оказалось. В 1960 г. Г.И. Абелевым и соавт. в мышиной гепатоме обнаружен альфа-глобулин, отсутствующий в печени, крови и других тканях нормальных взрослых мышей. Оказалось, что этот белок является одним из основных компонентов мышиной эмбриональной сыворотки и, кроме того, выявляется во взрослой печени во время регенерации [2]. Ю.С. Татаринов показал (1964 г.), что эмбриоспецифический альфа-глобулин содержится в сыворотке больных с гепатоклеточной карциномой, позже это обнаружили у больных с тератобластомой Г.И. Абелев и соавт. (1967 г.). В последующие годы стало ясно, что белок, названный альфа-фетопротеином, является важным маркером для дифференциальной диагностики этих опухолей [3]. Известно, что в эмбриогенезе АФП синтезируется главным образом клетками печени и желточного мешка плода, из тканей которого проникает в амниотическую жидкость и через плаценту - в кровь матери. У здорового взрослого человека АФП может присутствовать в крови вследствие активизации каких-либо репаративных процессов и связанной с ними клеточной пролиферации [4-6]. Нормальный уровень АФП в сыворотке крови взрослых - 0-12 МЕ/мл. Высокие значения АФП определяются в крови плода и в амниотической жидкости, в крови беременных женщин после 12-15 нед беременности, а также при некоторых онкологических заболеваниях [7]. При первичной диагностике 95% онкобольных имеют патологический уровень АФП, у 68% из них - более 100 нг/мл и у 40% - более 10 000 нг/мл [8]. Заболеваемость вторичным (метастатическим) раком печени превышает заболеваемость первичным раком на 50%. Обычно метастазы в печень из других органов не вызывают патологического повышения АФП, и лишь около 7% таких больных имеют повышенные значения АФП, которые редко превышают 100 нг/мл. Кроме опухолей печени, АФП в сочетании с β-субъединицей хорионического гонадотропина человека (β-ХГЧ) и лактатдегидрогеназой (ЛДГ) включен в минимальный объем диагностических анализов при подозрении на опухоль пинеальной области в качестве опухолевого маркера [9]. При злокачественном процессе активация онкогенов, являющихся, по сути, в норме заблокированными эмбриональными генами, приводит к продукции эмбриональных форм ферментов, других белковых факторов, обеспечивающих аутокринную регуляцию роста, и пролиферации клеток. Экспрессия АФП злокачественными клетками - хороший пример такого механизма. Подобная активация синтеза АФП, очевидно, происходит и при физиологической регенерации. У взрослых людей без онкологических заболеваний фоновые значения АФП, по-видимому, объясняются именно репаративными процессами в организме. Однако бóльшая часть АФП при этом, вероятнее всего, быстро расходуется в тканях и не поступает в кровь [10]. При злокачественной патологии уровень АФП в организме увеличен в связи с пролиферацией клеток с эмбриональным фенотипом и экспрессией фетальных белков [11]. Особенно характерна гиперпродукция АФП для гепатоцеллюлярного рака и эмбрионально-клеточных опухолей, когда концентрация его может достигать десятков тысяч МЕ/мл. Многие растущие эмбриональные и неопластические клетки не только продуцируют, но и поглощают большое количество АФП [12]. АФП высокого уровня (норма - 15 нг/мл) давно включен в панель маркеров прогноза течения, эффективности лечения и рецидива опухоли при гепатоцеллюлярной карциноме (повышен у 90% пациентов), гепатобластоме, а также эмбрионально-клеточных опухолях яичка и яичников, плоскоклеточном раке пищевода и печени с метастазами [13]. В эмбриональных опухолях яичка или яичников АФП - наиболее характерный маркер, встречающийся в крови в подавляющем большинстве (более 80%) случаев. Эти опухоли сохраняют способность дифференцироваться в полноценные тканевые структуры, в том числе и в клетки желточного мешка, синтезирующие АФП при нормальном развитии. Таким образом, синтез АФП в этих опухолях имеет вполне логичное объяснение, четко подтвержденное экспериментально. В случае опухолей печени, развивающихся в самые первые годы жизни у детей, ситуация еще более простая, чем при эмбриональных опухолях. Детские опухоли (гепатобластомы) развиваются из клеток эмбриональной печени, являющихся самыми мощными продуцентами АФП в нормальном эмбрионе. Высокодифференцированные гепатомы - очень плохие продуценты АФП как по частоте его выявления, так и по уровню синтеза этого белка. И это закономерно, так как зрелые гепатоциты АФП не образуют вовсе. Наиболее характерен АФП при умеренно дифференцированных опухолях печени, обычно встречающихся у человека. Эти опухоли состоят из клеток, напоминающих клетки взрослой печени, не вырабатывающие в нормальных условиях АФП. Непонятно, почему они синтезируют его в опухоли. Второй труднообъяснимый факт - громадный разброс в уровнях АФП у отдельных больных, достигающий 100-1000-кратных различий, и это при одном и том же уровне дифференцировки опухолей. При этом всегда имеются клетки, продуцирующие и не продуцирующие АФП в одной и той же опухоли, возникшей из одной клетки-предшественницы. Образование АФП в опухолях печени «взрослого» типа не имеет пока точно установленной причины, но объяснить этот факт можно только исходя из данных по обратимости подавления синтеза АФП в зрелых гепатоцитах [10]. В опухолях, как известно, нарушаются межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия. Клетки как бы изолируются от печеночной балки, что ведет к снижению уровня их дифференцировки, включая и возобновление синтеза АФП. Таким образом, авторы полагают, что в основе реэкспрессии гена АФП в гепатомах «взрослого» типа лежит сдвиг равновесия в системе. Причинами его могут быть утрата опухолевой клеткой рецепторов к внеклеточному матриксу, дефектный матрикс и рост опухоли в условиях клеточного стресса, снижающего или полностью подавляющего синтез АФП. Каждая из этих возможных причин имеет экспериментальные обоснования или, вернее, аргументы в пользу ее реального существования. Так, трехмерный матрикс, организующий гепатоциты в культуре, не влияет на поведение клеток гепатомы. Очевидно, что либо они лишены рецепторов к матриксу, либо дефектна цепь, ведущая от рецептора к реагирующим внутриклеточным системам. Нарушение образования матрикса клетками, контактирующими с гепатоцитами, можно воспроизвести в культуре гепатоцитов и получить высокий уровень синтеза АФП [10]. Для продолжения описания биологических характеристик АФП целесообразно осветить распределение его в организме животных. Как было показано на интактных мышах, которым вводили АФП человека, меченный йодом-125, максимальное накопление метки происходит в основном через 5 ч после введения и сохраняется в печени, кишечнике и крови в течение по крайней мере 3 сут. В ткани опухоли, привитой мышам, уровень накопления АФП достигает 6% от введенного количества на 1 г ткани. Это не только определило органы-мишени для АФП, но и позволило предложить 125I-АФП в качестве радионуклидного маркера в радиодиагностических препаратах для обнаружения злокачественных новообразований, например, кроветворной системы, легких, головного мозга, мышц и почек [14, 15]. Давно известно, что биологическая роль АФП определяется также разнонаправленным и дискутабельным действием на иммунный статус: стимуляцией или супрессией синтеза цитокинов и различных эффекторов гомеостаза, в т. ч. определенных клонов специфических Т-хелперов и Т-супрессоров, натуральных киллеров, макрофагов, фибробластов, моноцитов [16, 17]. Регулирующее влияние АФП на синтез ряда факторов дополняется его синергизмом по отношению к некоторым из них [18]. Доказанные иммунные свойства АФП позволили зарегистрировать его как лекарственный препарат в комплексной терапии против аутоиммунных заболеваний (болезнь Хошимото, неспецифический язвенный колит), а также заболеваниий сосудов. Препарат применяют внутривенно (струйно - 5 мл/мин, капельно - 60-100 капель/мин) или внутримышечно. Перед применением все содержимое флакона растворяют в 0,9% растворе натрия хлорида для получения бесцветного и прозрачного раствора. Длительность лечения 14-30 дней. Побочные действия АФП известны и не отличаются от обычных реакций на белковые препараты (чувство жара у людей с повышенной чувствительностью; частичное покраснение кожи; аллергические реакции разного вида; обострение вируса герпеса). По антигенной структуре молекула АФП близка к молекуле сывороточного альбумина, но видоспецифическими являются только 2 из нескольких антигенных эпитопов, а остальные имеют перекрест с аналогами АФП одного или нескольких видов животных (мыши, крысы, теленка, свиньи, собаки, кошки). В молекуле АФП участок связывания со своим рецептором находится в третьем домене. Особенности метаболизма разных по происхождению клеток обусловливают различное представление ими структурных эпитопов АФП. С-концевой фрагмент АФП с 404-го по 595-й аминокислотный остаток (а. о.) полноразмерного белка был клонирован и продуцирован в клетках E. coli штамма BL21(DE3). Уровень продукции белка составил не менее 150 мг с 1 л культуры [19]. Рецепторы к АФП Рецепторно-опосредованный эндоцитоз - один из типов везикулярного транспорта, за открытие которого была вручена Нобелевская премия по медицине и физиологии 2013 г. Джеймсу Ротману (James E. Rothman), Рэнди Шекману (Randy W. Schekman) и Томасу Зюдхофу (Thomas C. Südhof) [20]. После этого открытия под новым углом зрения были рассмотрены возможности использования известного ранее контакта АФП с высокоаффинными АФП-рецепторами клеток-мишеней или клеток-экспортеров биологически активных веществ. Среди этих возможностей были не только предложения широко использовать АФП как диагностический маркер, но и поисковые исследования о создании нековалентных комплексов с АФП в качестве транспортного белка для ксенобиотиков, направленных на терапию заболеваний с повышенным уровнем белка [21, 22]. В связи с этим чрезвычайно важны исследования рецепторов к АФП (receptor for alpha-fetoprotein, ReCAF), представляющих собой АФП-связывающий трансмембранный гликопротеин, встроенный в поверхностную мембрану. Впервые предположение о существовании специфического ReCAF было сделано R. Moro в 1981 г. для объяснения поглощения АФП растущими клетками по механизму рецепторно-опосредованного эндоцитоза [22]. В настоящее время о ReCAF при злокачественных новообразованиях известно достаточно много. Важно, например, что уровень антител к ReCAF в сыворотке крови онкобольных достоверно выше по сравнению с таковым у здоровых лиц. Этот факт получил подтверждение благодаря обнаруженному in vitro различию в накоплении АФП в культивируемых опухолевых и эмбриональных клетках и в здоровых, в т. ч. стимулированных in vitro лимфоцитах и моноцитах периферической крови человека [23]. Экспериментально показано, что АФП может взаимодействовать и связывать цитоплазматические белки, которые в норме эскортируют ядерные факторы или транскрипционные кофакторы к поверхности органелл клеток. Имеющиеся на поверхности мембран ReCAF служат для связывания ядерных факторов или иных кофакторов/ингибиторов [24, 25]. Рецепторно-опосредованный эндоцитоз комплексов с АФП в клетку проанализирован с помощью электронной микроскопии. Показано, что ковалентно связанные конъюгаты АФП с пероксидазой хрена (последняя использована для визуализации АФП) в процессе эндоцитоза сначала обнаруживаются в клатриновых везикулах, затем в эндосомах и складчатых мембранах центральной области аппарата Гольджи, в то время как яичный альбумин после интернализации (степень его интернализации очень низка) обнаруживался в лизосомах. После интернализации основная часть АФП не подвергается деградации и вновь выделяется в экстраклеточную среду, т. е. происходит рециклирование АФП [26, 27]. Данные об уровне и характере экспрессии ReCAF в клетках опухолей человека в сравнении с экспрессией этого белка в нормальных тканях весьма ограниченны и противоречивы [28]. Доказанный рецепторно-опосредованный контакт с высокоаффинными ReCAF и последующий эндоцитоз АФП в клетки-мишени или клетки-экспортеры биологически активных веществ позволили использовать АФП как диагностический маркер, а также в качестве транспортного белка для создания нековалентных комплексов с ксенобиотиками для терапии заболеваний с повышенным уровнем АФП [29-30]. Необходимым инструментом для проведения таких исследований являются моноклональные антитела (МКА, или monoclonal antibodies (англ.), MAbs, MCA), которые в полном размере или в виде фрагментов предложены в качестве векторных молекул для создания методов направленной терапии и новых методов диагностики опухолей. Для иммуногистохимических исследований ReCAF отобран клон 2В8, так как МКА связываются именно с этим АФП-узнающим сайтом [31]. В качестве векторов в терапевтических комплексах с АФП рассматриваются МКА к ReCAF или к определенным его эпитопам. Известные в настоящее время данные позволили сформулировать представление о ReCAF как об универсальном онкофетальном белке и опухолевом маркере [32]. Терапевтические комплексы с АФП Возможность создания для векторов биологически активных веществ на основе онкофетальных белков и факторов роста физиологических лигандов и соответствующих рецепторов определяется относительно высокой плотностью рецепторов к ним на опухолевых клетках. Общим недостатком таких иммуноконъюгатов является то, что их повторное введение может спровоцировать иммунные реакции организма. АФП считается одним из наиболее перспективных векторов для цитотоксических препаратов, так как он специ-фически связывается и эндоцитируется опухолевыми клетками, в то время как уровень его рецепторов на нормальных клетках человека очень низок [26]. Комплексы с АФП можно отнести к участникам активного транспорта лекарственных веществ с использованием высокоспецифичных механизмов, основанных на взаимодействии лиганда-вектора, входящего в состав системы, с рецепторами на поверхности опухолевых клеток. Особенно интересны исследования по созданию иммунотерапевтических комплексов не только с АФП, но и МКА к определенным его эпитопам. Комплексы, в которых конъюгированные части соединены лабильной пептидной связью, описаны как избирательно действующие на опухолевые клетки-мишени [26]. В качестве вектора адресной доставки цитостатических соединений или групп в комплексах используются АФП различного происхождения, в т. ч. из эмбриональных тканей человека или из крови и амниотической жидкости свиных эмбрионов. Известно несколько высокоэффективных методик выделения и ренатурации АФП [33, 34]. В терапевтических комплексах с АФП или МКА адресность доставки цитостатика направлена на улучшение его биодоступности к опухолевым клеткам и реализует запуск апоптоза через митохондриальный путь, но может снизить цитотоксический потенциал агента и/или расширить спектр побочных эффектов, например, образуя комплекс с каким-либо тератогеном эмбриональной токсичности [35, 36]. Причиной этого помимо недостаточной презентации рецепторов на клетках опухолей может быть то, что существенную часть общего пула АФП мало- и среднепродуцирующих АФП опухолей составляет не раковый, а физиологический АФП, синтезирующийся в результате работы гомеостатического механизма, а злокачественные клетки способны поглощать его, снижая концентрацию в кровотоке [37]. Как следствие образуются комплексы с биологически активными лигандами нормальных тканей-мишеней, например, полиненасыщенными жирными кислотами, билирубином, лектинами и некоторыми стероидными гормонами, что является причиной развития нежелательных побочных эффектов [5, 38, 39]. Попытки целенаправленной доставки к злокачественным клеткам цитостатиков, цитотоксинов и гормонов с помощью АФП достаточно широко представлены [26, 40-43]. В этих работах рассмотрены комплексы АФП с полиненасыщенной кислотой ристицином, цитотоксинами в виде противолейкозного антибиотика калихеамицина и фрагмента А дифтерийного токсина азиалофетнина, цитостатическим конъюгатом эстрон-доксорубицином. На примере последнего показано, что комплекс АФП-эстроген лишает эстроген-чувствительные ткани, такие как матка новорожденных мышей, чувствительности к свободному эстрогену [44]. Анализ биологической активности различных комплексов с АФП, по мнению Г.И. Абелева, не позволяет однозначно считать, специфичны ли рецепторы АФП именно для этого белка или они взаимодействуют с АФП как лектины, обладая более или менее широкой специфичностью к различным гликопротеинам. В большинстве работ в качестве контроля на специфичность связывания АФП используется сывороточный альбумин, не являющийся гликопротеином. Исследования терапевтических комплексов с АФП в последние годы интенсифицировались, а их результаты имеют не только практическое, но и фундаментальное значение. Например, показана возможность получения терапевтических комплексов на основе гормонов с фрагментами АФП [45]. Причиной этого является тот факт, что апробированные биотехнологические методы получения полноразмерной молекулы АФП в прокариотических системах экспрессии имеют недостаточно высокий выход из-за низкой эффективности ренатурации белка, экспрессируемого в составе бактериальных телец включения. Для прохождения ренатурации молекулы АФП необходимо правильное образование 16 дисульфидных связей. Для фолдинга С-концевого фрагмента АФП (рАФП3д) необходимо формирование 6 дисульфидных связей. Н.В. Гороховец и соавт. предположили, что ренатурация рАФП3д (с 404-го по 609-й аминокислотный остаток) будет более эффективной, и доказали это [28]. С использованием рАФП3д в качестве векторного белка получены конъюгаты векторного белка с цисплатином, полимерными наночастицами PLGA-НЧ из сополимеров молочной и гликолевой кислот, глутарового альдегида, аконитового ангидрида и диальдегиддекстрана с включенными противоопухолевыми цитостатиками паклитакселом (НЧ-ПАК-рАФП3д) и доцетакселом (НЧ-ДОЦ-рАФП3д), обладающими относительно высокой цитотоксичностью для клеток опухоли и значительно менее токсичными для лимфоцитов in vitro, а для последнего отмечена некоторая активность in vivo [46]. Среди возможных механизмов антипролиферативной активности АФП в комплексах в отношении опухолевых и нормальных тканей помимо описанного выше запуска апоптоза в митохондриях обсуждаются независимая от CD95, TNFR1 и TNFR2 активация каспаза-3-подобных протеаз, регуляция цитохром С-связанной каспазной активности и образование апоптосомного комплекса [47-50]. Рассматривается также влияние АФП-содержа-щих агентов на активность участников провоспалительного ответа кератиноцитов, отдельные популяции которых инициируют имплантацию циркулирующих опухолевых клеток в ткани-мишени, т. е. процесс метастазирования [51]. АФП в трансформации и прогрессии опухолей Одно из общепринятых положений онкологии гласит, что опухоль сохраняет направление и уровень дифференцировки клетки-предшественницы. Это позволяет рассматривать совместно характеристики нормальных и соответствующих опухолевых тканей, продуцирующих АФП. Далее рассмотрим отдельные виды опухолей. Эмбрионально-клеточные опухоли (ЭК) и опухоли желточного мешка (ОЖМ) ЭК и близкородственная ей опухоль тератокарцинома (ТК) представляют собой злокачественные гомологи эмбриональной ткани (ЭК) или эмбриональной ткани с элементами более или менее дифференцированных тканей (ТК). Предшественниками ЭК являются клетки зародышевого эпителия, чаще всего относящиеся к пре- или постмейотической стадии дифференцировки (между I и II мейотическими делениями). Эти клетки относятся к полипотентным стволовым эмбриональным клеткам, способным, как и их нормальные предшественники, к самой разнообразной дифференцировке. Собственно ЭК состоят из аналогов эмбриональных клеток, в то время как ТК включают очаги дифференцировки в гомогенную ткань ЭК. Только часть потомства стволовых клеток ЭК - всегда менее половины - проходит дифференцировку, остальные воспроизводятся на уровне материнских клеток. Таким образом, стволовые клетки ЭК и ТК являются аналогами ранних эмбриональных клеток, способными к дифференцировке в различные зрелые ткани. В нормальном развитии эмбриона АФП синтезируется висцеральной энтодермой желточного мешка (ВЭЖМ). Один из первых продуктов дифференцировки в эмбрионе, как уже говорилось выше, - ВЭЖМ. В процессе прогрессии опухоли может произойти дополнительная трансформация предшественника ВЭЖМ. В этом случае на основе ЭК или ТК возникает новая опухоль желточного мешка (ОЖМ), очаги дифференцировки в которой будут аналогами ВЭЖМ. Если новая опухоль опередит в скорости роста исходную, то она вытеснит свою предшественницу и будет существовать как «чистая» форма. При действии эмбрионального индуктора - ретиноевой кислоты (РК) на ЭК или ТК обычно возникают структуры, аналогичные ВЭЖМ. Структура, аналогичная ВЭЖМ, в ЭК или ТК сохраняет способность к синтезу сывороточных белков, включая прежде всего АФП. Это очень убедительно показано иммуногистохимически, а также путем определения белков человеческой сыворотки, секретируемых ВЭЖМ внутрь эмбриоидных телец или в кистозную жидкость при росте человеческой ОЖМ на мышах nude. Следует отметить, что АФП является доминирующим компонентом среди сывороточных белков, синтезируемых нормальной или опухолевой ВЭЖМ. В обоих случаях профиль его связывания с лектинами характерен именно для эмбриональной формы АФП - очень низкое связывание с конканавалином А (КонА) в отличие от АФП печеночного происхождения, большая часть которого связывается с КонА [52]. В редких случаях ТК образует АФП, характерный для печени. При этом в ней обнаруживаются очаги дифференцировки типа фетальной печени. В 80-90% случаев ЭК, ТК или ОЖМ сопровождаются повышенными уровнями АФП в крови, что высокоспецифично в дифференциальной диагностике этих опухолей с семиномами, дисгерминомами или стромальными опухолями яичка или яичника [53, 54]. Добавочный серологический маркер ЭК и ТК - хорионический гонадотропин, продуцируемый аналогами трофобласта, часто развивающимися в этих опухолях. Определение обоих маркеров очень информативно и повсеместно используется как для первичной диагностики этих опухолей, так и для оценки эффективности их лечения. Указанные опухоли хорошо поддаются лечению при сочетании радикальной операции с последующей химиотерапией цисплатином [55]. Другие опухоли яичка и яичников - семинома, опухоли стромальных клеток или клеток Сертоли - всегда четко отрицательны по АФП [56]. Таким образом, АФП в сочетании с хорионическим гонадотропином практически строго специфичен для ЭК, ТК или ОЖМ как в диагностике, так и в мониторинге. Гепатобластомы (ГБ) ГБ четко отличаются от гепатоцеллюлярных карцином (ГЦР) «взрослого» типа и являются характерными опухолями у детей младшего возраста. ГБ состоят из клеток, соответствующих по морфологии и физиологии фетальным гепатоцитам с высоким ядерно-цитоплазматическим отношением, выраженной базофилией и слабо развитым эндоплазматическим ретикулумом. Иногда ГБ содержат очаги гемопоэза и даже остеогенеза. В клиническом отношении ГБ менее злокачественны, чем ГЦР, и лучше поддаются хирургическому лечению. Поскольку ГБ представляет собой «злокачественный аналог» фетальной печени, можно ожидать высокой продукции АФП. Действительно, эти опухоли сопровождаются АФП с самой высокой частотой (до 90% случаев) и с наивысшими его уровнями [56]. Более того, в иммуногистохимических исследованиях установлено, что большинство клеток ГБ содержат АФП. Таким образом, АФП является превосходным сывороточным маркером ГБ человека как при ее первичной диагностике, так и при оценке эффективности лечения. Однако мышиная перевиваемая ГБ полностью лишена способности синтезировать АФП. Гепатоцеллюлярная карцинома Проблема продукции АФП гепатоцеллюлярными карциномами наименее понятна. Скорее всего здесь существует несколько причин, соответствующих различным ситуациям возобновления его синтеза при неопухолевой патологии. Бесспорных корреляций между синтезом АФП и определенным гистологическим типом опухоли не выявлено. Обнаружена некоторая зависимость синтеза от уровня дифференцировки опухоли. Так, высокодифференцированные карциномы, как правило, не содержат АФП. Анапластические ГЦР также имеют тенденцию к снижению частоты АФП-положительных случаев. Наибольшая частота и наивысшие уровни АФП отмечены при умеренно дифференцированных ГЦР. Эта закономерность неоднократно установлена для опухолей животных и человека, но ничего более специфичного не найдено. Низкая продукция АФП высокодифференцированными ГЦР не является неожиданностью. Здесь может действовать тот же механизм подавления экспрессии его гена, что и во «взрослой» печени. Более того, хирургическое повреждение высокодифференцированного опухолевого «АФП-отрицательного» узелка ведет к реэкспрессии АФП в клетках, окружающих зону некроза - воспаления [57]. Авторы заключают, что в высокодифференцированных опухолях действует тот же механизм, что и в нормальной «взрослой» печени, и в нем оперируют те же положительные и отрицательные трансфакторы. Высказывается также предположение о том, что большинство АФП-продуцирующих опухолей содержит частичный или полный набор печеночно-специфических положительных трансфакторов, определяющих экспрессию АФП в ГЦР вместе с другими сывороточными белками. Указанные авторы считают, что именно поэтому ГЦР ассоциируется с АФП, и не исключают другие параллели между регуляцией АФП в нормальной печени и в ГЦР. С другой стороны, авторы считают доказанным, что межклеточные или матрикс-клеточные взаимодействия являются теми «нормальными» факторами, которые участвуют в регуляции АФП и в умеренно дифференцированных гепатомах. Интересной признана эксплантация в культуру суспензии АФП-отрицательных опухолевых клеток, диссоциированных коллагеназой, для доказательства выработки ими АФП наподобие нормальной печени. Не исключают также, что факторы, определяющие синтез АФП в опухолях, случайно утрачивают продукцию трансфактора, подавляющего транскрипцию гена АФП. Причиной реэкспрессии АФП может быть и выпадение гипотетического рецептора, участвующего в межклеточных и матрикс-клеточных взаимодействиях. Интересное наблюдение было сделано на низкодифференцированной гепатоме MRH 7777, поддерживаемой in vitro и активно продуцирующей АФП. Практически все гепатомные клетки синтезируют АФП. Однако из нее были получены «оппозитные» клоны, состоящие из 100% «АФП-положительных» и 100% «АФП-отрицательных» клонов. Каких-либо биологических различий между клонами не отмечено. Наиболее интересной особенностью этих клонов была необычно высокая «переключаемость» составляющих их клеток на противоположный по экспрессии АФП тип, достигающая частоты 1:100. Очевидно, что контроль синтеза АФП в этой системе осуществляется на эпигенетическом уровне [58]. Суммируя приведенные выше данные и соображения, можно заключить, что имеются различные пути, приводящие к реэкспрессии АФП в опухолях печени: контроль синтеза АФП в высокодифференцированных и, возможно, в части умеренно дифференцированных гепатом, осуществляемый на основе межклеточных и матрикс-клеточных взаимодействий, утрата определенных звеньев этого контроля (гипотетических рецепторов), случайное выпадение «негативных» трансфакторов, оперирующих в транскрипции АФП-гена, и нарушения в эпигенетическом контроле синтеза АФП. Очевидно, что вопрос нуждается в дальнейшем изучении. В противоположность причинам реэкспрессии АФП в ГЦР клинические аспекты проблемы изучены практически исчерпывающе [56]. «АФП+» при ГЦР встречается приблизительно в 75-80% случаев при нормальном фоне 40-50 нг/мл. Эта частота существенно выше у детей (до 90%) и юношей (79%) по сравнению со взрослыми пациентами (66%). Наиболее вероятно, что это связано с преобладанием у юных пациентов носительства вируса гепатита В по сравнению со взрослыми, у которых ГЦР чаще сопровождает цирроз [59]. Некоторые колебания процента «АФП+» случаев при ГЦР отмечены в разных районах мира - частота минимальна в странах Северной Америки и Западной Европы и максимальна в районах, «эндемичных» по ГЦР, - Южной и Западной Африке и Юго-Восточной Азии [56]. Эти различия определяются скорее всего резко различным возрастом пациентов с ГЦР в «эндемичных» районах и районах с низкой частотой ГЦР. Мониторинг лечения ГЦР по уровням АФП в крови приобретает все большее значение по мере прогресса в области хирургического (пересадка печени) и химиотерапевтического (локальная перфузия печени) лечения этой ранее почти неизлечимой опухоли. Главная трудность в диагностике ГЦР по АФП - перекрывание ГЦР и циррозов печени при уровне АФП 50-500 нг/мл. Известно, что в этом случае необходимы повторные исследования, выявляющие волнообразную динамику при циррозах и постоянный рост при ГЦР. Другой путь для дифференцировки ГЦР и циррозов по АФП - исследование профиля взаимодействия АФП с лектинами, особенно с лектином из Lens culinaris. Форма АФП, характерная для ГЦР, содержит лишь малую фракцию, реагирующую с указанным лектином, а АФП циррозного происхождения связывается с ним почти полностью. Различный профиль связывания с лектином имеет АФП при ГЦР и метастазах опухолей желудочно-кишечного тракта в печени. Рецепторы АФП в опухолевых моделях Опухолевые модели, экспрессирующие рецепторы, известны давно. Это, например, клетки Т-клеточной лимфомы [60] и крысиной гепатомы Морриса 777 [61]. Исследование презентации ReCAF с помощью МКА к рецепторам АФП клона 2В8 позволило обнаружить другие модели опухолей человека, например, аденокарциному молочной железы MCF-7 и карциному яичников SCOV-3. Более того, в этом исследовании показано, что в чувствительных опухолях рецепторов АФП меньше, а скорость рецепторно-опосредованного эндоцитоза ниже, чем в соответствующих опухолях с множественной лекарственной устойчивостью (аденокарцинома молочной железы MCF-7 против MCF-7/Adr и карцинома яичников SCOV-3 против SKVLB) [64]. Некоторые модели с экспрессией ReCAF приведены в исследованиях [3, 63-65]. С помощью сцинтиграфической визуализации опухолей мышей (молочной железы и нейробластомы) посредством 131I-альфа-фетопротеина и получения положительных сцинтиграфических изображений выявлена экспрессия захвата АФП с прямым доказательством экспрессии ReCAF на других опухолях грызунов и человека. Это рабдомиосаркома крысы [66], рак молочной железы мыши и человека [3, 64, 67, 68], T-лимфомы мыши [62], T- и B-клеточная лимфомы человека [69, 70], линия моноцитных клеток злокачественного новообразования U-937 [71] и линия T-клеток рака толстой кишки человека НТ-29 [72]. Экспрессия ReCAF описана также в клетках прогностически значимой модели мышиного лимфолейкоза Р-388, использованной в опытах по изучению комплексов АФП и экстрактивных цитотоксинов (бетулиновой кислоты и атрактилозида) [34, 73]. При изучении взаимодействия МКА к ReCAF описаны Т-клеточная лимфома человека Jurkat и культура клеток мышиного лимфолейкоза Р-388. Модель Р-388 изучалась также и в других исследованиях [74]. Среди охарактеризованных количественно по экспрессии ReCAF известны следующие линии клеток: рак шейки матки HeLa с экспрессий 2,6 × 104 рецепторов на клетку при константе диссоциации kd = 1,2 × 10-7 М, Т-клеточная лимфома Jurcat с экспрессией 5,8 × 104 рецепторов на клетку при константе диссоциации kd = 8,9 × 10-6 М, лимфома Беркитта Raji с экспрессией 4,2 × 104 рецепторов на клетку при константе диссоциации kd = 4,8 × 10-7 М, гепатома HepG2 с экспрессий 5,4 × 104 рецепторов на клетку при константе диссоциации kd = 4,9 × 10-7 М, рак молочной железы MCF7 с экспрессией 3,1 × 104 рецепторов на клетку при константе диссоциации kd = 3 × 10-6 М и рак яичников SKOV3 с экспрессией 4,4 × 104 рецепторов на клетку при константе диссоциации kd = 4 × 10-7 М [75]. В качестве доклинических моделей для исследований in vivo предложены 3 штамма подкожных ксенографтов рака печени человека, содержащих АФП [76]. Описание этих штаммов приведено ниже. Рак печени 2 (РПеч-2) Штамм получен из культуры клеточной линии 143 рака печени человека. Первая имплантация: 12.12.1985 г. двум бестимусным мышам введено по 5 × 106 клеток линии 143. Через 20 дней у них появились плотные опухолевые узелки, первая перевивка была сделана через 1,5 мес после инокуляции клеточной линии. Перевивки опухоли: на бестимусных мышах или крысах подкожно с интервалом 12-14 дней. Гибель мышей отмечена на 35-й день после инокуляции. Проведен 31 пассаж. Гистология: при первичной трансплантации бестимусным мышам клеточной культуры линии рака печени человека и при дальнейшем серийном пассировании в опухолях наблюдалась картина резко анаплазированного низкодифференцированного рака. В 6-м пассаже видна картина гепатоцеллюлярного рака с выраженной анаплазией и атипией клеток. Отмечено значительное число атипичных митозов, наличие известковых конкреций в соединительнотканных прослойках и мелких очагов некроза. На позднем, 31-м пассаже наблюдаются ячейки и тяжи умеренно полиморфных атипичных эпителиальных клеток, разделенных нежной стромой. При трансплантации штамма РПеч-2 (1-й и 6-й мышиные пассажи) бестимусным крысам в опухоли выявляется картина гепатоцеллюлярного рака с очагами некроза и мелкими кальцификатами. На 6-м пассаже у крыс опухоль имеет строение гепатоцеллюлярного рака, местами со значительной атипией клеток. Отмечена высокая митотическая активность. Маркеры: обнаружены гормональные рецепторы человека только к эстрогенам (14,0). Рак печени 3 (РПеч-3) Штамм получен из культуры клеточной линии 3PIC/HRF/5 рака печени человека. Первая имплантация: 27.11.1984 г. 2 бестимусным мышам инокулировано по 5 × 106 клеток линии 3PIC/HRF/5. Через 7 дн у них появились плотные опухолевые узелки, через 15 - сделана первая перевивка. Перевивки опухоли: на бестимусных мышах подкожно с интервалом 12-14 дн. Гибель мышей зафиксирована на 17-20-й день после инокуляции. Проведено 33 пассажа. Гистология: при первичной трансплантации бестимусным мышам культуры клеточной линии 3PIC/HRF/5 рака печени человека развилась гепатома. В дальнейшем ткань опухоли (1-й и 2-й пассажи) имела солидное строение и состояла из кубических полигональных и нескольких вытянутых клеток с пузырьковидным ядром и 1-3 четкими нуклеолами. В цитоплазме части клеток было выявлено PAS+ вещество, отмечались небольшие некрозы и поля кровоизлияний. При дальнейшем пассировании (4-м и 5-м) в опухоли был виден солидно-трабекулярный печеночный рак. Встречались небольшие очаги некроза. Клеточный состав отличался еще большим полиморфизмом, чем при самых первых пассажах. Наблюдались очаги ангиоматоза. В более поздних пассажах (10-м и 14-м) наблюдался печеночно-клеточный рак солидного строения с формированием обильных щелевидных полостей, частично выстланных кубическим эпителием. Отмечалась высокая митотическая активность. Видны кровоизлияния и некрозы. При трансплантации штамма РПеч-3 (10-й мышиный пассаж) бестимусным крысам в опухоли сохранялась картина трабекулярно-солидного строения. Рак печени Hep G2 Культура клеток Hep G2 рака печени человека, адаптированная к росту у иммунодефицитных мышей. Первая имплантация: 21.04.2005 г. восьми бестимусным мышам инокулировано 1,5 × 107 клеток линии Hep G2. Через 10-13 дней у них появились плотные опухолевые узелки. Гибель мышей отмечена на 40-53-й день после инокуляции. Динамика роста опухоли: на 1-м пассаже у 100% бестимусных мышей пальпируемая опухоль появилась на 13-й день после трансплантации (латентная фаза роста). Измеряемая опухоль объемом (a × b × c) 38 мм3 появилась на 15-й день (V0), к 21-му дню прирост опухоли составил 3,3 раза (экспоненциальная фаза роста), к 25-му дню прирост опухоли уменьшился до 1,4 раза и на 29-й день составил 1,3 раза (стационарная фаза роста). Заключение Анализ тематической литературы за период 1956-2015 гг. посвящен рецепторам к эмбриональным белкам, в т. ч. к АФП, известным в медицине как онкомаркеры и использующимся злокачественными клетками для организации опухолевого гомеостаза путем улучшения питания и регуляции прогрессивного роста. АФП является специальным белком-переносчиком жизненно важных молекул, например, омега-3 полиненасыщенных жирных кислот. Он захватывает эти молекулы в свой пространственный «гидрофобный карман» и целенаправленно проносит внутрь клетки. Этот белок иногда называют эмбриональным альбумином, так как он выполняет транспортные функции, аналогичные тем, которые выполняет альбумин в крови взрослого человека. Считается, что некоторые тератогены связываются с АФП и таким образом попадают в кровь и клетки эмбриона. Это предположение легло в основу множества научных разработок, нацеленных на создание способов «адресной» доставки веществ в заданную клетку. В онкологии функции АФП эссенциально определены его природой. Как широко распространенный карциноэмбриональный антиген он манифестирует наличие злокачественной опухоли, но не определяет тип новообразования. Продукция АФП в опухолевых моделях и экспрессия рецепторов избирательно повышены в злокачественных опухолях человека. Проникновение АФП в клетку - строго регулируемый процесс рецепторно-опосредованного эндоцитоза, осуществляемый через специальные мембранные рецепторы к АФП (ReCAF) с высокой избирательностью в отношении злокачественных клеток различного генеза. До 90% всех злокачественных клеток человека и моделей опухолей человека и млекопитающих экспрессируют рецепторы к АФП, включая сравнительно недавно открытые стволовые опухолевые клетки - наиболее вероятный источник метастазирования. Гиперпродукция АФП и гиперэкспрессия ReCAF связаны с гистологическим типом опухолевой модели и характерны для эмбрионально-клеточных опухолей и гепатобластом с исходно низкой лекарственной чувствительностью или с лекарственной устойчивостью. При выборе модели следует учитывать, что в разных типах опухолевых клеток ReCAF имеют специфические особенности при культивировании, которые не проявляются в условиях животного организма. При этом для более дифференцированных опухолей характерен больший уровень продукции АФП и гиперэкспрессия ReCAF. Использование подкожных ксенографтов опухолей человека сигнальных для АФП локализаций с гиперэкспрессией рецепторов позволяет наиболее доказательно выявить эффективность терапевтической системы на доклиническом уровне. Адресная доставка терапевтических систем, созданных на основе АФП или его фрагментов, способна вызвать изменение их фармакологических свойств. Терапевтический выигрыш возможен за счет индукции процесса апоптоза митохондриальным путем, но при этом возможно снижение цитотоксического потенциала системы.

About the authors

H. M Treshalina

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: treshalina@yandex.ru
Moscow, 115478, Russian Federation

G. B Smirnova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

S. A Tsurkan

LLC «PSC «PharmAccess»

Moscow, 127322, Russian Federation

J. R Tcherkassova

LLC «PSC «PharmAccess»

Moscow, 127322, Russian Federation

N. A Lesnaya

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

References

Supplementary files