Effect of hyperthermia on the viability and proliferative activity of tumor cells

Full Text

Канцероматоз брюшины развивается на фоне прогрессирования целого ряда опухолей брюшной локализации Эффективность системного лечения этой категории пациентов лимитирована плохим проникновением противоопухолевых средств в серозные полости. За прошлые два десятилетия появились новые подходы к лечению перитонеального канцероматоза, объединенные общим названием «циторедуктивные операции в сочетании с интраперитонеальной химиотерапией с гипертермией». Многие авторы рассматривают данное лечение как стандартное при псевдо- миксоме брюшины, мезотелиоме, интраперитонеально диссеминированном раке яичников, однако вопрос относительно эффективности данного подхода все еще остается спорным [1-3]. Идея гипертермического воздействия основана на следующих постулатах: 1) создание высокой концентрации цитостатиков в области опухолевого процесса; 2) уменьшение системной токсичности; 3) модификация действия цитостатиков при сочетанном использовании гипертермии [4]. Средние значения температуры раствора для перфузии брюшной полости, используемые различными авторами, колеблются в пределах 40-45°С [5-7]. Поэтому остается нерешенным один из основных вопросов при использовании внутрибрюшинной гипертермии - определение оптимального температурного режима, который бы обладал наибольшей опухолевой цитотоксичностью, при минимально возможном числе осложнений. Поэтому целью настоящей работы было изучение влияния различных режимов гипертермии на физиологическую активность перевиваемых линий опухолевых и нетрансформированных клеток при имплантации мышам. Материал и методы Перевиваемые линии опухолевых клеток: К-562 (эритромиелоидный лейкоз человека), MCF-7 (рак молочной железы человека), SCOV3 (рак яичников человека); ^трансформированных клеток VERO (клетки почки зеленой африканской мартышки), КСТ (клетки эндотелия сосудов теленка) и ЛЭК (клетки легкого эмбриона коровы) и клетки опухоли Эрлиха (рак молочной железы мышей) были получены из банка клеточных линий ФГБУ «РОНЦ шздрава России. Клетки культивировали в полной культуральной среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки, глютамина и пенициллин-стрептомицина. Тестируемые клетки (1 млн) помещали в стерильные пробирки на 2 ч на водяную баню при температурах 41-50°С. В контрольной серии клетки инкубировали в тех же условиях при температуре 37°С. Затем суспензию клеток рассевали в 96-луночные микропланшеты и инкубировали в течение 1 сут в С02-инкубаторе при 37°С и 5% СО2. Процентное содержание физиологически активных клеток в культуре определяли с помощью МТТ-колориметрического теста через 24 и 48 ч. Оптическую плотность растворов измеряли при длине волны 540 нм на спектрофотометре Multiskan-(Labsystems). Для испытания на мышах линии C57B1 суспензию клеток опухоли Эрлиха в питательной среде RPMI-1640 прогревали в течение 2 ч при температуре 41-50°С (в контрольной серии - при 37°С). Подсчитывали количество живых клеток с использованием трипанового синего. Затем их концентрировали центрифугированием. Мышам клетки вводили подкожно по 500 000 кл/мышь или внутрибрюшинно по 1 500 000 кл/мышь. Животным контрольных групп вводили физиологический раствор хлорида натрия. Результат учитывали по изменению объема видимой опухоли и массы тела подопытных животных. Статистическую обработку данных проводили с использованием t-критерия Стьюдента, критерия Вилкоксона при помощи стандартного пакета статистических программ Windows 2003 (StatSoft 6.0). Результаты и обсуждение Проведенные в опытах in vitro исследования позволили установить, что достоверное, относительно контроля, уменьшение физиологически активных клеток в культуре опухолевых клеток наблюдали только после прогревания в течение 2 ч при температуре не ниже 44°С. При этом минимальный значимый эффект для линий клеток К-562 (< -29%), MCF-7 (< -34%) отмечали при воздействии температуры 44°С, а для линии клеток SCOV3 - при 46°С (< -38%). Аналогичный эффект для нетрансформированных клеток зарегистрирован при температуре, равной или превышающей 45°С для линий VERO (< -57%) и КСТ (< -57%) и 48°С для линии клеток ЛЭК (< -38%) (табл. 1). ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ -□- Опухоль Эрлиха, 0 сут -•- Опухоль Эрлиха, 1 сут - --а - Опухоль Эрлиха, 4 сут Рис. 1. Индекс жизнеспособности (ИЖ) и пролиферативная активность клеток опухоли Эрлиха при гипертемии относительно контроля при 37°С (0 сут). Статистически достоверное угнетение пролиферативной активности клеток (р < 0,01) через 2 сут после гипертермического воздействия отмечено в образцах, подвергавшихся действию режимов 44°С (опухолевые клетки) и 45°С (нетрансформированные эмбриональные клетки). Достоверное снижение жизнеспособности клеток опухоли Эрлиха отмечали при нагревании до 43°С. При 45°С регистрировали гибель около 50% клеток. При этом пролиферативный потенциал клеток, подвергнутых гипертермии, сохранялся вплоть до 46°С (рис. 1). При исследовании динамики роста опухоли у мышей установлено, что у животных с привитыми клетками опухоли Эрлиха, подвергнутыми предварительному температурному воздействию при 42 и 43°С, отмечалась тенденция к уменьшению объема опухолевых узлов по сравнению с животными контрольной группы. Отсутствие опухолевого роста зарегистрировано только при имплантации мышам опухолевых клеток при температуре 44°С. Прогревание опухолевых клеток при температуре 41°С не влияло на рост опухолевого узла (рис. 2). Заключение Анализ воздействия гипертермии на физиологическую активность перевиваемых линий опухолевых и ^трансформированных клеток in vitro и in vivo продемонстрировал, что с увеличением уровня и времени температурного воздействия повышается степень повреждения и возникает гибель опухолевых клеток. В данном исследовании наиболее эффективным был следующий режим: температура выше 45°С с экспозицией более 2 ч, что на практике трудно осуществимо в связи с ограниченной толерантностью здоровых тканей. Таким образом, высокотемпературное воздействие достоверно подавляет способность опухолевых клеток к пролиферации только при температуре не менее 44°С. Температурные режимы, рекомендованные для клинической 0 37 °С Ц 41 °С 0 42 °С 0 43 °С Рис. 2. Динамика роста опухоли Эрлиха после предварительного прогревания при подкожном введении (медианные значения). практики (41-43°С), не оказывают существенного влияния на жизнеспособность опухолевых клеток. В опытах на мышах с привитой опухолью Эрлиха установлено, что отсутствие опухолевого роста наблюдалось только при предварительном прогревании клеток при температуре 44°С. Таким образом, при использовании гипертермии в монорежиме не представляется возможным достичь эффективных воздействующих температурных уровней, которые могли бы оказать значимое ингибирующее влияние на опухолевые клетки. Поэтому необходимо исследовать сочетанные режимы гипертермии с химиопрепаратами и иммуномодуляторами, стимулирующими врожденное звено противоопухолевого иммунитета. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

About the authors

N. Yu Anisimova

Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

M. V Kiselevskiy

Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

Amir G. Abdullaev

Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: amirdo@mail.ru
MD, PhD, Senior researcher of the Thoracic Department of the Research Institute of Clinical Oncology Moscow, 115478, Russian Federation

N. V Malakhova

Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

S. M Sitdikova

Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

B. E Polotskiy

Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

M. M Davydov

Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

References

Supplementary files