Gender differences in the function of thyroid gland in the dynamics of the growth of transplantable B16/F10 melanoma in mice

Full Text

Меланома - это метаболически активная гетерогенная опухоль, нейроэктодермального происхождения, развивающаяся из меланоцитов, расположенных преимущественно в коже [1]. В экспериментальных [2-4] и клинических исследованиях [5, 6] показано, что меланоциты производят классические нейротрансмиттеры, нейропептиды, гормоны, факторы роста, а также являются клетками-мишенями для гормонов периферических эндокринных органов. Щитовидная железа, один из важнейших органов ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ нейроэндокринной системы, является биорегулятором практически всех основных клеточных и тканевых процессов, таких как энергетический баланс, липидный и углеводный обмен [7, 8], деятельность сердечно-сосудистой системы [9]. Тиреоидные гормоны (ТГ) являются транскрипционными факторами практически для всех клеток организма [10], регулируя пролиферацию, ангиогенез и миграцию клеток [11]. Установлена способность ТГ регулировать динамику преобразования цитоскелета - ключ к структурам клеток, необходимый для миграции и взаимодействия с окружающими структурами [12]. Результатом широкого спектра влияния гормонов щитовидной железы становится изменение большого количества физиологических процессов при нарушении тиреоидного гомеостаза под влиянием развития различных патологий, в том числе при злокачественном росте. Экспериментальные исследования меланомы B16/ F10 дают возможность изучить на клеточном и тканевом уровнях основные изменения и поломки, возникающие в динамике роста опухоли. Изучение роста меланомы на экспериментальных животных позволяет проследить изменения эндокринно-метаболического статуса не только в периферической крови (что возможно при исследовании клинического материала), но и гормональные изменения непосредственно в эндокринных железах и тканях-мишенях. Целью работы явилось изучение функционирования щитовидной железы, а также исследование локального содержания ТГ в тканях-мишенях: коже, опухоли и перифокальной зоне у самцов и самок мышей линии C57BL/6 в динамике роста перевивной меланомы B16/F10. Материал и методы Исследования проводили на половозрелых самцах и самках мышей линии C57BL/6 (n = 80) массой 20-24 г. Животные получены из Научного центра биомедицинских технологий «Андреевка» ФМБА России (Московская область) и содержались при естественном освещении со свободным доступом к воде и пище. Случайным образом самцы и самки были разделены на опытные и контрольные группы по 8 особей в группе. Экспериментальная работа осуществлялась с соблюдением международных принципов Хельсинкской декларации о гуманном отношении к животным. Меланома B16/F10 перевивалась путем подкожного введения взвеси опухолевой ткани в физиологическом растворе (1:10) в правую заднюю лапу мыши по стандартной методике [13]. Культура клеток меланомы была представлена РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАН (Москва). Мышам контрольной группы провели подкожное введение физиологического раствора. Рост опухоли оценивали ежедневно, измеряя ее диаметр в трех взаимно перпендикулярных замерах. Через 1, 2, 3 и 4 нед эксперимента животных декапитировали, все процедуры проводили в соответствии с международными правилами работы с животными (European Communities Council Directive, 86/609/ЕЕС). Щитовидную железу, гипофизы, кожу, опухоль и перифокальную зону выделяли на льду и готовили 1% в случае щитовидной железы, 0,1% гипофизов и 10% в случае опухоли и окружающих ее тканей цитозольную фракцию на 0,1 М калий-фосфатном буфере, pH 7,4. Радиоиммунным методом (стандартные тест-наборы фирмы «Иммунотех», Чехия, анализатор «Ариан», Россия) исследовали в полученных гомогенатах уровень ТГ - общих форм тироксина - Т4 и трийодтиро- нина - Т3 и свободных форм - FT4 и FT3, а также тиреотропный гормон (ТТГ). Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программной системы Statistica for Windows (версия 10.0). В таблицах результаты представлены в виде M ± m, где M - выборочное среднее, m - ошибка среднего. Достоверность различий показателей в сравниваемых группах оценивали по непараметрическому £/-критерию Манна-Уитни. Результаты Насыщенность щитовидной железы общими и свободными формами ТГ, а также гипофизарным и локальным ТТГ в динамике роста меланомы B16/ F10 сравнивали у самцов и самок с данными в соответствующих контрольных группах - у интактных животных (табл. 1). Опухоль после перевивки появлялась у самок и самцов на 10-й день. Через 1 нед эксперимента у самок с перевитой опухолью (см. табл. 1) установлена гиперактивность щитовидной железы, которая выражалась в повышении общих форм гормона: Т4 в 1,3 раза, Т3 - в 1,6 раза, а также свободной формы трийодтиронина FT3 в 1,6 раза на фоне сниженного в 2,1 раза уровня ТТГ по сравнению с показателями в ткани щитовидной железы у интактных животных. Через 2 нед эксперимента у самок установлены следующие изменения насыщенности ткани щитовидной железы: уровень Т4 не отличался от контроля, однако концентрация его активной свободной формы резко снизилась - в 3,7 раза, в результате чего установлено снижение Т3 в 1,7 раза и FT3 в 4 раза по сравнению с показателями у интактных животных. По сравнению с предыдущим сроком исследования выявлены достоверные снижение FT4 в 4 раза и Т3 и FT3 в 2,7 и 6,3 раза соответственно. При этом не установлено изменения концентрации ТТГ, которая оставалась в 2 раза ниже нормы. Через 3 нед эксперимента все параметры тиреоидной группы за исключением Т4, у самок оказались снижены в 1,6-4,7 раза по сравнению с нормой, однако достоверных изменений по сравнению с предыдущим сроком исследований не установлено. Через 4 нед эксперимента у всех самок зафиксированы нормальные концентрации общих форм ТГ как тироксина, так и трийодтиронина, но не восстановление уровня свободных форм, которые оставались сниженными в 4,7-5 раз. Концентрация ТТГ выросла в 1,4 раза по сравнению с предыдущим сроком исследования, но не достигла нормы, оставаясь достоверно в 1,4 раза сниженной по сравнению с таковой в контрольной группе. Исследование уровня ТТГ непосредственно в ткани гипофиза мышей в динамике роста меланомы показало нарастание данного гормона у самок в 1,3-1,4 раза через 1-2 нед перевивки опухоли и нормализацию к 3-4 нед. У самцов изменения насыщенности щитовидной железы ТГ в динамике роста меланомы B16/F10 оказались иными по сравнению с самками (см. табл. 1). Через 1 нед эксперимента на фоне нормального уровня общего тироксина и повышенной в 1,7 раза его свободной формы концентрация трийодтиронина в щитовидной железе оказалась ниже показателей в контрольной группе в 3,2 раза, что впрочем не сказалось на FT3, концентрация которой превышала норму в 2,1 BASIC RESEARCH - PRACTICAL MEDICINE Таблица 1 Уровень гормонов тиреоидной группы в ткани щитовидной железы и ТТГ в гипофизе у самок и самцов мышей линии C57BL/6 в динамике роста перевивной меланомы B16 Мыши Т4, нмоль на 1 г ткани Т3, нмоль на 1 г ткани FI4, пмоль на 1 г ткани FI3, пмоль на 1 г ткани ТТГ, мМЕ на 1 г ткани щитовидная железа ТТГ, мМЕ на 1 г ткани гипофиз Самки Интактные 3,88 ± 0,2 0,35 ± 0,03 3,02 ± 0,25 0,84 ± 0,06 0,1 ± 0,007 31,5 ± 2,1 Опытные: 1-я неделя 5,1 ± 0,43* 0,56 ± 0,04* 3,27 ± 0,27 1,32 ± 0,09* 0,047 ± 0,002* 43,5 ± 2,8* 2-я неделя 4,61 ± 0,31 0,21 ± 0,01* ** 0,82 ± 0,06* ** 0,21 ± 0,01* ** 0,045 ± 0,003* 47 ± 3,5* 3-я неделя 4,5 ± 0,28 0,22 ± 0,02* 0,69 ± 0,04* 0,18 ± 0,01* 0,05 ± 0,003* 28 ± 1,9** 4-я неделя 4,12 ± 0,37 0,31 ± 0,02** 0,61 ± 0,03* 0,18 ± 0,01* 0,07 ± 0,004* ** 26 ± 2,0 Самцы Интактные 1,85 ± 0,15 0,16 ± 0,01 3,03 ± 0,25 1,54 ± 0,11 0,05 ± 0,003 26 ± 1,9 Опытные: 1-я неделя 2,17 ± 0,18 0,05 ± 0,003* 5,2 ± 0,35* 3,16 ± 0,24* 0,05 ± 0,003 52,5 ± 4,1* 2-я неделя 0,05 ± 0,003* ** 0,006 ± 0,0003* ** 2,28 ± 0,18* ** 0,87 ± 0,05* ** 0,076 ± 0,004* ** 54 ± 3,9* 3-я неделя 1,96 ± 0,14** 0,015 ± 0,001* ** 4,67 ± 0,37* ** 1,03 ± 0,09* 0,047 ± 0,003** 53 ± 3,2* 4-я неделя 1,24 ± 0,10* ** 0,045 ± 0,003* ** 1,99 ± 0,14* ** 0,47 ± 0,02* ** 0,062 ± 0,004** 48,5 ± 4,1* Примечание. * -достоверные отличия от интактных животных; ** -достоверные отличия от предыдущего срока исследования (р < 0,05-0,01). раза. Уровень ТТГ в щитовидной железе оставался в норме через 1 нед. После «выхода» опухоли, через 2 нед эксперимента установлено максимальное снижение уровня общих форм ТГ в ткани щитовидной железы: Т4 в 37 раз, а Т3 в 26,7 раза по сравнению с показателями в интактной ткани. Существенный дефицит общих форм вызвал снижение свободных форм, однако не такое существенное: FT4 в 1,3 раза и FT3 в 1,8 раза, при этом несколько вырос уровень ТТГ - в 1,5 раза. Через 3 нед эксперимента насыщенность щитовидной железы тироксином восстановилась до нормы, а его свободная форма даже выросла в 1,5 раза, однако уровень общей формы Т3 хотя и повысился в 2,5 раза по сравнению с показателями прошлого исследования, но полностью не восстановился, оставаясь сниженным в 10,7 раза по сравнению с нормой. Оставалась сниженной в 1,5 раза и его свободная форма. Уровень ТТГ снизился в 1,6 раза по сравнению с показателями предыдущего срока исследования, не отличаясь при этом от значений у интактных животных. На 4-й неделе эксперимента у самцов отмечена глубокая гипофункция щитовидной железы, выражающаяся в снижении как общих, так и свободных форм ТГ при тенденции к повышению значений ТТГ: Т4 снизился в 1,5 раза, Т3 в 3,6 раза, FT4 в 1,5 раза и FT3 в 3,3 раза. При этом у самцов на протяжении всего эксперимента уровень ТТГ в гипофизе превышал норму в 1,9-2 раза. В последнее время появились данные о том, что воздействие ТГ на плазматическую мембрану клеток-мишеней запускает клеточную пролиферацию и неоангиогенез непосредственно в клетках эндотелия и опухолей [14]. В связи с этим представляло интерес исследовать уровень ТГ в коже, опухоли и перифокальной зоне в динамике роста меланомы B16/F10 (табл. 2). Таблица 2 Уровень Т3 и Т4 в коже, опухоли и перифокальной зоне у самцов и самок в динамике роста меланомы B16/F10 Мыши Т4, нмоль на 1 г ткани Т3, нмоль на 1 г ткани Самцы Интактные, кожа 1,6 ± 0,09 0,04 ± 0,002 Опытные: 1-я неделя, кожа 1,6 ± 0,10 0,035 ± 0,002 2-я неделя, опухоль 5,5 ± 0,42* 0,06 ± 0,004* ** 2-я неделя, п/зона 1,69 ± 0,12 0,033 ± 0,002 3-я неделя, опухоль 7,2 ± 0,51* ** 0,06 ± 0,005* 3-я неделя, п/зона 1,7 ± 0,12 0,05 ± 0,004 4-я неделя. опухоль 12,5 ± 0,9* ** 0,07 ± 0,005* 4-я неделя,п/зона 1,63 ± 0,13 0,06 ± 0,003* Самки Интактные, кожа 1,45 ± 0,12 0,053 ± 0,003 Опытные: 1-я неделя, кожа 1,36 ± 0,11 0,053 ± 0,004 2-я неделя, опухоль 1,49 ± 0,12 0,06 ± 0,004 2-я неделя, п/зона 1,32 ± 0,10 0,053 ± 0,005 3-я неделя, опухоль 1,49 ± 0,11 0,063 ± 0,005 3-я неделя, п/зона 1,14 ± 0,09 0,05 ± 0,004 4-я неделя, опухоль 0,96 ± 0,07* ** 0,067 ± 0,005 4-я неделя, п/зона 1,29 ± 0,10 0,06 ± 0,005 Примечание: * - достоверные отличия от интактных животных; ** -достоверные отличия от предыдущего срока исследования (р < 0,05-0,01) ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ В результате исследований у самок не обнаружены достоверные изменения уровня Т3 и Т4 в коже, опухоли и перифокальной зоне на протяжении всего эксперимента за исключением 4-й недели, когда концентрация тироксина в опухоли снизилась в 1,5 раза по сравнению с интактной кожей. У самцов, напротив, установлено прогрессивное повышение уровня тироксина в опухоли через 2, 3 и 4 нед: в 3,4; 4,5 и 7,8 раза по сравнению с интактной кожей. Следует отметить, что на каждом последующем этапе исследования концентрация Т4 в опухоли достоверно повышалась по сравнению с предыдущим - в 1,3 и 1,7 раза через 3 и 4 нед. Обсуждение При исследовании уровня ТГ в ткани щитовидной железы, коже, опухоли и перифокальной зоне у мышей в динамике роста меланомы B16/F10 установлены половые различия (см. табл. 1, 2). У самок после перевивки меланомы до «выхода опухоли» выявлен гипертиреоз, возможно, как стрессорная реакция организма на развитие злокачественного процесса, а затем на протяжении всего эксперимента гипотиреоз различного происхождения, обусловленный снижением активности дейодиназы или/и усилением захвата свободных форм гормона белками. При этом локальный уровень ТТГ в щитовидной железе оставался сниженным, а в гипофизе повышался только через 1-2 нед, демонстрируя отсутствие реакции регулирующих систем на изменения в функционировании органа. ТТГ является не только маркером состояния тиреоидной оси, но и индикатором системы гипоталамус-гипофиз [15]. Полученные результаты указывают на наличие у самок мышей в динамике роста меланомы B16/F10 начиная со 2-й недели эксперимента синдрома низкого содержания гормонов щитовидной железы, так называемого low T3/low T4, диагностируемого по уровню свободных фракций гормонов [9]. При этом синдроме часто нарушены корреляционные связи уровня периферических гормонов и ТТГ, что и имело место в настоящем эксперименте. В человеческом сообществе патология щитовидной железы у женщин выявляется в 3-10 раз чаще, чем у мужчин [16]. В то же время существуют данные о возможном влиянии изменений активности щитовидной железы на репродуктивную функцию у мужчин [17]. В литературе имеется разноречивое мнение о роли гипо- и гипертиреоза в риске возникновения злокачественных опухолей. Одни авторы указывают на увеличение риска возникновения злокачественных опухолей яичников и молочной железы на 45-80% у больных гипертиреозом [18], при этом гипотиреоз не ассоциирован с увеличением рака молочной железы [19]. Другие, напротив, отмечают частые проявления гипотиреоза при росте злокачественных опухолей [20, 21]. Ряд авторов утверждают, что гормоны щитовидной железы, а не лютеинизирующий гормон играют важную роль в развитии и дифференцировке клеток Лейдига [22]. Кроме того, ряд исследователей указывают на более высокую продукцию половых стероидов и ССГ при гипертиреозе [23]. По нашему мнению, такое разнообразие зачастую противоречащих друг другу данных подтверждает важную роль ТГ в развитии злокачественного процесса, а нарушения функционирования щитовидной железы могут рассматриваться как срыв адаптационных возможностей и противоопухолевой защиты организма. Для самцов были характерны «волнообразные» изменения активности щитовидной железы при развитии меланомы. Первая реакция на перевивку опухоли, так же как и у самок, была стрессорная и выражалась в повышении свободных форм тироксина и трийодтиронина, нерегулируемом ТТГ. После «выхода» опухоли как общие, так и свободные формы Т4 и Т3 резко снизились на фоне некоторого повышения ТТГ. Через 3 нед произошел очередной «всплеск» активности щитовидной железы, выражавшийся повышением уровня свободных форм в ткани без реакции систем регуляции, на последнем этапе эксперимента зафиксирована глубокая гипофункция, не поддающаяся действию регулирующих систем. Вероятно, у самцов и самок через 2 нед развитие экспериментальной меланомы претерпевало качественные изменения, выражавшиеся максимальными изменениями исследуемых гормонов. Возможно, если проводить параллели с клиническим течением меланомы у людей, 2-я неделя эксперимента соответствует переходу меланомы из радиальной фазы роста в вертикальную с глубокой инвазией окружающих тканей, что как известно резко снижает возможность успешного лечения больных. Однако далеко не всегда снижение уровня гормонов в крови или нарушение их синтеза щитовидной железой является причиной недостатка их непосредственно в опухоли и тканях, ее окружающих. Ранее нами уже было установлено превалирование в опухолевой ткани эстрогенов над остальными стероидами у самцов мышей с перевитой меланомой B16/F10, а также прогрессивное увеличение концентрации VEGF-A и VEGF-C и их рецепторов в опухолевой, а затем и в окружающих ее тканях в динамике роста меланомы B16/F10 [3, 4]. В клинике также все больше внимания стали уделять заболеваниям щитовидной железы, в основу которых положен принцип тканевого, а не только системного снижения или повышения содержания ТГ и белков, участвующих в осуществлении механизмов их биологического действия [24]. Несмотря на тот факт, что у самцов мышей в процессе роста меланомы B16/F10 развилась не контролируемая гипоталамо- гипофизарной системой гипофункция щитовидной железы, клетки опухоли оказались не зависимыми от активности данного органа и, очевидно, обладали способностью автономного синтеза и/или захвата ТГ. Локальное повышение ТГ в меланоме - еще одно свидетельство полной автономности и нейроэндокринной активности данной опухоли. Существуют данные о том, что Т3 и Т4 в физиологических концентрациях являются факторами пролиферации для нескольких клеточных линий глиомы у мышей [25]. На примере клеточной глиобластомы U87 было установлено, что оба ТГ стимулируют клеточную пролиферацию [14]. Широкий спектр действия ТГ осуществляется с помощью как геномных, так и негеномных механизмов за счет ядерных и мембранных рецепторов клеток. В рамках геномного механизма действия тироксин рассматривается больше как прогормон, который под действием тканевой дейодиназы переходит в трийодтиронин, имеющий большее сродство к ядерным рецепторам клеток. При негеномном механизме действия тиреоидные гормоны взаимодействуют с рецепторами плазматических мембран на интегрине avP3, который связан с митогенактивируемой протеинкиназой (МАРК) - ERK1/2, которая служит для трансдукции сигнала [14, 26]. Каскад реакций, возникающих после действия ТГ на клеточную мембрану, включает пролиферацию, способствует ангиогенезу и миграции клеток. При этом Т4 в большей степени, чем Т3, активирует через мембрану серин-треонинкиназу и МАРК [26]. Следует отметить, что у самок в отличие от самцов на протяжении всего эксперимента не установлено повышение уровня Т4 и Т3 в ткани опухоли и перифокальной зоны. Таким образом, развитие меланомы в организме действует на активность щитовидной железы у самцов и самок по-разному. Для самок характерно изменение в соотношении ТГ, приводящее к дефициту свободных активных форм, а также нарушению регуляции щитовидной железы гипофизом, тогда как у самцов выявлено угнетение синтеза ТГ щитовидной железой, не контролируемое центральными структурами. Тем не менее у самцов опухолевая ткань осуществляет интенсивный синтез или/и захват тироксина на протяжении всего эксперимента, у самок такие изменения не обнаружены. Состояние тиреоидного статуса коррелировало с продолжительностью жизни животных в зависимости от пола. Так, продолжительность жизни самок составляла 5-6 нед, тогда как самцов - 4-5 нед. Установленные гендерные различия в активности щитовидной железы, а также возможности у самцов автономного синтеза меланомой ТГ необходимо учитывать при лечении пациентов с меланомой. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

About the authors

O. I Kit

Rostov Research Institute of Oncology

Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

E. M Frantsiyants

Rostov Research Institute of Oncology

Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

Valeriya A. Bandovkina

Rostov Research Institute of Oncology

Email: valerryana@yandex.ru
MD, PhD, senior researcher of the Laboratory of research of the pathogenesis of malignant tumors Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

N. D Cheryarina

Rostov Research Institute of Oncology

Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

References

Supplementary files