Immunological microenvironment in the clinical outcome of some solid tumors

Full Text

В настоящее время уже не вызывает сомнения, что злокачественная опухоль является динамической системой, которую следует рассматривать в комплексе со всеми морфологическими составляющими, формирующими ее микроокружение: клетки стромы, клетки системы иммунитета, кровеносные, лимфатические сосуды и экстрацеллюлярный матрикс [1, 2]. Клетки иммунной системы, инфильтрирующие опухоль, в последнее время являются объектом активного изучения [3-5]. Им отводится ключевая роль в концепции «противоопухолевого иммунитета». Многообразие субпопуляций этих клеток, продуктов их синтеза и путей взаимодействия может объяснять их возможное диаметрально противоположное действие: от механизмов противоопухолевой защиты до стимуляции прогрессии канцерогенеза. В нашей работе основной акцент сделан на изучении интратуморальных клеток - участников воспаления (нейтрофилы, эозинофилы) и клеток эффектор- ного звена иммунной системы (Т-цитотоксические (CD8) лимфоциты). Имеется достаточно данных в литературе, свидетельствующих, что хроническое воспаление является риском развития опухоли и ее прогрессирования [6]. Однако некоторые формы асептического воспаления могут быть факторами противоопухолевой защиты и индуцироваться в ответ на злокачественную инвазию. Основным участником воспаления являются нейтро- филы, которые в нашей работе оценивались количественно в строме опухоли и микроокружении. Эозинофилы также оказывают разнонаправленное действие. С одной стороны, они активно взаимодействуют с клетками в участках воспаления, с другой - появились данные, свидетельствующие, что активированные эозинофилы секретируют хемоат- трактанты, которые «дирижируют» Т-лимфоцитами, направляя их в опухоль, а также изменяют микроокружение путем поляризации макрофагов и способствуют нормализации васкуляризации [7, 8]. Роль естественных киллеров в опухоли довольно широко изучена [9-12]. Инфильтрация опухоли ци- тотоксическими Т-лимфоцитами в настоящее время является одним из ключевых факторов прогнозирования течения опухолевого процесса, а также рассматривается в качестве предиктора эффективности иммунотерапии [13]. Целью данной работы явилось изучение количественных соотношений нейтрофилов, эозинофилов и цитотоксических Т-лимфоцитов в строме опухоли и ее ближайшем микроокружении в аденокарциномах желудочно-кишечного тракта и эпителиальных опухолях головы и шеи, корреляция их выявляемо- сти с течением опухолевого процесса и эффективностью лечения. Материал и методы Под нашим наблюдением находились 33 пациента, проходившие лечение в СПб ГБУЗ «Городской клинический онкологический диспансер» в период с 2010 г. по настоящее время. 15 пациентов (9 мужчин и 6 женщин, возраст пациентов варьировал от 39 до 69 лет, медиана возраста 59 лет) наблюдались с диагнозом аденокарциномы желудочно-кишечного тракта и 18 пациентов - с диагнозом плоскоклеточного рака слизистой оболочки полости рта и орофарингеальной зоны (8 женщин и 10 мужчин, возраст от 44 до 84 лет, медиана возраста 64 года). Группа пациентов с аденокарциномой желудочно-кишечного тракта У 6 пациентов (2 женщины и 4 мужчины) была диагностирована аденокарцинома желудка или кардиоэ- зофагеального соединения - 1-я группа: кардиоэзофа- геальный рак - у 1 пациента и поражение желудка - у 5. При первичной постановке диагноза у 2 пациентов опухолевый процесс расценен как T4N2M0. У 2 пациентов опухолевый процесс сразу же был диссеминированным (T4N2M1): у 1 пациента выявлен канце- роматоз брюшины и у 1, кроме поражения брюшины, выявлены метастазы в печень и забрюшинные лимфатические узлы. У 1 пациентки опухоль стадирована как T4NхM1 с прорастанием первичной опухоли желудка в грудную клетку и поражением легких. 1 пациентка проходила лечение у гинеколога с подозрением на заболевание яичников, однако после верификации процесса в яичниках диагностирована аденокарцинома желудка, впоследствии нашедшая свое подтверждение по результатам фиброгастродуоденоскопии; с учетом данных обследований и отсутствия признаков прорастания серозной оболочки опухолевый процесс у пациентки стадирован как T3NxM1 (у данной пациентки, единственной среди всех пациентов, находившихся под наблюдением, не было произведено удаления первичной опухоли). 9 пациентов, из них 6 женщин и 3 мужчины, страдали заболеванием толстой кишки - 2-я группа: у 1 пациента первичная опухоль локализовалась в поперечном отделе ободочной кишки, у 2 - в области селезеночного изгиба ободочной кишки, 4 пациента страдали аденокарциномой сигмовидный кишки, и у 2 пациентов диагностирована опухоль прямой кишки. Только 6 наблюдаемым из 9 было произведено удаление первичного опухолевого очага. У 5 пациентов этой группы при первичной постановке диагноза отдаленных метастазов выявлено не было: у 2 пациентов процесс расценен как T3NxM0 и у 3 - как T4N0M0, T4N1M0 и T4N2M0. Остальные 4 пациента имели зарегистрированные отдаленные метастазы в печень (1 - T4N0M1, 2 - T4N1M1, 1 - T4NxM1), а у 1 из них обнаружено еще и поражение отдаленных лимфатических узлов. Всем пациентам проводилось комплексное лечение по общепринятым стандартам лечения данных нозологический форм заболеваний с обязательным проведением контрольных обследований в рекомендованные сроки. На фоне проводимого лечения у 5 пациентов с аденокарциномой толстой кишки и у 5 больных раком желудка данных, указывающих на прогрессирование заболевания, не получено. Эта когорта пациентов расценена нами как группа пациентов с благоприятным течением заболевания. По данному признаку все 15 пациентов разделены следующих образом: 10 человек имеют благоприятное течение заболевания, без признаков прогрессирования на фоне проводимого лечения, а 5 пациентов с зарегистрированным прогрессированием заболевания на фоне проводимой стандартной терапии - группа неблагоприятного течения заболевания. Группа пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи У 7 пациентов первичный опухолевый очаг локализовался в области боковой поверхности передней или средней трети языка, у 4 пациентов первично была поражена задняя треть языка, 4 имели поражение слизистой оболочки дна полости рта, у 2 пациентов диагностировано поражение альвеолярной части нижней челюсти и 1 пациент страдал наличием опухоли в области слизистой оболочки крылочелюстной складки. После стандартного обследования и стадирования у 2 пациентов зарегистрирована I стадия заболевания (T1N0M0), у 3 пациентов - II стадия (T2N0M0), у 2 пациентов - III стадия (1-T1N1M0, 1-T2N1M0), у остальных 11 пациентов была зарегистрирована IV стадия опухолевого процесса (2 - T4N1M0, 9 - T4N2M0). При морфологическом исследовании у 10 пациентов была выявлена высокая дифференцировка опухоли, у 3 - умеренная, у 2 - низкая; у 3 пациентов дифференцировка опухолевого процесса не была определена. У 11 больных были выявлены гистологические признаки ороговения, у 4 - данных за наличие ороговения не получено и у 3 - данный показатель не определен. Всем пациентам данной когорты в зависимости от стадии опухолевого процесса проводилось комплексное или комбинированное лечение, согласно существующим общепринятым стандартам. С целью выявления возможных факторов прогноза течения заболевания произведено иммуноги- стохимическое исследование первичной опухоли всех пациентов для количественной оценки степени лимфоидной инфильтрации на основании экспрессии антигена CD8, произведена количественная оценка эозинофилов в строме опухоли и в ближайшем микроокружении, а также оценена воспалительная реакция путем подсчета нейтрофилов. Кроме того, целью нашего исследования явилось желание выявить взаимосвязи и взаимодействие между Т-цитотоксическими (CD8) лимфоцитами, эозино- филами и нейтрофилами и основными характеристиками опухоли, а также демографическими данными пациентов. Количественный подсчет проводился в 8 полях зрения, что соответствует площади 1 мм2. Результаты и обсуждение Группа пациентов с аденокарциномой желудочно-кишечного тракта При ИГХ-исследовании у пациентов 1-й группы (аденокарцинома желудка или кардиоэзофагеального соединения) получены следующие результаты. Количественный показатель нейтрофильного звена микроокружения варьировал от 0 до 112 клеток в 1 мм2. Эозинофильное звено варьировало в пределах от 0 до 10 клеток. Экспрессия CD8 колебалась в пределах от 26 до 380. Следует особенно отметить, что минимальная экспрессия CD8 (26) сочеталась с полным отсутстви- CLINICAL INVESTIGATIONS ем нейтрофилов и эозинофилов в строме только у 1 пациентки данной группы, причем только у данной пациентки первичная опухоль не была удалена, и на момент настоящего анализа она единственная имеет общую и безрецидивную выживаемость 30 мес. Анализ результатов пациентов 2-й группы показал следующее: нейтрофильное микроокружение в данной группе опухолей варьировало в более широких пределах, и максимум нейтрофильной инфильтрации был значительно выше, чем при аденокарциноме желудка, - от 12 до 1000 клеток в мм2. Эозинофильная составляющая варьировала в пределах от 3 до 32 клеток. Экспрессия CD8 составила от 104 до 624 клеток/мм2, и ни у одного пациента не опускалась ниже уровня 100 клеток. Суммарные данные по данной группе пациентов были следующими. Показатель нейтрофильного звена микроокружения варьировал в пределах от 0 до 1000 клеток в 1 мм2 (8 стандартных полей зрения): средний показатель составил 267,9000±126,7314 (95% CI от -18,7864 до 554,5864; p = 0,0637); медиана количества нейтрофилов составила 55,5000 мм2 (95% CI от 20,5498 до 703,6053). Эозинофильный компонент варьировал в пределах от 0 до 32 клеток в 1 мм2. Средний показатель количества эозинофилов составил 13,4000±3,5440 клетки (95% CI от 5,3829 до 21,4171; p = 0,0043), медиана - 10 клеток (95% CI от 5,3750 дo 26,7751). Экспрессия CD8 колебалась в пределах от 26 до 624 клеток/мм2, средний показатель составил 264,0000 ± 54,6843 (95% CI от 140,2954 до 387,7046; p = 0,0009), медиана - 241,5000 (95% CI от 117,2998 до 379,0500). Нами проведена попытка выявления корреляционных зависимостей определяемых показателей, характеризующих клеточное микроокружение и лимфоидную инфильтрацию опухоли, с основными критериями заболевания и демографическими характеристиками пациентов. Количество нейтрофилов обратно коррелирует с наличием регионарных метастазов при постановке первичного диагноза (критерий N), r = -0,8422 (95% CI от -0,9708 до -0,3384; p = 0,0087). Выявить корреляционную зависимость количества эозинофилов с основными характеристиками опухолевого процесса на данной выборке выявить не удалось. Экспрессия CD8 обратно коррелировала с диффе- ренцировкой опухоли, r = -0,5974 (95% CI от -0,8916 до 0,05172; p = 0,0682). Имеется уверенная тенденция к прямой корреляции количества эозинофилов и наилучшего ответа, достигнутого в ходе лечения: r = 0,5455 (95% CI от -0,1281 до 0,8747; p = 0,1029), а также тенденция к обратной корреляции уровня нейтрофилов с наилучшим ответом опухоли на лечение: r = -0,4264 (95% CI от -0,8325 до 0,2779; p = 0,2192). Сравнение показателей иммунофенотипа опухоли и ее микроокружения на данной выборке достоверных корреляционных зависимостей не выявило. Проведена оценка выживаемости пациентов обеих групп, получены следующие данные. Медиана общей выживаемости составила 24 мес (95% CI от 18,0000 до 36,0000); на настоящий момент все пациенты живы (рис. 1). КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Месяцы Число пациентов, подверженных риску 15 13 8 2 1 1 0 Рис. 1. Общая выживаемость пациентов с аденокарциномой желудочно-кишечного тракта. Проведенный многофакторный анализ с построением модели Кокса показал следующие результаты. На общую выживаемость вероятность влияния экспрессии CD8 составила p = 0,5648 (95% CI of Exp (b) от 0,9974 до 1,0047), вероятность влияния нейтро- фильного компонента - p = 0,8995 (95% CI of Exp (b) от 0,9982 до 1,0015), а эозинофильного - p = 0,2419 (95% CI of Exp (b) от 0,9700 до 1,1298). Общий уровень значимости модели Кокса составил p = 0,6612. Столь низкая значимость исследуемых показателей связана, по всей видимости, с малым объемом выборки, что говорит о необходимости дальнейшего исследования. Группа пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи Показатель нейтрофильного звена микроокружения варьировал в пределах от 5 до 1000 клеток в 1 мм2 (8 стандартных полей зрения): средний показатель составил 266,0556±67,6979 (95% CI от 23,2255 до 308,8856;p < 0,0257); медиана количества нейтро- филов составила 34,5 мм2 (95% CI от 18,7947 до 107, 6158). Эозинофильный компонент варьировал в пределах от 0 до 872 клеток в 1 мм2, причем только у 1 пациента он достиг максимального предела (872 клетки), у остальных 17 значения данного компонента распределись следующим образом: у 7 пациентов эозинофилы выявлены не были, у 2 пациентов выявлены 3 и 4 клетки соответственно, у 2 пациентов количество эозинофилов составило 16 клеток, и у стальных больных зарегистрировано 29, 39, 48 и 53 клетки в 1 мм2. Средний показатель количества эозинофилов и его медиана были рассчитаны без учета экстремально высокого уровня клеток (872) и составили: среднее количество эозинофилов - 12,8824±4,4108 клетки (95% CI от 3,5319 до 22,2328; p = 0,01), медиана - 3 клетки (95% CI от 0,0000 до 16,0000). Экспрессия CD8 колебалась в пределах от 190 до 1380 клеток/мм2, средний показатель составил 551,2778±80,7383 (95% CI от 380,9349 до 721,6207; p < 0,0001), медиана - 542,5000 (95% CI от 250,3315 до 763,1692). Исследование корреляционных зависимостей позволило обнаружить следующие закономерности. Количество нейтрофилов обратно коррелирует с наличием ороговения опухоли, r = - 0,6327 (95% CI от -0,8647 до -0,1783; p = 0,0114). Количество эозинофилов в данной группе пациентов не показало корреляции с характеристиками опухолевого процесса пациентов. Экспрессия CD8 обратно коррелировала с размером первичного опухолевого очага (критерий T), r = -0,5332 (95% CI от -0,8008 до -0,08836; p = 0,0227) и стадией опухолевого процесса, r = -0,4756 (95% CI от -0,7712 до -0,01118; p = 0,0461) и имела прямое корреляционное взаимоотношение с наличием ороговения опухоли r = 0,5368 (95% CI от 0,03382 до 0,8228; p = 0,0391). Сравнение показателей иммунофенотипа опухоли и ее микроокружения между собой на данной выборке достоверных корреляционных зависимостей не выявило. Нами была оценена общая (рис. 2, см. вклейку) и безрецидивная (рис. 3, см. вклейку) выживаемость пациентов с использованием метода Каплана-Мейера: медиана общей выживаемости составила 38 мес (95% CI от 12,000 до 48,000); медиана времени до прогрессирования составила 14 мес (95% Cl от 5,000 до 14,000). Также нами был проведен многофакторный (с использованием модели Кокса) анализ влияния количественных показателей наличия нейтрофилов, эозинофилов и экспрессии CD8 на общую выживаемость пациентов и на время до прогрессирования заболевания. Достоверных влияний пока не выявлено, что, вероятнее всего, связано с малым объемом выборки, однако о тенденции к влиянию на общую выживаемость можно говорить уверенно (рис. 4), что, безусловно, подтверждает прогностическую ценность этих показателей. На общую выживаемость вероятность влияния экспрессии CD8 составила p = 0,1655 (95% CI of Exp (b) от 0,9794 до 1,0035), вероятность влияния ней- трофильного компонента - p = 0,1546 (95% CI of Exp (b) от 0,9951 до 1,0008), а эозинофильного - p = 0,2242 (95% CI of Exp (b) от 0,9972 до 1,0122). Об- Месяцы Рис. 4. Общая выживаемость пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи в зависимости от иммунологического микроокружения опухоли. щий уровень значимости модели Кокса составил p = 0,1368. На время до прогрессирования вероятность влияния малозначительна: значимость экспрессии CD8 составила p = 0,6887 (95% CI of Exp (b) от 0,9943 до 1,0038), вероятность влияния нейтрофильного компонента - p = 0,9759 (95% CI of Exp (b) от 0,9963 до 1,0036), а эозинофильного - p = 0,4248 (95% CI of Exp (b) от 0,8689 до 1,0607). Общий уровень значимости модели Кокса составил p = 0,4328. Выводы 1. Анализ инфильтрирующих строму и микроокружение лимфоцитов показал, что рассмотренные солидные опухоли являются весьма гетерогенными по данному признаку. 2. В плоскоклеточных эпителиальных опухолях головы и шеи количественный показатель инфильтрирующих лимфоцитов значительно превышает аналогичный показатель в аденокарциномах желудочно-кишечного тракта. 3. Проведенный корреляционный анализ позволил выявить прогностическую и предиктивную ценность иммунологического микроокружения опухоли (особенно плоскоклеточного рака головы и шеи), поскольку уверенно показал влияние экспрессии CD8 Т-лимфоцитов, нейтрофилов и эозинофилов на клиническое течение заболевания и степень ответа на проводимую терапию. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

About the authors

G. M Manikhas

City clinical oncology dispensary; First I. P Pavlov State Medical University of Saint-Petersburg

Saint-Petersburg, 198255, Russain Federation

Svetlana I. Kutukova

City clinical oncology dispensary; First I. P Pavlov State Medical University of Saint-Petersburg

Email: dr.s.kutukova@gmail.com
MD, PhD, oncologist of the chemotherapeutic department (№ 11) of the City Clinical Oncological Dispensary Saint-Petersburg, 198255, Russain Federation

N. P Beliak

City clinical oncology dispensary

Saint-Petersburg, 198255, Russain Federation

G. A Raskin

Russian Scientific Center Of Radiology And Surgical Technology

Saint-Petersburg, 197758, Russian Federation

A. I Yaremenko

First I.P. Pavlov State Medical University of Saint-Petersburg

Saint-Petersburg, 197022, Russian Federation

Yu. V Ivaskova

City clinical oncology dispensary

Saint-Petersburg, 198255, Russain Federation

T. S Ermakova

City clinical oncology dispensary; First I. P Pavlov State Medical University of Saint-Petersburg

Saint-Petersburg, 198255, Russain Federation

S. S Bozhor

First I.P. Pavlov State Medical University of Saint-Petersburg

Saint-Petersburg, 197022, Russian Federation

References

Supplementary files