Plasminogen and PAI-1 activators in tissues of adenocarcinoma and squamous cell carcinoma of the esophagus

Full Text

Важнейший механизм прогрессии рака - разрушение окружающей опухоль базальной мембраны и внеклеточного матрикса ассоциированными с опухолью ферментами. Последние сообщения доказывают, что протеиназы вовлечены в рост и первичных, и метастатических опухолей [1]. Выяснилось, что различные протеолитические ферменты действуют в строго детерминированной цепи, которая является результатом порядка их активации [2]. Характерным примером такого каскада являются последовательные акты активации протеолиза, приводящие к деградации внеклеточного матрикса. Инициирующим звеном этого каскада считается сериновая протеиназа - активатор плазминогена урокиназного типа (uPA), расщепляющая плазми- ноген до плазмина, который уменьшает сцепление между клетками, активирует некоторые прометал- лопротеиназы, факторы роста, играя решающую роль в процессах инвазии и метастазирования [3- 5] . Тканевый активатор плазминогена - тромбо- киназа (тромбопластин, tPA) - также активирует плазминоген, но его роль в онкологической патологии пока не вполне понятна. Активаторы плаз- миногена являются ферментами, участвующими в процессах деструкции базальной мембраны, внеклеточного матрикса и инвазии злокачественных клеток при многих локализациях неоплазии [3, 4, 6] , однако их роль в различных видах рака пищевода еще не выяснена. Изучение молекулярно-биологических особенностей рака пищевода открывает перспективы для более точной оценки прогноза течения заболевания в целях индивидуализации и совершенствования лечебной тактики. Нашей задачей в рамках данного проекта стало выявление про- теиназ, ассоциированных с аденокарциномой и/или плоскоклеточным раком пищевода, перспективных с клинической точки зрения. Для решения этой задачи планировалось исследовать уровни экспрессии проурокиназы, протромбокиназы и ингибитора PAI-1 в злокачественных тканях рака пищевода, в пограничных и не тронутых трансформацией участках. Цель исследования - изучение компонентов системы активации плазминогена и их ингибитора PAI-1 в тканях аденокарциномы и плоскоклеточного рака пищевода в сравнительном аспекте. Материал и методы Разрешение этического комитета РНИОИ на использование операционного материала пациентов для научных целей получено перед началом работы. Методом ИФА (со стандартными тест-наборами ELISA) исследована удаленная ткань первичной аденокарциномы (n = 9, стадия II, G2, T2-3N0-1M0-1) и первичного плоскоклеточного рака пищевода (n = 27, стадия II, G2, T2-3N0-1M0-1) от 36 больных, поступивших на оперативное лечение в РНИОИ. Гистологический контроль осуществлялся во всех случаях. Операционный материал разделяли на туморозный очаг, перифокальную зону и ткань из области линии резекции. В 10% гомогенатах, приготовленных на стерильном физиологическом растворе, определяли содержание проурокиназы, урокиназы (uPA-АГ, uPA-акт), протромбокиназы, тромбокиназы (tPA-АГ, tPA-акт), ингибитора PAI-1 (PAI-1-АГ, PAI-1-акт) с последующим пересчетом на 1 г влажной ткани. Статистическую обработку цифровых данных проводили с помощью программы Statistica v.10. Достоверность различий между количественными показателями вычисляли с помощью t-критерия Стьюден- та. Результаты и обсуждение Компоненты системы активации плазминогена и их ингибитор PAI-1 обнаружены во всех исследованных образцах ткани пищевода. Цифровые данные, полученные для опухолевой ткани и ее перифокаль- ной зоны, сравнивали с данными гистологически не измененной ткани из области линии резекции, которую считали условно здоровой. Установлено, что в ткани опухоли аденокарциномы и плоскоклеточного рака пищевода резко повышены уровни uPA-АГ (в 1,6 и 6 раз), uPA-акт (в 3,2 и 8,5 раза), PAI-1-АГ (в 9,4 и 8,1 раза) и PAI-1-акт (в 10,7 и 2,5 раза) относительно условно здоровой ткани из линии резекции (табл. 1). В перифокальной зоне аденокарциномы концентрация uPA-АГ снижена в 1,5 раза, а в аналогичной ткани плоскоклеточного рака - не отличалась от ткани линии резекции. Содержание остальных компонентов, исключая tPA, было повышено: uPA-акт - в 1,8 и 1,7 раза, PAI-1- АГ - в 6,3 и 2,2 раза, PAI-1-акт - в 1,9 и 1,3 раза. Концентрация протромбокиназы (tPA-АГ) была повышена только в перифокальной зоне плоскоклеточного рака пищевода, в ткани опухоли и линии резекции она регистрировалась на одном уровне, а в ткани опухоли аденокарциномы и ее перифокальной зоне была снижена в 2 и 1,8 раза соответственно относительно ткани из линии резекции. Содержание активной ее формы - тромбокиназы (тромбопластина, tPA-акт) - было повышено только в перифокальной зоне плоскоклеточного рака пищевода в 1,5 раза, а в самой опухоли и аналогичных тканях аденокарциномы мы наблюдали снижение в 3; 1,6 и 1,5 раза соответственно сравнительно с тканью из линии резекции (см. табл. 1). Активаторы плазминогена и PAI-1 в ткани рака пищевода BASIC RESEARCH - PRACTICAL MEDICINE Таблица 1 Показатель Плоскоклеточный рак Аденокарцинома линия резекции перифокальная зона опухоль линия резекции перифокальная зона опухоль uPA-АГ, нг на1 г ткани 14,54 ± 1,2 17,16 ± 1,4 86,61 ± 7,1й 20,41 ± 1,43 13,60 ± 1,11 31,71 ± 2,3й uPA-акт, ед. на 1 г ткани 0,181 ± 0,01 0,311 ± 0,02 1 1,530 ± 0,11, 2 0,212 ± 0,01 0,391 ± 0,031 0,680 ± 0,071- 2 tPA -АГ, нг на 1 г ткани 33,92 ± 2,5 49,12 ± 3,5> 31,10 ± 2,22 14,80 ± 1,13 8,304 ± 0,6> 7,412 ± 0,51 tPA-акт, ед. на 1 г ткани 5,310 ± 0,4 8,030 ± 0,6' 1,804 ± 0,11, 2 2,042 ± 0,13 1,312 ± 0,Г 1,360 ± 0,Г PAI-1-АГ, нг на 1 г ткани 97,14 ± 7,1 210,2 ± 14,24 785,4 ± 61,81, 2 60,91 ± 4,2 3 381,3 ± 27,8> 569,2 ± 38,71- 2 PAI-1-акт, ед. на 1 г ткани 7,620 ± 0,6 10,23 ± 0,81 19,30 ± 1,51, 2 6,230 ± 0,4 3 11,90 ± 0,81 66,81 ± 4,51' 2 Примечание. Здесь и в табл. 2 различия достоверны: 1 - относительно соответствующей ткани из линии резекции; 2 - относительно соответствующей ткани перифокальной зоны; 3 - между образцами из линии резекции (p < 0,01 во всех случаях). Разнонаправленные изменения концентрации и активности компонентов системы активации плаз- миногена в исследованных тканях рака пищевода свидетельствуют прежде всего о нарушении их физиологического баланса, что ориентирует метаболизм этих тканей на прогрессирование патологии, в данном случае злокачественной. В норме динамическое равновесие проферментов и ферментов-гидролаз обеспечивает адекватный метаболизм, сохраняющий стабильность клеточных и тканевых структур и «чистоту» интерстиция [1, 2, 7]. Интенсивное образование урокиназы привело к снижению коэффициента соотношения uPA-акт с предшественником в тканях обеих опухолей относительно их линии резекции. Так, в перифокальной зоне и опухоли плоскоклеточного рака регистрировали одинаковое снижение коэффициента uPA-АГ/ uPA-акт в 1,4 раза, а в опухоли аденокарциномы это снижение было менее выражено, чем в ее перифо- кальной зоне, на 33,8%, где баланс уменьшился почти в 3 раза относительно гистологически не измененной ткани. Очевидно, что одинаковое снижение соотношения uPA-АГ/uPA-акт в тканях плоскоклеточного рака пищевода относительно условно здоровой ткани не связано с равномерной выработкой проурокиназы и ее активацией в самой опухоли и близлежащей ткани (табл. 1, 2), скорее образование uPA-акт обусловлено одинаковыми механизмами. В этом случае в туморозном очаге uPA могла быть продукцией злокачественно трансформированных клеток. Данные литературы подтверждают такую возможность, уже установленную для рака молочной железы, матки, яичников, легкого [4, 8], рака поджелудочной железы, печени, толстой кишки [3, 5, 8, 9] и других локализаций. J. Halamkova и соавт. Таблица 2 Баланс компонентов системы активации плазминогена в ткани рака пищевода Коэффициент Плоскоклеточный рак Аденокарцинома линия резекции перифокальная зона опухоль линия резекции перифокальная зона опухоль uPA-АГ/uPA-акт 80,6 ± 5,9 56,7 ± 4,31 56,6 ± 4,41 102 ± 7,23 34,9 ± 2,41 46,7 ± 3,91,2 1PA-АГ/1PA-акт 6,4 ± 0,5 6,1 ± 0,4 17,3 ± 1,51, 2 7,4 ± 0,5 6,4 ± 0,5 5 4 ± 0 41,2 (р < °,°5) PAI-1-акт/uPA-акт 42,2 ± 3,2 34,0 ± 2,5 12,6 ± 0,91,2 31,0 ± 2,23 30,5 ± 2,1 98,2 ± 8,11, 2 PAI-1-акт/1PA-акт 1,4 ± 0,1 1,3 ± 0,1 10,7 ± 0,81, 2 3,1 ± 0,23 9,2 ± 0,7 1 49,1 ± 3,91, 2 PAI-1-АГ/PAI-1-акт 12,8 ± 0,9 20,6 ± 1,7 40,7 ± 3,11, 2 9,8 ± 0,73 32,0 ± 2,31 8,5 ± 0,72 [10] , B.J. McMahon и H.C. Kwaan [8] считают феномен резкого увеличения внутриопухолевой уроки- назы универсальным для многих злокачественных новообразований. Активность урокиназы контролируется серпином PAI-1, который имеет сродство не только к uPA, но и к tPA [10, 11]. Тромбокиназа (tPA) является трансмембранным гликопротеином и локализована в эндотелиальных и гладкомышечных клетках. Соотношение tPA-АГ/ tPA-акт было повышено только в опухолевой ткани плоскоклеточного рака пищевода, в перифокальной зоне оно не отличалось от такового в условно здоровой ткани, взятой из области линии резекции. Напротив, в опухолевой ткани аденокарциномы коэффициент tPA-АГ/tPA-акт был ниже, чем в перифокальной зоне, с невысокой, но достаточной степенью достоверности (на 18, 5%, p < 0 ,05) и ниже, чем в ткани из линии резекции, в 1,3 раза (см. табл. 2). Опираясь на эти соотношения, можно утверждать, что в ткани плоскоклеточного рака пищевода преобладает содержание tPA-АГ, а в ткани аденокарциномы - ее активной формы tPA-акт, при этом абсолютные величины содержания обеих форм и их баланс в ткани аденокарциномы пищевода достоверно ниже, чем в ткани плоскоклеточного рака (см. табл. 1, 2). Тканевый активатор плазминогена уже рассматривается как один из ферментов, вовлекаемых в процессы деструкции базальной мембраны, внеклеточного матрикса и инвазии клеток, но в настоящее время точно не известны детали его взаимодействия с PAI-1 [6, 11, 12]. PAI-1 является биологически важным серпином, его избыточная экспрессия связана с высоким риском образования метастазов [13]. Авторами измерены изменения в биодоступности PAI-1 и динамика фундаментальная наука - практическому здравоохранению состояния его активного центра в реакциях с uPA и tPA, сделан вывод о том, что быстрее всего PAI- 1 связывается с uPA, теряя при этом значительную часть своей активности. В наших исследованиях коэффициент PAI-1-акт/uPA-акт понижался на 24,1% в перифокальной зоне и в 3,4 раза в ткани опухоли плоскоклеточного рака пищевода относительно ткани линии резекции и резко увеличен в 3,2 раза в ткани опухоли аденокарциномы относительно ее пе- рифокальной зоны и ткани по линии резекции (см. табл. 2). Соотношение профермента и фермента в процессе образования самого ингибитора PAI-1-АГ/ PAI-1-акт в тканях плоскоклеточного рака пищевода увеличивалось в 3,2 раза в опухоли и в 1,6 раза в ее перифокальной зоне относительно ткани из области линии резекции (см. табл. 2). При исследовании аденокарциномы пищевода обнаружено увеличение PAI-1-АГ/PAI-1-акт только в ее перифокальной ткани до значений, при достоверных различиях все же сравнимых с полученными для тканей плоскоклеточного рака пищевода. При этом активного PAI-1 в опухолевой ткани аденокарциномы в 3,5 раза больше, чем в аналогичной ткани плоскоклеточного рака (см. табл. 1). Из многих сообщений следует, что содержание PAI-1 практически при всех исследованных локализациях достоверно повышено в туморозном очаге сравнительно с гистологически не измененной тканью [14-16]. Авторы не исследовали перифокаль- ную ткань и подчеркивают, что высокая концентрация PAI-1 в опухолевой ткани не только не снижает ее агрессивность, но ухудшает течение заболевания у больных раком толстой и прямой кишки, желудка, молочной железы, яичников и др., и предлагают использовать PAI-1 в качестве прогностического маркера течения злокачественного процесса. Наблюдения перечисленных и других исследователей [8] подтверждают возможность защиты опухолевых клеток ингибитором PAI-1 от разрушения эндогенными и ассоциированными с опухолью протеиназами. В свете последних сообщений резко повышенное содержание PAI-1 в исследованных опухолях пищевода и/или окружающей их ткани скорее может служить подтверждением и маркером степени их агрессивности, чем показателем эндогенной защиты. Нам приходилось регистрировать дисбаланс между тканевыми серпинами, а также серпинов с активаторами плазминогена при аденокарциноме толстой кишки [17, 18], а также в ликворе больных со злокачественной глиомой головного мозга [19]. Во всех случаях значительный избыток серпинов ткани и ликвора не был связан с улучшением состояния больного, а значения серпинов, близкие к нормальным, встречались только у больных с благополучным течением послеоперационного периода. В отношении влияния PAI-1 на tPA и роли последнего в онкологической патологии продолжается дискуссия. Ранее сообщалось, что активность tPA резко увеличивается in vitro при диссоциации его комплексов с PAI-1, содержащих оба компонента в равной концентрации, при этом молекулярная масса и активность PAI-1 уменьшаются незначительно [20]. Позже Y. Suzuki и соавт. [21] in vitro установили, что добавление PAI-1 в реакционную среду способствует дозозависимой диссоциации мембраны, увеличению количества растворимых и уменьшению мембраносвязанных комплексов tPA с PAI-1 при сохранении активности tPA. В последующих исследованиях Y. Suzuki и T. Urano [22] подтвердили факт исчезновения tPA с поверхности клеток в зависимости от концентрации PAI-1, а B. Niego и R. Medcalf [23] доказали преимущественное по отношению к плазмину участие tPA в повреждении гематоэнцефалического барьера. В сообщении D. Yamashita и соавт. [12] блокирование активности tPA препятствовало прогрессии злокачественной глиомы. Складывается впечатление, что роль tPA не сводится только к физиологическим и защитным реакциям, этому ферменту в зависимости от его соотношения с предшественником и PAI- 1 присущи и патологические эффекты, связанные с повреждением мембран и стимуляцией стволовых клеток злокачественной опухоли. Мы обнаружили, что соотношение PAI-1-акт/ tPA-акт увеличено в ткани опухоли плоскоклеточного рака пищевода в 8,2 раза относительно тканей области линии резекции и ее перифокальной зоны, а также повышалось в 15,8 раза в аденокарциноме и в 3 раза в ее перифокальной зоне сравнительно с тканью из области линии резекции (см. табл. 2). Учитывая ранние исследования tPA, недавние исследования T. Qureshi и соавт. [13] о том, что PAI- 1 связывается с tPA менее эффективно, чем с уро- киназой, D. Yamashita и соавт. [12] о значении tPA в прогрессии глиобластомы и наши результаты, возможно предположение о присутствии в ткани плоскоклеточного рака пищевода опухольассоци- ированного tPA-АГ, роль и возможности которого еще требуют изучения. В обзоре M. Schuliga [24] подчеркивается, что помимо регуляции гемостаза белки-коагулянты (включая tPA) и фибринолитиче- ские протеиназы являются важными медиаторами воспаления, в том числе при онкологических заболеваниях. По мнению автора, коагулянты и фи- бринолитические протеиназы оказывают провос- палительное действие и вызывают прогредиентное течение болезни. Коагулянты, активаторы плазми- ногена, сам плазминоген и плазмин вызывают одинаковый клеточный ответ. Плазмин также косвенно способствует воспалительным процессам путем активации VEGF и рецепторов трансформирующего фактора роста (TGFp) [24]. Таким образом, в развитии и плоскоклеточного рака пищевода, и аденокарциномы uPA и PAI-1 играют, по-видимому, важную роль. Роль tPA требует уточнения, но, по нашему мнению, в перифо- кальной зоне плоскоклеточного рака пищевода он может играть не столько защитную, сколько повреждающую роль. В опухоли плоскоклеточного рака и тканях аденокарциномы его снижение, возможно, связано с активным потреблением или угнетением токсинами опухоли. Соотношение tPA-АГ/tPA-акт повышено в 2,7 раза только в ткани опухоли плоскоклеточного рака пищевода, в остальных образцах снижено (p < 0,01) или имеет четкую тенденцию к снижению (p < 0,05) сравнительно с областью гистологически не измененной ткани. Направленное избирательное воздействие на uPA, tPA, PAI-1, плаз- мин без нарушения гемостаза может быть полезно в лечении плоскоклеточного рака и аденокарциномы пищевода. Выводы 1. Концентрация uPA-акт и PAI-1 в опухолях и окружающих их тканях была достоверно выше, чем в области линии резекции, и для плоскоклеточного рака пищевода, и для аденокарциномы, во всех случаях нарушено соотношение между проферментом и ферментом, а также между антигенной и активной формами ингибитора. 2. Концентрация tPA была выше в области линии резекции аденокарциномы, чем в ткани опухоли и ее перифокальной зоны, но в перифокальной зоне плоскоклеточного рака пищевода - выше, чем во всех остальных образцах ткани. 3. При плоскоклеточном раке пищевода и аденокарциноме uPA и PAI-1 и, возможно, tPA могут стать мишенями лекарственной терапии. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

About the authors

O. I Kit

Rostov Research Institute of Oncology

Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

E. N Kolesnikov

Rostov Research Institute of Oncology

Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

E. M Frantsiyants

Rostov Research Institute of Oncology

Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

Larisa S. Kozlova

Rostov Research Institute of Oncology

Email: 79094277471@yandex.ru
MD, PhD, associate professor, senior researcher of the hormonal laboratory Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

Yu. A Pogorelova

Rostov Research Institute of Oncology

Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

N. D Cheryarina

Rostov Research Institute of Oncology

Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

N. S Chugunova

Rostov Research Institute of Oncology

Rostov-on-Don, 344037, Russian Federation

References

Supplementary files