MOLECULAR GENETIC TESTING IN DIAGNOSTICS OF LUNG CANCER AND OVARIAN CARCINOMA WITH THE USAGE OF CYTOLOGICAL SPECIMENS



Cite item

Full Text

Abstract

This article presents results of the introduction in practical oncology of molecular genetic investigations performed with the use of tumor DNA cells taken from the cytological specimens. There was investigated the molecular genetic characteristics of cytological specimens from 126 patients. In 80 cases with the proved diagnosis of pulmonary adenocarcinoma (n = 80) EGFR gene mutations were noted in 11.7% cases. KRAS, BRAF and BRCA1/2 gene mutations were determined in 46 women suffering from serous ovarian carcinoma. KRAS gene mutations in cells of ovarian low-grade serous carcinoma were determined in 62.5% of patients, BRAF- in 12.5% cases. BRCA1 gene mutations have been determined in 14.3% cases from the ovarian high-grade serous carcinoma group. In conditions of the presence of the sufficient amount of tumor cells the cytological material is the fully-featured material for molecular genetic investigations. The investigation both of EGFR gene mutations in pulmonary adenocarcinoma cases and KRAS, BRAF, BRCA1/2 gene mutations with serous ovarian carcinoma are mandatory in the appointment of targeted therapy.

Full Text

Успешное развитие молекулярной онкологии, накопившийся опыт использования в клинической практике новых таргетных препаратов, позволяющих реализовать персонифицированный подход к лечению, требуют точной диагностики с определением наличия мутаций в клетках опухоли. Наиболее существенные успехи достигнуты в таргетной терапии при немелкоклеточном раке лёгкого, колоректальном раке, гастроинтестинальных стромальных опухолях, раке молочной железы, меланоме и других опухолях [1]. В 2004 г. в научной литературе появились сообщения об активирующих соматических мутациях в рецепторе эпидермального фактора роста (EGFR). Открытие соматических мутаций гена EGFR явилось ключевым моментом в разработке стратегии лечения немелкоклеточного рака лёгкого и привело к появлению нового молекулярного показателя чувствительности опухоли лёгкого к ингибиторам тирозинкиназы [2, 3]. Исследователями обнаружено, что у пациентов (10% от числа всех больных немелкоклеточным раком лёгких), получающих эффект от лечения гефитинибом и эрлотинибом, в ткани опухоли обнаружены мутации гена EGFR [2, 4]. Назначение таргетных препаратов эрлотиниб, афатиниб и гефитиниб показано только тем больным, у которых в опухолевых клетках выявляется мишень для действия этих препаратов [2, 5]. Проведение молекулярно-генетических исследований позволяет выделить группу пациентов, для которых наиболее вероятен выраженный клинический ответ на терапию ингибиторами тирозинкиназы. В практическом здравоохранении в настоящее время доступно исследование 29 клинически наиболее значимых мутаций гена EGFR, которые локализованы в 18-21-м экзонах, кодирующих тирозинкиназный домен. Особую значимость для персонализированного подхода к выбору терапии имеют делеции 19-го экзона и мутация L858R 21-го экзона, определяющие около 90% спектра мутаций тирозинкиназного домена гена EGFR. В настоящее время определение мутаций гена EGFR у больных аденогенным раком лёгкого является обязательной диагностической процедурой, клинически и экономически обоснованной. Одним из первых идентифицированных онкогенов является ген KRAS, причастность которого к опухолевому росту открыта в 1980-х годах, мутации гена KRAS обнаружены в опухолях различных локализаций: при метастатическом колоректальном раке, немелкоклеточном раке лёгкого, аденокарциноме поджелудочной железы, раке щитовидной железы, меланоме, раке яичника [6]. Мутации гена BRAF обнаружены в опухолевых клетках аналогичных образований. Мутационный статус генов KRAS и BRAF находится во взаимоисключающих отношениях: если в клетках опухоли обнаруживается активация гена KRAS, присутствие нарушений в кодоне 600 гена BRAF практически не встречается; напротив, если в опухоли наблюдается мутация гена BRAF, то статус гена KRAS почти всегда остаётся нормальным. В настоящее время активное использование в клинической практике особенностей канцерогенеза рака яичников даёт основу для разработки таргетных препаратов, воздействующих на относительно часто встречающиеся молекулярные нарушения в опухолевых клетках. Серозный рак яичника низкой степени злокачественности составляет менее 5% всех карцином яичника. Для этой формы рака характерны в 19% наличие соматических мутаций в гене KRAS и в 8% - в гене BRAF [7]. Среди женщин с серозным раком яичников низкой степени злокачественности наличие соматических мутаций KRAS/BRAF является благоприятным прогностическим фактором [8]. Практическое применение таргетных препаратов, воздействующих на мутации гена KRAS, для лечения пациенток этой группы находится в стадии научных и клинических разработок, что становится основной тенденцией в развитии терапии рака яичников. У пациенток, имеющих мутацию V600E гена BRAF, ранее получивших несколько линий химиотерапии, лечение вемурафенибом обеспечивает стойкий симптоматический, радиологический и биохимичес-кий ответ [9]. Другой изученной мишенью, в частности при высокозлокачественных формах серозного рака яичника, являются мутации генов BRCA1/2, которые приводят к повышению риска возникновения рака яичников [10, 11]. По данным разных авторов, при раке яичников герминальные мутации генов BRCA1/2 выявляются в 10-17% случаев [11, 12]. Кроме того, в течение длительного времени явно недооценивалось значение соматических мутаций BRCA1/2 при раке яичников, хотя описаны они были давно (Foster K.A., 1996; Bercburk A., 1998). По опубликованным в «The Cancer Atlas» данным, не менее 6% мутаций определяется только в опухолевой ткани яичников, причём в нескольких случаях соматические мутации BRCA1 сочетались с герминальными в BRCA2 и наоборот. Эти данные подтверждают необходимость исследования при раке яичников не только клеток крови для поиска герминальных мутаций, но и опухолевой ткани для выявления соматических нарушений [12]. BRCA-ассоциированные раки молочной железы и яичников характеризуются резистентностью к «золотому стандарту» терапии - препаратам из группы таксанов [6]. В то же время рак молочной железы у BRCA-гетерозигот демонстрирует исключительно выраженный регресс при лечении цисплатином [6]. Данный факт позволяет персонализировать процесс лечения и определять прогноз заболевания. Назначение новых таргетных препаратов, таких как олапариб, для поддерживающего лечения пациенток с рецидивирующим серозным раком яичников высокой степени злокачественности показано пациенткам с мутацией BRCA, у которых регистрировался ответ на терапию препаратами платины [13]. Проведение молекулярно-генетических исследований для выявления данных мишеней стало неотъемлемой частью диагностики в практической работе онкологических диспансеров. Для поиска данных мишеней в настоящее время существуют различные методы: секвенирование, аллель-специфическая полимеразно-цепная реакция, секвенирование следующего поколения и метод мультиплексной полимеразной цепной реакции с лигированием олигонуклеотидных зондов. Самый чувствительный молекулярно-генетический метод - полимеразная цепная реакция используется для определения точковых мутаций, делеций, инсерций, инверсий, транслокаций, амплификаций и др. генетических аберраций в любом материале, содержащем опухолевые клетки (фрагменты опухолевой ткани, единичные опухолевые клетки, слизь, мокрота, слюна, моча, кал, костный мозг, выделения из молочных желез, сок поджелудочной железы, желчь, асцитическая жидкость и т. д.), и в плазме крови [14]. Наиболее часто для молекулярно-генетического анализа используются фрагменты опухолевой ткани, полученные в ходе операции или биопсии. В тех случаях, когда для исследования доступен только цитологический материал, источником ДНК опухолевых клеток для поиска соматических мутаций могут быть окрашенные цитологические препараты, цитоблоки, цитоспины и т. д. Для проведения молекулярного тестирования обычно достаточно всего одного стекла, содержащего не менее 100-200 опухолевых клеток. Цель работы: оценить возможности проведения молекулярно-генетических исследований с использованием ДНК клеток опухоли, полученных из цитологических препаратов, при раке лёгкого и яичника. Материал и методы Изучены результаты молекулярно-генетических исследований 80 пациентов с аденогенным раком лёгкого и 46 пациенток с серозным раком яичника, пролеченных в КГБУЗ «Алтайский краевой онкологический диспансер» в 2014-2016 гг. Использованы клинические данные пациентов и образцы их ДНК, выделенные из цитологических препаратов, окрашенных по методу Паппенгейма (см. табл.). В цитологических препаратах оценивали количество опухолевых клеток и их процентное соотношение с остальным клеточным материалом [15]. Отобранные комплексы клеток опухоли на стеклопрепарате отмечали маркером. Клеточный материал растворяли каплей лизирующего раствора и отбирали пипеткой в пробирку типа Эппендорф. ДНК, полученную из цитологических препаратов, выделяли с помощью набора QIAamp DNA Mini Kit («Qiagen», Германия) по стандартным протоколам в автоматическом режиме на станции QIAcube. Молекулярно-генетическое исследование материала осуществляли методом аллель-специфической полимеразной цепной ракции (ПЦР) в режиме реального времени. На первом этапе проводили оценку пригодности полученных ДНК-образцов в контрольной ПЦР-реакции (в соответствии со стандартным протоколом производителя). Кривые накопления ПЦР-продукта в образцах сопоставляли со стандартами ДНК без мутации в исследуемом гене (отрицательный ДНК-стандарт, входящий в набор для постановки ПЦР-реакции, где амплифицируется константный район исследуемого гена). Для учета уровня фона ПЦР-реакции в работе использовали контроль без матрицы (вода). Качество и количество ДНК оценивали по величине Ct, которая соответствует количеству циклов ПЦР, при которых кривая флуоресценции пересекает заданный уровень фона (т. е. не менее 2 нг очищенной ДНК в образце). Для аллель-специфической ПЦР использовали только образцы, ДНК которых имела величину Ct, сопоставимую с Ct отрицательного стандарта. Оценивали статус генов EGFR, BRCA 1/2, KRAS, BRAF. В случае исследования генов BRCA1/2 ПЦР-реакцию проводили в один этап, одновременно сопоставляя с отрицательным и положительным ДНК- стандартами. Определение статуса гена EGFR осуществляли методом аллель-специфической ПЦР в режиме реального времени с помощью набора EGFR RGQ PCR Kit («Qiagen», Германия) на приборе CFX-96 (США). Исследовали мутации: 18 ex.(G719X); del19 ex.; 20 ex. (T790M, S768I, ins); 21 ex. (L858R, L861Q). На начальном этапе выполнения работы отобран цитологический материал 20 пациентов с установленным диагнозом рака лёгкого двумя морфологическими методами - гистологическим и цитологическим. Полученные результаты определения мутаций из гистологического и цитологического материала были сопоставимы. В последующем у 60 пациентов определение статуса гена EGFR проводили только на образцах ДНК, выделенной из цитологического материала, так как он являлся единственно доступным для исследования. В группе пациенток с серозной карциномой яичников проводили исследование генов KRAS, BRAF, BRCA1/2. Мутации в генах KRAS, BRAF, BRCA1/2 детектировали методом аллель-специфической ПЦР с помощью наборов Real-time PCR производства ООО «Биолинк» (Россия) на приборе CFX-96 (США). Исследовали следующие мутации: в гене BRCA1 - 5382insC, 4153delA, 185delAG, T300G; в гене BRCA2 - 6174delT; в гене KRAS - G12C, G12S, G12R, G12V, G12D, G12A, G13D и в гене BRAF - V600E. Результаты В ходе исследования изучен статус гена EGFR у 21 женщины и 59 мужчин с установленным цитологическим диагнозом аденокарциномы лёгкого, в возрасте 43-77 лет (60,33 ± 17,13). Молекулярно-генетический анализ проводили на образцах ДНК, выделенной из цитологического материала, содержащего более 200 опухолевых клеток. Мутации гена EGFR обнаружены в 7(11,7%) из 60 наблюдений, в числе которых выявлена точечная мутация L858R (3 наблюдения) и делеции 19 экзона (4 наблюдения) (рис. 1 и 2, см. 4-ю полосу вклейки). Пациентки с серозной карциномой яичников по цитологической картине разделены на группы высокой (n = 38) и низкой (n = 8) степени злокачественности. Для генетического исследования пригодным был материал 43 (93,5%) пациенток, так как в 3 случаях концентрация полученной ДНК оказалась недостаточной. Женщины с цитологическими признаками высокой степени злокачественности серозной карциномы яичников были почти на 10 лет старше пациенток с раком низкой степени злокачественности, т. е. в возрасте 60,73 ± 10,47 и 51,29 ± 21,35 года соответственно. В результате проведённых молекулярно-генетических исследований у 5 (62,5%) из 8 женщин в группе серозной карциномы яичника с низкой степенью злокачественности обнаружена генетическая поломка в гене KRAS, в 4 случаях из них выявлена мутация G12V и в одном случае - G12D. Мутация V600E в гене BRAF обнаружена в одном (12,5%) наблюдении, мутации генов BRCA1/2 во всех наблюдениях этой группы пациенток отсутствовали. В группе пациенток с серозной карциномой яичника высокой степени злокачественности обнаружены только мутации в гене BRCA1 - 5 случаев из 35 (14,3%), которые были представлены в 3 наблюдениях мутацией 5382insC и по одному случаю - T300G и 4153delA (рис. 3 и 4, см. 4-ю полосу вклейки). В этих случаях судить о соматическом или наследственном происхождении мутаций не представляется возможным, и для заключения об их происхождении необходимо исследовать образцы периферической крови. Мутации генов KRAS и BRAF во всех наблюдениях этой группы пациенток отсутствовали. В практической работе использование цитологического материала для молекулярно-генетического тестирования особенно актуально в тех случаях, когда доступен лишь цитологический материал. Получение цитологического образца менее инвазивно, проводится на догоспитальном этапе обследования больного и часто является терапевтической процедурой, например, при удалении жидкости из плевральной и брюшной полости. Проведённое исследование показало, что цитологический материал в большинстве случаев является достаточным для выявления соматических мутаций у пациентов с аденогенным раком лёгкого (EGFR) и серозной карциномой яичника (KRAS и BRAF). При серозной карциноме яичников в опухолевом материале возможно присутствие как соматических, так и герминальных мутаций гена BRCA, а также их сочетания. При обнаружении мутации гена BRCA в цитологическом материале необходимо дальнейшее исследование ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови этих пациенток, для получения информации о соматическом или наследственном происхождении мутаций. С учётом перспективы дальнейшего проведения молекулярно-генетических исследований специа-листы клинической лабораторной диагностики должны знать об ограничениях использования цитологического материала для поиска мутаций в клетках опухоли и рассматривать каждый конкретный случай с акцентом на достаточное количество материала для получения ДНК. При этом необходима дальнейшая стандартизация данного лабораторного теста с использованием цитологического материала в качестве источника ДНК. Чрезвычайно важно для назначения таргетных препаратов установление точного диагноза, при котором взаимодействие между хирургами, химиотерапевтами, гистологами, цитологами и врачами лаборатории молекулярной диагностики имеет решающее значение. Выводы 1. Использование цитологического материала для поиска соматических мутаций оправданно для пациентов с местно-распространенным или диссеминированным процессом, у которых цитологический материал является единственно доступным морфологическим материалом для исследования. 2. Цитологический материал с наличием достаточного количества клеток опухоли (не менее 200) позволяет провести полноценные молекулярно-генетические исследования. 3. Мутации гена EGFR обнаружены в 11,7% наблюдений, в числе которых выявлена точечная мутация L858R (3 наблюдения) и делеции в экзоне 19 (4 наблюдения). 4. В клетках серозной карциномы яичников низкой степени злокачественности мутации гена KRAS обнаружены в 62,5% случаев, гена BRAF - в 12,5% наблюдений. 5. Мутации гена BRCA1 отмечены у 14,3% пациенток с серозной карциномой яичников высокой степени злокачественности. 6. При обнаружении мутации гена BRCA в цитологическом материале серозной карциномы яичников высокой степени злокачественности необходимо дальнейшее исследование образцов периферической крови этих пациенток для получения информации о соматическом или наследственном происхождении мутаций.
×

About the authors

Olga G. Grigoruk

Altai Branch of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; Altai Regional Oncology Dispensary; The Altai State Medical University

Email: cytolakod@rambler.ru
MD, PhD, DSc, Head of the Clinical Laboratory Diagnostics Department (for Carrying out Cytological Research Methods) of the Altai Regional Oncological Dispensary; Barnaul, 656049, Russian Federation 656049, Barnaul, Russian Federation; Barnaul, 656049, Russian Federation; Barnaul, 656038, Russian Federation

E. I Pupkova

Altai Regional Oncology Dispensary

Barnaul, 656049, Russian Federation

L. M Bazulina

Altai Regional Oncology Dispensary

Barnaul, 656049, Russian Federation

A. F Lazarev

Altai Branch of N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center; Altai Regional Oncology Dispensary; The Altai State Medical University

656049, Barnaul, Russian Federation; Barnaul, 656049, Russian Federation; Barnaul, 656038, Russian Federation

References

  1. Злокачественные опухоли. Международный ежеквартальный научно-практический журнал по онкологии. 2015; (4, спец. выпуск): 1-456. doi: 10.18027/2224-5057-2015-4s - 456
  2. Paez J.G., Jдnne P.A., Lee J.C., Tracy S., Greulich H., Gabriel S. et al. EGFR mutations in lung cancer: correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science. 2004; 304(5676): 1497-500.
  3. Pao W., Miller V., Zakowski M., Doherty J., Politi K., Sarkaria I. et al. EGF receptor gene mutations are common in lung cancers from «never smokers» and are associated with sensitivity of tumors to gefitinib and erlotinib. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101(36): 13306-11.
  4. Mok T.S., Wu Y.L., Thongprasert S., Yang C.H., Chu D.T., Saijo N. et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N. Engl. J. Med. 2009; 361(10): 947-57. doi: 10.1056/NEJMoa0810699
  5. Rosell R., Carcereny E., Gervais R., Vergnenegre A., Massuti B., Felip E. et al. Spanish Lung Cancer Group in collaboration with Groupe Franзais de Pneumo-Cancйrologie and Associazione Italiana Oncologia Toracica. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 2012; 13(3): 239-46. doi: 10.1016/S1470-2045(11)70393-X
  6. Имянитов Е.Н. Наследственный рак молочной железы. Практическая онкология. 2010; 11(4): 258-66.
  7. Prat J. Ovarian carcinomas: five distinct diseases with different origins, genetic alterations, and clinicopathological features. Virchows Arch. 2012; 460(3): 237-49. doi: 10.1007/s00428-012-1203-5
  8. Kaldawy A., Segev Y., Lavie O., Auslender R., Sopik V., Narod S.A. Low-grade serous ovarian cancer: A review. Gynecol. Oncol. 2016; 143(2): 433-8. doi: 10.1016/j.ygyno.2016.08.320
  9. Combe P., Chauvenet L., Lefrere-Belda M.A., Blons H., Rousseau C., Oudard S., et al. Sustained response to vemurafenib in a low grade serous ovarian cancer with a BRAF V600E mutation. Invest. New Drugs. 2015; 33(6): 1267-70. doi: 10.1007/s10637-015-0297-4
  10. Byrski T., Gronwald J., Huzarski T., Grzybowska E., Budryk M., Stawicka M. et al. Pathologic complete response rates in young women with BRCA1-positive breast cancer after neoadjuvantchemotherapy. J. Clin. Oncol. 2010; 28(3): 375-9. doi: 10.1200/JCO.2008.20.7019
  11. Любченко Л.Н., Батенева Е.И., Абрамов И.С., Емельянова М.А., Будик Ю.А., Тюляндина А.С. и др. Наследственный рак молочной железы и яичников. Злокачественные опухоли. 2013; (2): 53-61. doi: 10.18027/2224-5057-2013-2-53-61
  12. Демидова И.А. Наследственно обусловленный рак яичников. Современная онкология. 2015; 17(3): 70-5.
  13. Ledermann J., Harter P., Gourley C., Friedlander M., Vergote I., Rustin G. et al. Olaparib maintenance therapy in platinum-sensitive relapsed ovarian cancer. N. Engl. J. Med. 2012;366(15):1382-92. doi: 10.1056/NEJMoa1105535
  14. Торопова Н.Е., Закамова Е.В., Тетерина Ю.Ю., Козлов С.В., Тимофеева Н.В., Морошкина Г.П. и др. Молекулярно-генетические исследования в практике онкологической клиники. Известия Самарского научного центра РАН. 2015; (2-3): 690-6.
  15. Consensus for EGFR mutation testing in NSCLC: results of European Workshop. J. Thorac. Oncol. 2010; 5: 1706-13.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2017 Eco-Vector


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ПИ № ФС 77 - 86496 от 11.12.2023 г. 
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: ЭЛ № ФС 77 - 80673 от 23.03.2021 г.


This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies