SENSITIVITY OF HUMAN TUMORS WITH VARIOUS EXPRESSION OF RECAF RECEPTOR TO AFP-CONTAINING COMPLEX OF AIMPILA IN VIVO

Full Text

Препарат АИМПИЛА представляет собой запатентованный в России нековалентный комплекс, состоящий из транспортного белка альфа-фетопротеина (АФП) с онкоспецифичным гликозилированием и цитостатической группы, индуцирующей апоптоз. Препарат пероральный, направлен на рецепторы АФП (receptor alfa fetoprotein, ReCAF) и ориентирован соответственно государственному контракту №13411.1008799.13.166 от 31.07.2013 на лечение колоректального, в том числе метастазирующего, рака [«Трансфер зарубежных разработок лекарственного средства на основе нековалентного комплекса транспортного белка, обладающего онкоспецифичным гликозилированием, и агента, индуцирующего апоптоз раковых клеток, для лечения колоректального, в том числе метастазирующего, рака, и проведение его доклинических и клинических исследований». Шифр «2.3 Белковый комплекс 2013»]. Нековалентные комплексы, особенно с цитостатической группой, рекомендованы для введения в желудок [1]. Для АИМПИЛА нами показано, что при пероральном введении крысам он интернализуется в тонкой кишке [2]. Препарат оказался неактивым in vitro и in vivo на опухолевых моделях, не содержащих рецепторы АФП [3]. Действие АИМПИЛА на рост ReCAF-положительных опухолей человека ранее не изучали. Соответственно исследования проведены на трёх штаммах подкожных (п/к) ксенографтов опухолей человека с разным содержанием ReCAF: рака ободочной кишки SW620/ReCAF+, рака печени HepG2/ ReCAF++ и рака молочной железы T47D/ReCAF+++. Материал и методы Иммунодефицитные мыши. Для экспериментов с п/к ксенографтами использованы 8-недельные половозрелые мыши-самки и самцы Balb/c nude массой 20- 22 г из разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» [4]. Мышей содержали в условиях специализированного кондиционированного вивария ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» в макролоновых клетках с твердым основанием, аксессуарами и аэросистемой (бумажный фильтр, бутылка внутри, Cage Type II - Hood of open design) фирмы «EHRETGNBA» (Германия) со свободным доступом к воде. В день начала опыта всех мышей взвешивали на электронных весах MW-Tseries, User’s Manual («CAS», США), цена деления 0,01 г под контролем стандартной динамики прироста массы. Для введения в эксперимент мышей перед началом лечения делили на группы по 8-10 особей. Опухолевые модели. Использовали линию перевиваемого рака молочной железы человека, штамм T47D (исходная линия клеток из ATCC® Cat. No HTB-133™), перевиваемого рака ободочной кишки, штамм SW620 (исходная линия клеток из ATCC® Cat. No CCL-227™) и рака печени человека, штамм HepG2 (исходная линия из ATCC® Cat. No HB-8065™). Штаммы опухолей и культуру клеток получали из Коллекции опухолевых штаммов человека РОНЦ им. Н.Н. Блохина [5]. Трансплантацию опухоли выполняли мышам - самкам или самцам Balb/c nude под кожу бока по 40 мг опухолевой ткани в 0,5 мл питательной среды 199. Клеточную суспензию имплантировали мышам под кожу бока по 0,2 мл, что составляло 12·106 опухолевых клеток на мышь. Исследуемый препарат. АИМПИЛА в виде 5% (50 мг/мл) стокового раствора вводили в желудок металлическим зондом 5-10-кратно ежедневно в диапазоне суммарных доз от 1,0 до 4,0 мг/кг. Дозы препарата рассчитаны индивидуально на мышь. Лечение начинали через 48 ч после перевивки. Мыши контрольных групп получали соответствующий растворитель в адекватном объеме и режиме применения. Оценка эффективности лечения. После окончания лечения у всех мышей троекратно измеряли объемы опухолей, на каждый срок рассчитывали средний объём по формуле: Vср = a·• b·• c. Для ксенографтов использован стандартный критерий T/C < 42% (treatment/control), рассчитанный по соотношению средних объёмов опухолей [6]. Патоморфологическое исследование. Под контролем ряда показателей лечебного патоморфоза (ЛП) в сравнении с опухолью без лечения (контроль) исследованию подвергнуты срезы опухолевых узлов T47D/ReCAF+++ от мышей, получавших АИМПИЛА в суммарной дозе 1,0 мг/кг. Исследованы образцы опухолей (n = 18), взятые от мышей на 12-е сутки после окончания эффективного лечения АИМПИЛА (n = 9) и от контрольных мышей на 18-е сутки роста (КРО) (n = 9). С помощью стандартной гистологической окраски при световой микроскопии изучены следующие морфологические особенности опухоли: структура, показатели программированной и некротической гибели клеток, пролиферативная активность и степень полиформизма. Оценка переносимости воздействия. Проведена по состоянию и поведению мышей в процессе эксперимента, следили за гибелью от токсичности. Статистическая обработка результатов. Результаты исследования подвергнуты статистической обработке путём расчёта критерия t Стьюдента с помощью компьютерных программ Excel 2013 и Excel для Windows 2007. Значимыми считали различия при p < 0,05. Расчетные статистические величины приведены в таблицах. Завершение экспериментов. После завершения экспериментов животных умерщвляли посредством передозировки эфирного наркоза при соблюдении гуманных методов обращения, принятых в РФ. Павших или умерщвлённых мышей с соблюдением гуманных методов подвергали аутопсии для выявления визуальных патологических изменений внутренних органов [7, 8]. Результаты T47D/ReCAF+++ Показано, что п/к ксенографты без лечения в группе КРО растут достаточно быстро, опухолевые узлы увеличивались в период наблюдения более чем в 10 раз. АИМПИЛА при всех изученных суммарных дозах в режиме 5-кратного лечения (рис. 1) вызывал достоверное (p < 0,05), но кратковременное ингибирование роста T47D только в 1-е сутки после окончания лечения. Эффективность при суммарных дозах 0,5, 1,0 и 2,0 мг/кг на этот срок составила T/C = 33%, T/C = 44% и T/C = 18% соответственно. Переносимость 5-кратного курса лечения АИМПИЛА была удовлетворительной во всех случаях без побочных эффектов. Данные на T47D, полученные при 10-кратном курсе лечения АИМПИЛА в трех суммарных дозах от 1,0 до 4,0 мг/кг, представлены на рис. 2. Видно, что оценка эффективности лечения выполнена в более поздние сроки роста опухолевых узлов, размеры которых к началу измерений были больше исходных в 6,6 раза и увеличивались в период наблюдения в 2,8 раза. На этом фоне при применении АИМПИЛА в суммарных дозах 1,0-2,0-4,0 мг/кг при 10-кратном лечении получен достоверный (p < 0,05) противоопухолевый эффект во все сроки после окончания лечения. Соответственно ингибирование роста достигло T/C = 37-43%, T/C = 26-32% и T/C = 15-37% в прямой зависимости от величины суммарной дозы. Переносимость 10-кратного курса лечения АИМПИЛА была удовлетворительной без побочных эффектов. HepG2/ReCAF++ АИМПИЛА вводили мышам 5-кратно (2-6-е сутки после трансплантации) в разовой дозе 0,2 мг/кг, суммарно 1,0 мг/кг. Наблюдение продолжали в течение 21 сут после трансплантации опухоли с трёхкратным измерением опухолевых узлов. Результаты исследования приведены на рис. 3. На представленной иллюстрации видно, что п/к ксенографты HepG2 без лечения растут достаточно быстро, и начиная с 15-х суток после трансплантации опухолевые узлы увеличиваются в 10 раз в течение 3 нед после трансплантации. В группе мышей, получившей АИМПИЛА, наблюдали недостоверное ингибирование роста опухоли, Vср = 19,9 ± 14,3 мм3 против Vср = 39,3 ± 30,1 мм3 в 1-е сутки, Vср = 112,9 ± 97,2 мм3 против Vср = 70,4 ± 46,0 мм3 на 3-и сутки и Vср = 247,7 ± 147,9 мм3 против Vср = 386,86 ± 329,78 мм3 (p > 0,05) на 7-е сутки после окончания лечения. Соответственно T/C = 50, 62 и 64% (p > 0,05). Переносимость лечения АИМПИЛА была удовлетворительной без побочных эффектов. Таким образом, АИМПИЛА в разовой дозе 0,2 мг/кг при ежедневном пероральном введении в течение 5 дней (суммарно 1,0 мг/кг) вызывает недостоверный противоопухолевый эффект на уровне T/C = 50-64% (p = 0,05-0,1) на п/к ксенографтах рака печени человека HepG2. SW620/ReCAF+ АИМПИЛА в разовых дозах 0,1, 0,2 и 0,4 мг/кг (суммарно 1,0, 2,0 и 4,0 мг/кг) вводили мышам ежедневно на 4-14-е сутки после трансплантации опухоли. Наблюдение продолжали в течение 7 сут после окончания лечения с двукратным измерением опухолевых узлов. П/к ксенографты рака ободочной кишки человека SW620 без лечения на 11-е сутки после трансплантации достигли объёма Vср = 1565 ± 677 мм3 и Vср = 2747 ± 1061 мм3 к окончанию опыта. Под действием 10-кратного курса АИМПИЛА в диапазоне доз значимый противоопухолевый эффект не достигнут, T/C = 70-88%. При этом в 1-е и 5-е сутки после окончания лечения независимо от величины применённой дозы размеры опухолей были все же достоверно меньше контрольных, T/C = 70-72% (p < 0,05). Переносимость лечения была удовлетворительной (рис. 4, табл. 1). Патоморфологическая картина T47D/ReCAF+++ Показано, что в опухоли под действием АИМПИЛА на фоне значимого ингибирования её роста (в группе АИМПИЛА) при снижении пролиферативной активности и степени клеточного полиморфизма в опухоли многократно и достоверно (p = 0,000) усилены процессы апоптоза и некроза. В группе АИМПИЛА в сравнении с группой КРО (табл. 2): • средний диаметр среза 0,67 ± 0,1 см против 1,6 ± 0,17 см (уменьшение в 2,4 раза); • количество клеток в митозе 0,39 ± 0,09% против 2,8% (уменьшение в 9,6 раза); • количество клеток с признаками апоптоза 1,8 ± 0,16% против 0,29% (увеличение в 6,2 раза); • зона некротического поражения 24,1% против 12,1% (увеличение в 2 раза); • двукратное уменьшение степени полиформизма. Заключение Полученные количественные данные являются морфологическим подтверждением ингибирующего действия АИМПИЛА на рост п/к ксенографтов. Индукцию апоптоза и блокирование митоза, показавших многократную положительную антипролиферативную динамику под действием АИМПИЛА, можно обсуждать в качестве возможных механизмов ингибирования. Эксперименты проведены с нековалентным комплексом АИМПИЛА, направленным на рецепторы АФП (ReCAF). Использованы подкожные ксенографты опухолей человека с разным содержанием ReCAF, трансплантированные иммунодефицитным мышам Balb/cnude: рак ободочной кишки SW620/ReCAF+, рак печени HepG2/ReCAF++ и рак молочной железы T47D/ReCAF+++. АИМПИЛА вводили, начиная на 4-й день после перевивки опухоли, перорально ежедневно 5-ти кратно или 10-ти кратно в суммарных дозах 0,5-2,0 мг/кг или 1,0-4,0 мг/кг, соответственно. Показано, что ингибирование роста опухоли (критерий T/C < 42%) под действием АИМПИЛА возрастает в зависимости от содержания ReCAF:T/C = 70% (SW620/ReCAF+), T/C = 51% (HepG2/ReCAF++) и T/C = 22% (T47D/ReCAF+++). На наиболее чувствительной модели в серии опытов как оптимальный определён 10-кратный курс введения в суммарной дозе 4,0 мг/кг, позволяющий получить T/C = 15-37% (p < 0,05). При патоморфологическом исследовании срезов T47D/ReCAF+++ верифицирована гибель большинства опухолевых клеток под действием АИМПИЛА через механизм апоптоза.

About the authors

Galina B. Smirnova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: gsmir53@yandex.ru
MD, PhD, Senior Researcher of the Laboratory of Combination Therapy of Tumors of the Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors, Moscow, 115478, Russian Federation Moscow, 115478, Russian Federation

S. A Tsurkan

Pharmaceutical Research Center «Pharmaccess»

Moscow, 127322, Russian Federation

Yu. A Borisova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

J. R Tcherkassova

Pharmaceutical Research Center «Pharmaccess»

Moscow, 127322, Russian Federation

V. I Romanenko

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

M. S Kalishian

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

H. M Treshalina

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

References

Supplementary files