SENSITIVITY OF HUMAN TUMORS WITH VARIOUS EXPRESSION OF RECAF RECEPTOR TO AFP-CONTAINING COMPLEX OF AIMPILA IN VIVO

全文:

Препарат АИМПИЛА представляет собой запатентованный в России нековалентный комплекс, состоящий из транспортного белка альфа-фетопротеина (АФП) с онкоспецифичным гликозилированием и цитостатической группы, индуцирующей апоптоз. Препарат пероральный, направлен на рецепторы АФП (receptor alfa fetoprotein, ReCAF) и ориентирован соответственно государственному контракту №13411.1008799.13.166 от 31.07.2013 на лечение колоректального, в том числе метастазирующего, рака [«Трансфер зарубежных разработок лекарственного средства на основе нековалентного комплекса транспортного белка, обладающего онкоспецифичным гликозилированием, и агента, индуцирующего апоптоз раковых клеток, для лечения колоректального, в том числе метастазирующего, рака, и проведение его доклинических и клинических исследований». Шифр «2.3 Белковый комплекс 2013»]. Нековалентные комплексы, особенно с цитостатической группой, рекомендованы для введения в желудок [1]. Для АИМПИЛА нами показано, что при пероральном введении крысам он интернализуется в тонкой кишке [2]. Препарат оказался неактивым in vitro и in vivo на опухолевых моделях, не содержащих рецепторы АФП [3]. Действие АИМПИЛА на рост ReCAF-положительных опухолей человека ранее не изучали. Соответственно исследования проведены на трёх штаммах подкожных (п/к) ксенографтов опухолей человека с разным содержанием ReCAF: рака ободочной кишки SW620/ReCAF+, рака печени HepG2/ ReCAF++ и рака молочной железы T47D/ReCAF+++. Материал и методы Иммунодефицитные мыши. Для экспериментов с п/к ксенографтами использованы 8-недельные половозрелые мыши-самки и самцы Balb/c nude массой 20- 22 г из разведения ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» [4]. Мышей содержали в условиях специализированного кондиционированного вивария ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» в макролоновых клетках с твердым основанием, аксессуарами и аэросистемой (бумажный фильтр, бутылка внутри, Cage Type II - Hood of open design) фирмы «EHRETGNBA» (Германия) со свободным доступом к воде. В день начала опыта всех мышей взвешивали на электронных весах MW-Tseries, User’s Manual («CAS», США), цена деления 0,01 г под контролем стандартной динамики прироста массы. Для введения в эксперимент мышей перед началом лечения делили на группы по 8-10 особей. Опухолевые модели. Использовали линию перевиваемого рака молочной железы человека, штамм T47D (исходная линия клеток из ATCC® Cat. No HTB-133™), перевиваемого рака ободочной кишки, штамм SW620 (исходная линия клеток из ATCC® Cat. No CCL-227™) и рака печени человека, штамм HepG2 (исходная линия из ATCC® Cat. No HB-8065™). Штаммы опухолей и культуру клеток получали из Коллекции опухолевых штаммов человека РОНЦ им. Н.Н. Блохина [5]. Трансплантацию опухоли выполняли мышам - самкам или самцам Balb/c nude под кожу бока по 40 мг опухолевой ткани в 0,5 мл питательной среды 199. Клеточную суспензию имплантировали мышам под кожу бока по 0,2 мл, что составляло 12·106 опухолевых клеток на мышь. Исследуемый препарат. АИМПИЛА в виде 5% (50 мг/мл) стокового раствора вводили в желудок металлическим зондом 5-10-кратно ежедневно в диапазоне суммарных доз от 1,0 до 4,0 мг/кг. Дозы препарата рассчитаны индивидуально на мышь. Лечение начинали через 48 ч после перевивки. Мыши контрольных групп получали соответствующий растворитель в адекватном объеме и режиме применения. Оценка эффективности лечения. После окончания лечения у всех мышей троекратно измеряли объемы опухолей, на каждый срок рассчитывали средний объём по формуле: Vср = a·• b·• c. Для ксенографтов использован стандартный критерий T/C < 42% (treatment/control), рассчитанный по соотношению средних объёмов опухолей [6]. Патоморфологическое исследование. Под контролем ряда показателей лечебного патоморфоза (ЛП) в сравнении с опухолью без лечения (контроль) исследованию подвергнуты срезы опухолевых узлов T47D/ReCAF+++ от мышей, получавших АИМПИЛА в суммарной дозе 1,0 мг/кг. Исследованы образцы опухолей (n = 18), взятые от мышей на 12-е сутки после окончания эффективного лечения АИМПИЛА (n = 9) и от контрольных мышей на 18-е сутки роста (КРО) (n = 9). С помощью стандартной гистологической окраски при световой микроскопии изучены следующие морфологические особенности опухоли: структура, показатели программированной и некротической гибели клеток, пролиферативная активность и степень полиформизма. Оценка переносимости воздействия. Проведена по состоянию и поведению мышей в процессе эксперимента, следили за гибелью от токсичности. Статистическая обработка результатов. Результаты исследования подвергнуты статистической обработке путём расчёта критерия t Стьюдента с помощью компьютерных программ Excel 2013 и Excel для Windows 2007. Значимыми считали различия при p < 0,05. Расчетные статистические величины приведены в таблицах. Завершение экспериментов. После завершения экспериментов животных умерщвляли посредством передозировки эфирного наркоза при соблюдении гуманных методов обращения, принятых в РФ. Павших или умерщвлённых мышей с соблюдением гуманных методов подвергали аутопсии для выявления визуальных патологических изменений внутренних органов [7, 8]. Результаты T47D/ReCAF+++ Показано, что п/к ксенографты без лечения в группе КРО растут достаточно быстро, опухолевые узлы увеличивались в период наблюдения более чем в 10 раз. АИМПИЛА при всех изученных суммарных дозах в режиме 5-кратного лечения (рис. 1) вызывал достоверное (p < 0,05), но кратковременное ингибирование роста T47D только в 1-е сутки после окончания лечения. Эффективность при суммарных дозах 0,5, 1,0 и 2,0 мг/кг на этот срок составила T/C = 33%, T/C = 44% и T/C = 18% соответственно. Переносимость 5-кратного курса лечения АИМПИЛА была удовлетворительной во всех случаях без побочных эффектов. Данные на T47D, полученные при 10-кратном курсе лечения АИМПИЛА в трех суммарных дозах от 1,0 до 4,0 мг/кг, представлены на рис. 2. Видно, что оценка эффективности лечения выполнена в более поздние сроки роста опухолевых узлов, размеры которых к началу измерений были больше исходных в 6,6 раза и увеличивались в период наблюдения в 2,8 раза. На этом фоне при применении АИМПИЛА в суммарных дозах 1,0-2,0-4,0 мг/кг при 10-кратном лечении получен достоверный (p < 0,05) противоопухолевый эффект во все сроки после окончания лечения. Соответственно ингибирование роста достигло T/C = 37-43%, T/C = 26-32% и T/C = 15-37% в прямой зависимости от величины суммарной дозы. Переносимость 10-кратного курса лечения АИМПИЛА была удовлетворительной без побочных эффектов. HepG2/ReCAF++ АИМПИЛА вводили мышам 5-кратно (2-6-е сутки после трансплантации) в разовой дозе 0,2 мг/кг, суммарно 1,0 мг/кг. Наблюдение продолжали в течение 21 сут после трансплантации опухоли с трёхкратным измерением опухолевых узлов. Результаты исследования приведены на рис. 3. На представленной иллюстрации видно, что п/к ксенографты HepG2 без лечения растут достаточно быстро, и начиная с 15-х суток после трансплантации опухолевые узлы увеличиваются в 10 раз в течение 3 нед после трансплантации. В группе мышей, получившей АИМПИЛА, наблюдали недостоверное ингибирование роста опухоли, Vср = 19,9 ± 14,3 мм3 против Vср = 39,3 ± 30,1 мм3 в 1-е сутки, Vср = 112,9 ± 97,2 мм3 против Vср = 70,4 ± 46,0 мм3 на 3-и сутки и Vср = 247,7 ± 147,9 мм3 против Vср = 386,86 ± 329,78 мм3 (p > 0,05) на 7-е сутки после окончания лечения. Соответственно T/C = 50, 62 и 64% (p > 0,05). Переносимость лечения АИМПИЛА была удовлетворительной без побочных эффектов. Таким образом, АИМПИЛА в разовой дозе 0,2 мг/кг при ежедневном пероральном введении в течение 5 дней (суммарно 1,0 мг/кг) вызывает недостоверный противоопухолевый эффект на уровне T/C = 50-64% (p = 0,05-0,1) на п/к ксенографтах рака печени человека HepG2. SW620/ReCAF+ АИМПИЛА в разовых дозах 0,1, 0,2 и 0,4 мг/кг (суммарно 1,0, 2,0 и 4,0 мг/кг) вводили мышам ежедневно на 4-14-е сутки после трансплантации опухоли. Наблюдение продолжали в течение 7 сут после окончания лечения с двукратным измерением опухолевых узлов. П/к ксенографты рака ободочной кишки человека SW620 без лечения на 11-е сутки после трансплантации достигли объёма Vср = 1565 ± 677 мм3 и Vср = 2747 ± 1061 мм3 к окончанию опыта. Под действием 10-кратного курса АИМПИЛА в диапазоне доз значимый противоопухолевый эффект не достигнут, T/C = 70-88%. При этом в 1-е и 5-е сутки после окончания лечения независимо от величины применённой дозы размеры опухолей были все же достоверно меньше контрольных, T/C = 70-72% (p < 0,05). Переносимость лечения была удовлетворительной (рис. 4, табл. 1). Патоморфологическая картина T47D/ReCAF+++ Показано, что в опухоли под действием АИМПИЛА на фоне значимого ингибирования её роста (в группе АИМПИЛА) при снижении пролиферативной активности и степени клеточного полиморфизма в опухоли многократно и достоверно (p = 0,000) усилены процессы апоптоза и некроза. В группе АИМПИЛА в сравнении с группой КРО (табл. 2): • средний диаметр среза 0,67 ± 0,1 см против 1,6 ± 0,17 см (уменьшение в 2,4 раза); • количество клеток в митозе 0,39 ± 0,09% против 2,8% (уменьшение в 9,6 раза); • количество клеток с признаками апоптоза 1,8 ± 0,16% против 0,29% (увеличение в 6,2 раза); • зона некротического поражения 24,1% против 12,1% (увеличение в 2 раза); • двукратное уменьшение степени полиформизма. Заключение Полученные количественные данные являются морфологическим подтверждением ингибирующего действия АИМПИЛА на рост п/к ксенографтов. Индукцию апоптоза и блокирование митоза, показавших многократную положительную антипролиферативную динамику под действием АИМПИЛА, можно обсуждать в качестве возможных механизмов ингибирования. Эксперименты проведены с нековалентным комплексом АИМПИЛА, направленным на рецепторы АФП (ReCAF). Использованы подкожные ксенографты опухолей человека с разным содержанием ReCAF, трансплантированные иммунодефицитным мышам Balb/cnude: рак ободочной кишки SW620/ReCAF+, рак печени HepG2/ReCAF++ и рак молочной железы T47D/ReCAF+++. АИМПИЛА вводили, начиная на 4-й день после перевивки опухоли, перорально ежедневно 5-ти кратно или 10-ти кратно в суммарных дозах 0,5-2,0 мг/кг или 1,0-4,0 мг/кг, соответственно. Показано, что ингибирование роста опухоли (критерий T/C < 42%) под действием АИМПИЛА возрастает в зависимости от содержания ReCAF:T/C = 70% (SW620/ReCAF+), T/C = 51% (HepG2/ReCAF++) и T/C = 22% (T47D/ReCAF+++). На наиболее чувствительной модели в серии опытов как оптимальный определён 10-кратный курс введения в суммарной дозе 4,0 мг/кг, позволяющий получить T/C = 15-37% (p < 0,05). При патоморфологическом исследовании срезов T47D/ReCAF+++ верифицирована гибель большинства опухолевых клеток под действием АИМПИЛА через механизм апоптоза.

作者简介

Galina Smirnova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: gsmir53@yandex.ru
MD, PhD, Senior Researcher of the Laboratory of Combination Therapy of Tumors of the Research Institute of Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors, Moscow, 115478, Russian Federation Moscow, 115478, Russian Federation

S. Tsurkan

Pharmaceutical Research Center «Pharmaccess»

Moscow, 127322, Russian Federation

Yu. Borisova

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

J. Tcherkassova

Pharmaceutical Research Center «Pharmaccess»

Moscow, 127322, Russian Federation

V. Romanenko

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

M. Kalishian

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

H. Treshalina

N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Moscow, 115478, Russian Federation

参考

补充文件