COMPARATIVE EVALUATION OF THE RESULTS OF IMMUNOFLUORESCENCE AND HEMOFILTROCYTOLOGICAL RESEARCH IN CANCER PATIENTS

Full Text

Современные достижения науки и техники существенно расширили возможности распознавания злокачественных новообразований (ЗНО), тем не менее не ослабевает интерес исследователей к циркулирующим раковым клеткам (ЦРК), обусловленный постоянным поиском новых, более совершенных методов диагностики. При специальном поиске клеток в циркулирующей крови обнаружить их удаётся далеко не всегда. Традиционные биологические методы обнаружения карцинемии, суть которых заключается в перевивке подопытным животным опухоли кровью, говорят о том, что карцинемия - закономерное явление. В ряде случаев перевиваемость опухоли кровью достигала 100% [1]. Однако, учитывая, что количество ЦРК очень малое, для их точного определения и наблюдения в динамике должны применятся надёжные системы, характеризующиеся высокой воспроизводимостью. На сегодняшний день таких пригодных для клинического использования систем немного. Одна из них система CellSearch - это полуавтоматический аппарат, использующий иммуномагнитную сорбцию для определения ЦРК. Достоинства этой системы - воспроизводимость данных в разных лабораториях и возможность идентификации ЦРК при различных типах рака [2]. Более новые технологии извлекают преимущества из особых антигенов с эпителиальным покрытием, как молекула адгезии эпителиальной клетки (EpCAM) для избирательного захвата ЦРК. CellSearch - единственная одобренная Американской администрацией по контролю продуктов и лекарств автоматизированная система для захвата и оценки ЦРК с целью прогнозирования и мониторинга лечения при метастатическом раке молочных желёз, простаты и колоректальном раке. Метод основан на иммуномагнитном разделении [3-5], при котором EpCAM - сопряжённые магнитные шарики используются для захвата EpCAM - положительных ЦРК из крови под воздействием магнитного поля. И хотя множество клинических исследований подтверждали его прогнозную значимость, анализ дорогостоящий и трудозатратный, что, к сожалению, ограничивает его более широкое использование. Выделение ЦРК из венозной крови на основе размера раковой клетки при микрофильтрации проявило себя как потенциально эффективный, недорогой и быстрый способ выделения раковых клеток [6-9]. Материал и методы У онкологических больных со злокачественными новообразованиями органов брюшной полости и лёгкого для выявления ЦРК в периферической венозной крови был применён гемофильтроцитологический метод исследования (патент на изобретение № 2425385 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам). Метод заключается в проведении микрофильтрации периферической венозной крови с последующим цитологическим исследованием отпечатка фильтрата венозной крови с целью определения в нём ЦРК. Микрофильтрация проводится с помощью устройства для микропросеивания крови, в котором применён фильтр с диаметром пор 6000 нанометров (патент на изобретение № 2414710 Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам). Для проведения гемофильтроцитологического исследования венозную, стабилизированную ЭДТА кровь в количестве 12 мл, полученную от каждого из онкологических больных со ЗНО различной локализации, пропускали через нанофильтр с диаметром пор 6000 нм. Клетки, задержавшиеся на фильтре, наносили на предметное стекло. С каждого образца отфильтрованной крови делали по 3 мазка-отпечатка. Результат исследования считался положительным (+), если в мазках-отпечатках определялись циркулирующие раковые клетки и, соответственно, отрицательным (-), если циркулирующие раковые клетки в них не находили. Иммунофлюоресцентным методом была проведена оценка наличия EpCam (CD326)-положительных клеток в 24 мазках-отпечатках, полученных с помощью устройства для микропросеивания крови. Оценку наличия EpCam (CD326)-положительных клеток проводили методом иммунофлюоресценции на флюоресцентном микроскопе Axiostarplus («CarlZeiss», Германия). Для этого фиксированные мазки-отпечатки обрабатывали протеиназой К («Dako», Дания) 15 мин при 37°С, отмывали PBS, затем проводили инкубацию с флюоресцентным ядерным красителем PI (Invitrogen, США) и моноклональными антителами против человеческого EpCam (CD326) (клон B29.1 (VU-ID9)), меченных FITC («Abcam», Великобритания) в концентрации 5 мкг/мл. Результат считался положительным при наличии клеток, имеющих ядерное красное окрашивание (PI) совместно с зелёной меткой (EpCam-FITC). Результаты и обсуждения Как видно из таблицы, при проведении гемофильтроцитологического исследования периферической венозной крови у всех 8 онкологических больных были выделены циркулирующие раковые клетки. Как было выше сказано, с образца отфильтрованной крови каждого больного делали 3 мазка-отпечатка. Результаты распределились следующим образом: у 3 больных во всех 3 мазках-отпечатках (№ 3а-3в; 4а-4в и 5а-5в), у 4 пациентов в 2 мазках-отпечатках (№ 1а, 1в; 6а, 6в; 7а, 7в; 8а и 8б) и 1 больного в 1 мазке-отпечатке (№ 2б) обнаружены ЦРК. Такие разные результаты исследования объясняются неодинаковой стадией развития злокачественных новообразований у обследованных больных. Существует прямая связь между стадией заболевания и степенью выраженности карцинемии: чем выше стадия, тем больше количество ЦРК в единице объёма периферического сосудистого русла [10]. Стадийность ЗНО, а также наличие или отсутствие метастазов в регионарных лимфоузлах у вышеуказанных пациентов подтверждены результатами патогистологического исследования операционного материала. Методом иммунофлюоресценции исследовано 24 цитологических мазка-отпечатка, полученных с помощью устройства для микропросеивания венозной крови с нанофильтром диаметром 6000 нм. С использованием мышиных монокальных антител против человеческого EpCAM (CD326) (клонD29.1 (VU-ID9)), меченных FITC, и ядерного флюоресцентного красителя PI на микроскопе Axiostarplus («СarlZeiss», Германия) определяли наличие циркулирующих раковых клеток в мазках-отпечатках. Поскольку мазков-отпечатков было 24, соответственно, всего было проведено методом иммунофлюоресценции 24 пробы-исследования. В результате исследования было установлено, что в 16 пробах из 24 наблюдалось наличие EpCAM-положительных клеток. В 6 пробах с мазками-отпечатками (№ 1-б, 2-а, 2-в, 6-б, 7-б и 8-в) с (-) результатами на ЦРК при проведении иммунофлюоресценции так же получены отрицательные результаты. В 2 пробах с мазками-отпечатками (№ 2б и 8б с (+) результатами на присутствие ЦРК) наличие EpCAM-положительных клеток при проведении исследования методом иммунофлюоресценции не установлено. Следовательно, процент совпадений всех результатов для 2 сопоставленных методов исследования как положительных на ЦРК, так и отрицательных составил 91,6%. Таким образом, результаты исследования методом иммунофлюоресценции подтверждают высокую эффективность выделения циркулирующих раковых клеток из венозной крови с помощью устройства для микропросеивания, имеющего нанофильтр с диаметром пор 6000 нм. На основании полученных данных можно прийти к следующим выводам: Ú гемофильтроцитологическое исследование, по сравнению с методом иммунофлюоресценции, является недорогим методом исследования; Ú гемофильтроцитологический метод исследования простой в исполнении, даёт в 2,5 раза быстрее результат по сравнению с методом иммунофлюоресценции; Ú гемофильтроцитологическое исследование - тоже эффективный метод исследования, мало уступающий иммунофлюоресцентному методу в точности определения циркулирующих раковых клеток.

About the authors

A. A Chimitov

Buryat Republic Clinical Oncology Dispensary

670047, Ulan-Ude, Republic of Buryatia, Russian Federation

J. N Shoihet

The Altai State Medical University

656043, Barnaul, Altai region, Russian Federation

S. V Strazhev

City Clinic #212 of the Moscow city Healthe Department

119620, Moscow, Russian Federation

A. F Lazarev

The Altai State Medical University

656043, Barnaul, Altai region, Russian Federation

T. D Khankhashanova

Buryat Republic Clinical Oncology Dispensary

670047, Ulan-Ude, Republic of Buryatia, Russian Federation

Tsiren S. Boldohonov

Buryat Republic Clinical Oncology Dispensary

Email: tsiren1993@yandex.ru
oncologist-radiotherapist of the Radiotherapy Department, Buryat Republic Clinical Oncology Dispensary, 670047, Ulan-Ude, Republic of Buryatia, Russian Federation 670047, Ulan-Ude, Republic of Buryatia, Russian Federation

References

Supplementary files