Matrix metalloproteinase MMP-7 as a new prognostic biomarker for gastric cancer

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время много внимания уделяется лечению рака желудка (РЖ), появляются новые подходы в терапии, которые значительно улучшают показатели выживаемости пациентов и улучшают их качество жизни [1]. Однако 5-летняя выживаемость всё ещё составляет менее 30%, поэтому поиск оптимального лечения — непростая задача для онкологов всего мира. У большинства пациентов РЖ диагностируется на поздних стадиях, для которых возможности лечения весьма ограничены. Единственным эффективным на ранней стадии лечением является хирургическое вмешательство, что зачастую существенно снижает качество жизни пациентов. Кроме того, замечена существенная вариабельность в прогнозе и ответе на терапию даже при условии диагностики заболевания на одной и той же стадии.

Гистологические, молекулярные и генетические характеристики каждого типа рака обеспечивают гетерогенность клинических исходов. 10 лет назад тактика ведения пациентов основывалась на гистологическом подтипе рака, сейчас же появилась возможность персонализированного подхода. С развитием представлений о молекулярно-генетическом профиле опухолей желудка это стало возможно и для лечения РЖ. Именно поэтому поиск универсальных биомаркёров, которые смогут дать информацию о прогнозе для пациентов, является предметом интереса учёных по всему миру [2].

В более чем 90% случаев смерть пациентов с солидными опухолями происходит из-за инвазии опухоли в стенки органа (и соседних органов) и метастазирование опухолевых клеток по всему организму. В процессе метастазирования и инвазии важную роль играет протеолитическая деградация внеклеточного матрикса [3]. Происходит это путём секреции опухолевыми клетками особых ферментов, которые способны разрушать мембрану клеток и способствовать клеточной адгезии [2], — матриксных металлопротеиназ (MMPs). Матриксные металлопротеиназы — это протеиназы, принадлежащие к семейству Zn-зависимых эндопептидаз, экспрессия которых наблюдается в опухолевой ткани. Металлопротеиназы играют важную роль в онкогенезе, инвазии и метастазировании [2, 3]. Семейство MMPs можно разделить на 5 различных групп, которые отличаются друг от друга специфическим субстратом и доминантной структурой [2].

MMP-7 — это эндопептидаза, также известная как матрилизин, которая является наименьшей молекулой среди всей семьи MMPs. Она тесно связана с опухолевой прогрессией, включая неограниченный рост клеток, инвазию, метастазирование и ангиогенез [2, 4]. MMP-7 вызывает деградацию внеклеточного матрикса путём разрушения таких макромолекул, как казеин, желатин (типов I, II, IV и V), фибронектин и протеогликаны [4]. Помимо деградации матрикса, MMP-7, как один из основных регуляторных ферментов, участвует в апоптозе. Основная функция регуляторных ферментов заключается в высвобождении Fas-лиганда (FasL) из мембраны, индукции апоптоза в соседних клетках и уменьшении способности раковых клеток в целом вступать в апоптоз [5].

Чрезмерная экспрессия MMP-7 была обнаружена в некоторых опухолях человека, включая рак молочной железы, толстой кишки, пищевода и желудка. Кроме того, многочисленные исследования показали, что наличие гиперэкспрессии MMP-7 связано с агрессивным фенотипом опухоли и ухудшает прогноз у пациентов с РЖ [2].

В данном исследовании мы решили проанализировать возможность использования экспрессии MMP-7 в качестве одного из факторов прогноза у больных РЖ.

Цель — исследование и выявление возможности использовать MMP-7 в качестве биомаркёра для формирования прогноза у больных РЖ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены образцы 80 пациентов с диагнозом «диффузный РЖ», которые проходили лечение в Университетской клинической больнице № 1 Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет) и в Государственном бюджетном учреждении здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского» в период с 2019 по 2022 год.

Для группы сравнения взяты 30 секционных образцов желудков. Основные критерии включения в основную группу (опухолевые образцы):

• пациенты с установленным диагнозом РЖ (стадии I–IIIC);
• оперативное вмешательство (гастрэктомия, резекция желудка) с лимфодиссекцией в объёме D2;
• гистологически подтверждённый диффузный РЖ.

Критерии исключения:

• генерализованные формы РЖ (стадия IV);
• первично-множественный рак;
• положительный край резекции после хирургического лечения;
• проведённое химиолучевое лечение РЖ.

Из 80 пациентов, включённых в исследование, гастрэктомия была выполнена у 55% (44 человека), а резекция желудка — у 45% (36 человек) (табл. 1).

 

Таблица 1. Характеристика пациентов, включённых в исследование

Table 1. Clinical characteristics of study participants

Признак	Количество больных (n=80 — 100%)
Пол
Мужской	50 (62,5%)
Женский	30 (37,5%)
Возраст
<50	11 (13,75%)
50–60	42 (65%)
>60	27 (31,25%)
Стадия рака желудка
IВ	11 (13,75%)
IIА	15 (18,75%)
IIВ	27 (33,75%)
IIIА	12 (15%)
IIIВ	8 (10%)
IIIС	7 (8,75%)
Сопутствующие заболевания
Ишемическая болезнь сердца	16 (20%)
Артериальная гипертония	11 (13,75%)
Нарушения сердечного ритма	8 (10%)
Постинфарктный кардиосклероз	7 (8,75%)
Хроническая обструктивная болезнь лёгких	8 (10%)
Другое	4 (5%)
Метастазы в регионарные лимфоузлы
нет	30 (37,5%)
N1	17 (21,25%)
N2	28 (35%)
N3	5 (6,25%)
Степень дифференцировки опухоли
G1	0
G2	35 (43,75%)
G3	31 (38,75%)
перстневидные клетки	14 (17,5%)
Классификация рака по Lauren
Интестинальный	0
Диффузный	80 (100%)
Локализация опухоли
Кардия	9 (11,25%)
Тело	44 (55%)
Антральный отдел	20 (25%)
Тело + антральный отдел	7 (8,75%)
Размеры опухоли
<2 см	12 (15%)
2–4 см	29 (36,25%)
>4 см	39 (48,75%)
Статус ECOG
0–1	68 (85%)
2	12 (15%)
3–4	0

Примечание. ECOG — шкала Eastern Cooperative Oncology Group.

Note. ECOG — Eastern Cooperative Oncology Group scale.

 

В группу сравнения были отобраны фрагменты, взятые из секционных желудков, в которых отсутствовали опухолевые клетки с признаками злокачественности. Причинами смерти пациентов были заболевания, не связанные с онкологией.

Материал был аннотирован с указанием локализации, клинической стадии, гистологического типа по классификации Лорена, наличия/отсутствия перстневидных клеток, метастазов в регионарные лимфатические узлы и отдалённых метастазов, а также стадии по классификации TNM (Tumor, Nodus and Metastasis). Образцы были взяты сразу после операции из трёх локализаций: непосредственно опухолевой ткани, пограничной неопухолевой ткани (отступом от опухоли в 5 см), а также из секционного желудка. Свежие образцы замораживали и хранили при температуре 80 °С, доставляли в лабораторию медицинской генетики человека Сеченовского Университета.

Анализ экспрессии MMP-7

Анализ экспрессии исследуемых генов проводили с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Нуклеотидные последовательности генов взяты из базы данных GenBank [16]. Проверку геноспецифичности праймеров осуществляли при помощи программ OLIGO Ver. 6.67 (Molecular Biology Insights, США) и Vector NTI (ThermoFisher Scientific, США).

Статистический анализ

Статистический анализ был выполнен с использованием платформы Statistica 13.1 (StatSoft, США). Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью критерия Шапиро–Уилка. Сравнение двух групп по количественному показателю, имеющему нормальное распределение, выполнялось с помощью t-критерия Стьюдента; трёх и более групп — с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Сравнение двух групп по количественному показателю, распределение которого отличалось от нормального, проводилось с помощью U-критерия Манна–Уитни; трёх и более групп — с помощью критерия Краскела–Уоллиса. Направление и тесноту корреляционной связи между двумя количественными показателями оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона (при нормальном распределении сопоставляемых показателей). Прогностическая модель, характеризующая зависимость количественной переменной от факторов, разрабатывалась с использованием метода линейной регрессии. Для анализа общей выживаемости применяли метод Каплана–Майера. Статистически значимыми считались различия при p <0,05.

Этический комитет

Исследование проводилось после одобрения независимым советом по этике. Все пациенты были включены в исследование после получения письменного добровольного информированного согласия.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия MMP-7 в опухолевой и неопухолевой тканях

На данный момент нет референсных значений, которые показывают, какой уровень экспрессии MMP-7 считать выше или ниже нормы. Мы сравнили полученные результаты с данными других исследований [2, 13, 14] и смогли рассчитать и принять в нашей работе уровень экспрессии 0,8±0,07 как высокий, а уровень экспрессии 0,40±0,067 — как низкий (рис. 1).

 

Рис. 1. Уровень экспрессии гена MMP-7 у пациентов с раком желудка в группе исследования в опухолевой и неопухолевой ткани.

Fig. 1. The level of MMP-7 gene expression in gastric cancer patients of the study group in tumor and neoplastic tissue.

 

Ассоциация экспрессии MMP-7 в опухолевой ткани с клинико-патологическими характеристиками пациентов

При сравнении показателей пола и возраста установить статистически значимых различий не удалось.

При сравнении уровня экспрессии MMP-7 в опухолевой ткани в зависимости от стадии заболевания (ТNM0) были выявлены статистически значимые различия (p <0,01). При I стадии заболевания уровень экспрессии MMP-7 был 0,73±0,2. При II–III стадиях — 0,98±0,07, что значительно выше, чем при I стадии. Вероятно, полученные данные могут говорить о роли MMP-7 как в инициации канцерогенеза, так и в увеличении объёма опухоли (рис. 2).

 

Рис. 2. Уровень экспрессии гена MMP-7 в зависимости от стадии рака желудка.

Fig. 2. The level of MMP-7 gene expression depending on the stage of the gastric cancer.

 

При сравнении уровня экспрессии MMP-7 в опухолевой ткани в зависимости от размера опухоли были выявлены статистически значимые различия (p <0,01). Показатель экспрессии гена MMP-7 при опухолях менее 2 см составил 0,75±0,1, тогда как при опухолях больше 4 см показатель статистически значимо увеличился до 0,9±0,15 (рис. 3). Из полученных данных мы можем сделать вывод, что увеличение размера опухоли определяется разрушением структурных компонентов внеклеточного матрикса, а также ускорением неоангиогенеза и блокированием апоптоза.

 

Рис. 3. Уровень экспрессии гена MMP-7 в зависимости от размера опухоли у пациентов с раком желудка.

Fig. 3. The level of MMP-7 MMP-7 gene expression depending on tumor size in patients with gastric cancer.

 

Следующим этапом мы определили уровни экспрессии исследуемого гена и поражение регионарных лимфатических узлов. В группе, где не было поражения лимфатических узлов, показатель экспрессии гена MMP-7 составил 0,74±0,09, а при наличии поражения лимфатических узлов — 0,84±0,13 (рис. 4).

 

Рис. 4. Экспрессия гена MMP-7 в зависимости от вовлечённости региональных лимфатических узлов у пациентов с раком желудка.

Fig. 4. The level of MMP-7 gene expression based on regional lymph node involvement in patients with gastric cancer.

 

Проанализировав результаты, можно говорить о том, что частота экспрессия гена MMP-7 возрастает с увеличением поражённых лимфатических узлов.

Ассоциации уровней экспрессии MMP-7 с выживаемостью пациентов с раком желудка

Для оценки связи между уровнем экспрессии MMP-7 и общей выживаемостью пациентов с РЖ мы использовали метод Каплана–Майера. В ходе исследования не было выявлено различий в показателях выживаемости у пациентов с разным уровнем экспрессии транскриптов. Пациенты с повышенной экспрессией MMP-7 в опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой тканью (T>N, где T — экспрессия в опухолевой ткани, N — экспрессия в неопухолевой ткани) имеют тенденцию к лучшему прогнозу, чем пациенты с низкой экспрессией MMP-7 в опухолевой ткани по сравнению с неопухолевой тканью (T<N).

ОБСУЖДЕНИЕ

На сегодняшний день не установлено биологических маркёров, которые могут влиять на прогноз пациентов с РЖ.

MMP-7 участвует во многих физиологических и патологических процессах, таких как рост, дифференциация, воспаление и ангиогенез [10–12]. Более того, важна роль MMP-7 в процессах опухолевой инвазии и метастазировании, что значительно ухудшает клиническое течение РЖ [2, 4, 6].

С целью изучения экспрессии MMP-7 в опухолевых образцах пациентов с РЖ мы оценили её вклад в развитие ключевых признаков рака с помощью базы данных LncACTdb [15]. Было выявлено, что MMP-7 участвует в активации инвазии и метастазирования, блокировании апоптоза, индукции ангиогенеза, а также в уклонении от онкосупрессии. Экспрессия изучаемого белка придаёт опухоли более агрессивный фенотип, способствуя деградации белков внеклеточного матрикса и разрушению других биомолекул в организме.

С применением молекулярно-генетических методов мы проанализировали экспрессию MMP-7 в образцах опухолевой и неопухолевой ткани пациентов после проведённого хирургического лечения. Были определены статистически значимые различия в экспрессии MMP-7 в опухолевых (p <0,001) и прилегающих неопухолевых (p <0,001) тканях относительно секционных образцов ткани желудка без патологии, что позволяет предположить её потенциальную диагностическую роль при РЖ. Интересно, что различия выявлены не только для опухолевой, но и для неопухолевой ткани желудка у людей с диффузным РЖ. Это может быть связано с вовлечением прилегающей ткани в опухолевый процесс и формированием поля канцеризации.

При исследовании связи экспрессии MMP-7 с клиническими характеристиками пациентов мы обнаружили достоверную ассоциацию уровня экспрессии MMP-7 в опухолевой ткани с распространённостью первичной опухоли. Экспрессия MMP-7 при местно-распространённом раке была достоверно выше по сравнению с ранними опухолями (p <0,01). Кроме того, экспрессия данного гена была достоверно выше, если были поражены регионарные лимфатические узлы (p <0,01). Эти две закономерности указывают на возможное влияние MMP-7 на прогрессию РЖ.

При оценке общей выживаемости с помощью метода Каплана–Майера не было выявлено достоверных различий у пациентов с разным уровнем экспрессии MMP-7. Опираясь на сведения, представленные в открытом источнике данных GEO и базе данных LOGpc, нам удалось установить, что пациенты с гиперэкспрессией MMP-7 в опухоли имеют худшие показатели выживаемости. Отсутствие достоверных различий в показателях выживаемости в нашем исследовании может быть связано с небольшой выборкой, включающей всего 80 пациентов с РЖ. Её увеличение, вероятно, позволит получить статистически значимые результаты.

В целом, результаты нашего исследования соответствуют результатам, полученным в других научных работах.

Несмотря на то, что прогностическое значение MMP-7 при РЖ активно изучается в последнее время, ввиду небольшого количества завершённых исследований пока нельзя точно утверждать, что данный биомаркёр можно использовать в клинической практике [3, 4]. Тем не менее исследование экспрессии данного гена даёт возможность определить его связь с клиническим течением РЖ и рассматривать как потенциальный прогностический маркёр.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты нашего исследования показали высокую экспрессию MMP-7 в опухолевых тканях при РЖ, что позволило нам установить корреляцию между экспрессией MMP-7 и неблагоприятным клиническим исходом. Мы считаем, что более глубокое изучение связи между экспрессией MMP-7 и течением РЖ приведёт к появлению новых парадигм и возможному улучшению терапии, а также созданию более персонализированного подхода в лечении.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении поисково-аналитической работы и подготовке рукописи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Наибольший вклад распределён следующим образом: А.Э. Киселева — обзор литературы, сбор клинических данных, написание текста; М.А. Анцупова — подготовка данных для генетических исследований, обзор литературы; А.В. Семенков — концепция исследования; И.И. Быков — статистическая обработка данных.

ADDITIONAL INFORMATION

Funding source. This publication was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. Kiseleva AE — literature review, collection of clinical data, writing a text; Antsupova MA — producing data for genetic research and literature; Semenkov AV — research concept; Bykov II — statistical data processing, study design.

About the authors

Alevtina E. Kiseleva

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Author for correspondence.
Email: kis-alevtina@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-6930-1261
Russian Federation, Moscow

Marina A. Antsupova

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University)

Email: marinaantsupova0203@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4632-1446
Russian Federation, Moscow

Aleksey V. Semenkov

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University); Moscow Regional Research and Clinical Institute

Email: semenkov_a_v@staff.sechenov.ru
ORCID iD: 0000-0002-7365-6081

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Igor I. Bykov

Federal Scientific and Clinical Center of Specialized Medical Care and Medical Technologies

Email: igor-vr@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8391-8885

MD, Dr. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files