Исследование активности топоизомеразы lia во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и пролиферацией (по выявлению аргирофильных белков ядрышкообразующих районов и антигена Ki-67) при плоскоклеточном раке легкого

Полный текст

Рак легкого занимает ведущее место в заболеваемости и смертности среди злокачественных новообразований. В группе немелкоклеточного рака легкого наибольшая часть представлена плоскоклеточным раком (практически 75%). Вместе с тем результаты лечения и выживаемости таких больных далеки от желаемых. В связи с чем ведется поиск клинико-морфологических и биомолекулярных параметров, связанных с про гнозом у больных плоскоклеточным раком легкого. В схемы химиотерапии плоскоклеточного рака легкого включены препараты антрациклинового ряда, ингибирующие фермент топоизомеразу IIa (ТороIIα), степень активности которой определя- ет чувствительность опухоли к данным препаратам. ТороIIα - белок с ферментативной активностью, участвующий в топологической сборке ДНК во время транскрипции, конденсации и сегрегации хромосом. Пик его экспрессии находится в S-, G2-, M-фазах клеточного цикла, в связи с чем маркер коррелирует с пролиферативной активностью [1]. Для оценки пролиферативной активности общепризнанным и доступным является иммуногистохи-мическое определение уровня антигена Ki-67. Антиген Ki-67 выявляется в клетках в поздние G1-, S-, 22 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ G2-, М-фазы, однако функциональное значение этого ядерного белка в процессе пролиферации до конца не известно. В многочисленных исследованиях показана связь этого маркера с прогнозом опухоли [1, 2]. В настоящее время исследование аргирофильных белков, ассоциированных с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белков) является общепризнанным маркером скорости клеточного цикла. До 75% окрашивания Ag-ЯОР-белков составляют два главных аргирофильных белка С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК. Эти белки выявляются в ядрах клеток во все фазы клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5-3 раза в S- и G^æîbi [3]. Показана обратная зависимость между количественным содержанием Ag-ЯОР-белков и длительностью клеточного цикла [4], временем удвоения опухоли [5], в том числе и при плоскоклеточном раке легкого [6]. Анализ существующей литературы показал противоречивый характер связи антигена ТороИа с клинико-морфологическими параметрами, антигеном Ki-67, Ag-ЯОР-белками и выживаемостью больных злокачественными опухолями [2, 7-12]. Кроме того, отсутствуют работы, уточняющие взаимную связь антигена ТороИа с клинико-морфологическими параметрами, антигеном Ki-67, Ag-ЯОР-белками и прогнозом при плоскоклеточном раке легкого. Исходя из вышеизложенного, целью работы стало исследование антигена ТороIIα во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, антигеном Ki-67, Ag-ЯОР-белками и 5-летней выживаемостью при плоскоклеточном раке легкого. Материал и методы исследованы 111 операционных материалов плоскоклеточного рака легкого, удаленных за период 2007-2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 40 до 75 лет); 106 (95%) мужчин и 5 (5%) женщин. Выполнена лобэктомия 67 (60%) пациентам и пневмонэктомия 44 (40%) пациентам. Пред- и постоперационная химиотерапия не проводились. Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно классификации TNM 7-го пересмотра [13] и представлена в табл. 1. Кусочки ткани фиксировали 18-24 ч в 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом/альциановым синим, по Крейбер-гу. Иммуногистохимическим методом определяли ТороИа (клон JS5B4), антиген Ki-67 (клон MiB-1), цитокератины High Molecular Weight (клон 34ßE12) в автоматическом стейнере Ventana XT. Определяли индекс метки (ИМ) ТороIIα и Ki-67 - количество положительно окрашенных клеток от общего количества подсчитанных клеток (в процентах). В каждом случае исследовали 1000 клеток в 5-7 полях зрения, при увеличении в 400 раз. Для изучения Ag-ЯОР-белков срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике Таблица 1 ТороІІа в плоскоклеточном раке легкого Характери Количество случаев ИМ ТороИа стика абс. % Первичная опухоль Т 1 22 20 21 (16-26) 1-2 (р = 0,9) Т 2 71 64 22 (14-30) 2-3 (р = 0,01) Т 3 18 16 26 (22-35) 1-3 (р = 0,02) Наибольший размер < 3 см 40 36 19 (15-25) 4-5 (р = 0,02) > 3 см 71 64 24 (17-31) Лимфатические узлы N 0 72 65 21 (16-29) 6-7 (р = 0,2) N 1 27 24 23 (14-33) 7-8 (р = 0,8) N 2 10 9 25 (22-27) 6-8 (р = 0,2) N 3 2 2 27 (25-28) Стадия I 55 50 20 (14-27) 10-11 (р = 0,2) II 37 33 23 (17-32) 11-12 (р = 0,2) III 19 17 26 (22-28) 10-12 (р = 0,008) Дифференцировка высокая 35 31 19 (15-26) 13-14 (р = 0,2) умеренная 52 47 23 (18-28) 14-15 (р = 0,2) низкая 24 22 26 (21-35) 13-15 (р = 0,01) ИП Ag-яОР-белков низкий 58 52 20 (16-26) 16-17 (р = 0,02) высокий 53 48 25 (18-31) ИМ Ki-67 низкий 50 45 20 (14-24) 18-19 (р < 0,001) высокий 61 55 25 (18-32) [14]. Перед окрашиванием срезы автоклавировали при 120°С 20 мин в 0,01 М цитратном буфере (рН 6,0) [14]. Докрашивание ядер не проводили, срезы заключали в канадский бальзам. В каждом случае определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм2) в ядрах 100-120 случайно выбранных клеток с 10- 15 цифровых изображений, полученных с соответствующих полей зрения микроскопа при увеличении в 1000 раз (объектив *100, 1.25, oil). Компьютерный анализ изображений проводили в программе ImageJ 1.42. Для исключения ошибки измерений гранулы размером менее 0,1 мкм2 исключены из анализа. В качестве внутреннего контроля окрашивания использовали площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов [15]. Находили индекс площади (ИП) Ag-ЯОР-белков - частное от деления площадей Ag-ЯОР-белков в клетке опухоли и малом лимфоците. Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Statistica 6.0. Так как распределение ИМ ТороIIα и Ki-67 было непараметрическим, то меру центральной тенденции представляли в виде медианы, а меру рассеяния в виде интерквар-тильного интервала. Распределение ИП Ag-ЯОР-белков было параметрическим, поэтому меру центральной тенденции представляли в виде среднего 23 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 2, 2014 »• 'if. ' . *, ^ - : ^ * ,фщл ' * - і> і. ■ * . ** I ■#.•>•• ^v‘ Ї' Л • ♦ • j ’ .. ц • Д. :' * : Ал • * .;•. >- **... . . .. .■& л- * .ГК < Е -і *г- ш . * ■ Г V «і? Рис. 1. Умерено дифференцированный плоскоклеточный рак легкого (а) с высоким содержанием ТороIIα (б), Ag-ЯОР-белков (в) и Ki-67 (г). а - окраска гематоксилином и эозином, *200; б, г - иммуногистохимический метод, *400; в - окраска азотнокислым серебром, *1000. значения, а меру рассеяния в виде стандартного отклонения. При проверке статистических гипотез применяли непараметрические методы: U-тест Манна-Уитни, коэффициент корреляции рангов Спирмена (r). Определяли общую скорректированную выживаемость больных за 5-летний период после операции, использовали метод Каплана-Мейера, логарифмический ранговый тест, регрессионную модель Кокса. Достоверность полученных критериев оценивали при р < 0,05. Результаты и обсуждение Результат иммуногистохимической окраски ТороIIα и Ki-67 определялся в виде окрашивания ядер клеток коричневого цвета, от светлого до темного оттенка в зависимости от фазы клеточного цикла с пиком экспрессии в G2 и М (рис. 1, б, г). Результат окраски срезов азотнокислым серебром определялся в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне коричневого ядрышка или бледно-желтого ядра (рис. 1, в). ИМ ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого составил 22% (16-28%). Данное значение считали пороговым; соответственно, случаи с ИМ ТороIIα 22% и более считались с высоким ИМ ТороIIα (+ТороIIα), до 22% - с низким (-ТороIIα). ИМ Ki-67 в плоскоклеточном раке легкого составил 30% (23-45%). Данное значение считали пороговым, что согласуется с данными литературы [7]. Соответственно, случаи с ИМ Ki-67 30% и более считались с высоким ИМ Ki-67 (+Ki-67), до 30% - с низким (-Ki-67). Индекс площади Ag-ЯОР-белков в плоскоклеточном раке легкого составил 6,98 ± 1,48. По аналогии с оценкой ИМ ТороIIα и Ki-67, случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,98 и более считались с высоким ИП Ag-ЯОР-белков ^Ag-ЯОР), до 6,98 - с низким (-Ag-ЯОР). Результаты определения ТороIIα в эпителиальных клетках плоскоклеточного рака легкого в связи с морфологическими параметрами опухоли, а также результаты сравнения между этими группами представлены в табл. 1. Отмечалось последовательное увеличение ИМ ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого в группах Т1, Т2, Т3, однако статистически значимое различие получено только между Т3 и Т1, Т2. Также отмечалось достоверное отличие ИМ ТороIIα между опухолями до 3 см и более 3 см. ИМ ТороIIα возрастал в группах N0, N1, N2, N3 (показатель N), однако, статистически значимого различия не было получено. Достоверное отличие ИМ ТороIIα получено между I и III стадией заболевания, высоко- и низкодифференцированной опухолью. Статистически значимые различия ИМ ТороIIα получены в группах с низким и высоким ИП Ag-ЯОР-белков и Им Ki-67. ИМ ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого имел слабую корреляцию с показателем Т (r = 0,20; р = 0,04), наибольшим размером опухоли (r = 0,23; р = 0,02), стадией (r = 0,24; р = 0,01), ИП Ag-ЯОР-белков (r = 0,23; р = 0,02) и умеренную корреляцию с ИМ Ki-67 (r = 0,39; р < 0,001). Таким образом, возрастание ак- 24 фундаментальная НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О -Ад-ЯОР р<0,001 +Ад-ЯОР -------А 400 800 1200 1600 2000 Рис. 2. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных плоскоклеточным раком легкого. а - с низким и высоким содержанием ТороИа; б - с низким содержанием ТороIIα и низким/высоким содержанием Ag-ЯОР-белков; в - с высоким содержанием ТороIIα и низким/высоким содержанием Ag-ЯОР-белков. По оси абсцисс - время жизни (в днях), по оси ординат - доля выживших больных. тивности ТороIIα в процессе роста, при увеличении стадии заболевания и снижении дифференцировки плоскоклеточного рака легкого связано, вероятно, с увеличением пролиферативной активности опухоли и изменением функциональных процессов мутированной ДНК. Найденная нами корреляция ИМ ТороIIα с активностью ядрышковых организаторов и в большей степени с антигеном Ki-67 подтверждает значимость исследования ТороIIα в качестве маркера пролиферативной активности опухоли. Общая скорректированная выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого за 5-летний период после операции составила 49,0 ± 5,0%. Выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого имела статистически значимое различие в зависимости от содержания ТороIIα: с -ТороIIα 5-летняя выживаемость составила 74,8 ± 6,6%, с +ТороIIα - 24,8 ± 6,6% (рис. 2, а). В плоскоклеточном раке легкого с -ТороIIα и +ТороIIα выживаемость больных имела статистически значимые различия в зависимости от клинико-морфологических параметров - показателя N и стадии заболевания (табл. 2). На выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого с -ТороIIα и +ТороIIα оказывала влияние активность ядрышковых организаторов в клетках опухоли - в одной и той же группе выживаемость выше при низком ИП Ag-ЯОР-белков (см. табл. 2, рис. 2, б, в), что является отражением связи активности ядрышковых организаторов с продолжительностью клеточного цикла. Выживаемость больных с -ТороIIα и +ТороIIα не имела статистически значимых различий в зависимости от ИМ Ki-67. Таким образом, выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого зависит как от содержания ТороIIα, так и от клинико-морфологических параметров по системе TNM (показателя N, стадии заболевания) и ИП Ag-ЯОР-белков. При проведении одномерного регрессионного анализа содержание ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого имело влияние на выживаемость больных (Х2 = 27,2; ß = 1,59, стандартная ошибка 0,34, р < 0,001). При проведении многомерного регрессионного анализа только содержание ТороIIα (х2 = 61,4; ß = 1,0, стандартная ошибка 0,38,р < 0,01) и ИП Ag-ЯОР-белков (х2 = 61,4; ß = 1,31, стандартная ошибка 0,33, р < 0 ,001) влияли на выживаемость больных. В нашем исследовании найдена корреляция ТороIIα с ИМ Ki-67 в плоскоклеточном раке легкого, что согласуется с данными исследований рака легко- Таблица 2 Общая 5-летняя скорректированная выживаемость больных в зависимости от содержания ТороІІа и клинико-морфологических параметров, ИП Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67 в плоскоклеточном раке легкого (логарифмический ранговый тест) Характе ристика -ТороИа +ТороПа п выживае мость, % р п выживае мость, % р Лимфатические узлы N 0 39 83,9 ± 6,6 < 0,01 33 35,8 ± 10,5 < 0,001 N 1-3 11 25,8 ± 15,6 28 9,0 ± 5,7 Стадия I 33 82,5 ± 7,5 0,02 22 35,0 ± 14,1 0,02 II-III 17 47,6 ± 13,3 39 14,5 ± 7,0 ИП Ag-ЯОР-белков низкий 34 86,2 ± 6,8 < 0,001 24 41,4 ± 13,2 < 0,001 высокий 16 37,2 ± 13,7 37 12,3 ± 5,6 Примечание.« - количество случаев. 25 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 2, 2014 го [8]. Также найдена умеренная корреляция ТороIIα с содержанием Ag-ЯОР-белков. Таким образом, ТороIIα является маркером пролиферативной активности при плоскоклеточном раке легкого. Содержание ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого взаимосвязано с показателем Т, наибольшим размером опухоли, стадией и дифференцировкой. Взаимосвязь ТороIIα с клинико-морфологическими параметрами также показана в исследовании плоскоклеточного рака гортани [16]. Однако H. Erguden и соавт. [10] не нашли связи между содержанием ТороIIα и клинико-морфологическими параметрами при раке легкого. Выживаемостьбольныхплоскоклеточнымраком легкого с -ТороIIα достоверно выше по сравнению с опухолями с +ТороIIα. Такая взаимосвязь содержания ТороIIα с выживаемостью больных прослежена и в других исследованиях на материале рака легкого и гортани [8, 9, 16]. Однако в исследовании H. Erguden и соавт. [10] не найдено связи выживаемости больных раком легкого и ТороIIα. Выживаемость больных в группах -ТороIIα и +ТороIIα зависит также от клинико-морфологических параметров по системе TNM (показателя N и стадии заболевания) и от активности ядрышковых организаторов. Таким образом, для получения более точных актуа-риальных кривых выживания больных плоскоклеточным раком легкого необходимо данные исследования ТороIIα соотносить с клинико-морфологическими параметрами и другими методами исследования пролиферации (исследование активности Ag-ЯОР-белков). При проведении регрессионного анализа содержание ТороIIα и Ag-ЯОР-белков являются независимыми факторами прогноза в плоскоклеточном раке легкого. S. Yan и соавт. [8] при исследовании рака легкого также показали, что содержание ТороIIα является независимым фактором прогноза. Вероятно, высокое содержание ТороIIα отражает высокий пролиферативный потенциал опухоли и нарушения в топологической сборке мутированной ДНК. Таким образом, определение содержания ТороIIα во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и содержанием Ag-ЯОР-белков имеет прогностическое значение при плоскоклеточном раке легкого. Выводы 1. В плоскоклеточном раке легкого содержание ТороIIα имело связь с клинико-морфологическими параметрами (показателем Т, наибольшим размером опухоли, стадией и дифференцировкой) и маркерами пролиферации (Ag-ЯОР-белки, Ki-67). 2. Выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого с низким содержанием ТороIIα лучше по сравнению с высоким содержанием ТороIIα. 3. Выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого зависит от взаимного содержания ТороIIα и клинико-морфологических параметров (показатель N и стадия заболевания), маркеров пролиферации (Ag-ЯОР-белков). 4. Содержание ТороIIα и Ag-ЯОР-белков в плоскоклеточном раке легкого являются независимыми факторами прогноза

Об авторах

Дмитрий Сергеевич Кобяков

Муниципальное бюджетное лечебно-профилактическое учреждение «Когалымская городская больница»

Email: dskob@yandex.ru
канд. мед. наук, зав. патологоанатомическим отд-нием 656049, г. Барнаул

Е. Ю Бычкова

Алтайский филиал ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН

656049, г. Барнаул

А. М Авдалян

Алтайский филиал ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН

656049, г. Барнаул

И. П Бобров

ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет»

656038, г. Барнаул

С. А Лазарев

Алтайский филиал ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН

656049, г. Барнаул

Н. М Круглова

Алтайский филиал ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН

656049, г. Барнаул

Е. Л Лушникова

ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН

630117, г. Новосибирск

А. Ф Лазарев

Алтайский филиал ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН

656049, г. Барнаул

Л. М Непомнящих

ФГБУ «Научно-исследовательский институт региональной патологии и патоморфологии» СО РАМН

630117, г. Новосибирск

Список литературы

Дополнительные файлы