Research of topoisomerase A.F. lia activity in conjunction with clinical and morphological parameters and proliferation (to identify argyrophilic proteins of nucleolar organizer regions and antigen Ki-67) in squamous cell carcinoma of the lung

Full Text

Рак легкого занимает ведущее место в заболеваемости и смертности среди злокачественных новообразований. В группе немелкоклеточного рака легкого наибольшая часть представлена плоскоклеточным раком (практически 75%). Вместе с тем результаты лечения и выживаемости таких больных далеки от желаемых. В связи с чем ведется поиск клинико-морфологических и биомолекулярных параметров, связанных с про гнозом у больных плоскоклеточным раком легкого. В схемы химиотерапии плоскоклеточного рака легкого включены препараты антрациклинового ряда, ингибирующие фермент топоизомеразу IIa (ТороIIα), степень активности которой определя- ет чувствительность опухоли к данным препаратам. ТороIIα - белок с ферментативной активностью, участвующий в топологической сборке ДНК во время транскрипции, конденсации и сегрегации хромосом. Пик его экспрессии находится в S-, G2-, M-фазах клеточного цикла, в связи с чем маркер коррелирует с пролиферативной активностью [1]. Для оценки пролиферативной активности общепризнанным и доступным является иммуногистохи-мическое определение уровня антигена Ki-67. Антиген Ki-67 выявляется в клетках в поздние G1-, S-, 22 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ G2-, М-фазы, однако функциональное значение этого ядерного белка в процессе пролиферации до конца не известно. В многочисленных исследованиях показана связь этого маркера с прогнозом опухоли [1, 2]. В настоящее время исследование аргирофильных белков, ассоциированных с ядрышкообразующими районами (Ag-ЯОР-белков) является общепризнанным маркером скорости клеточного цикла. До 75% окрашивания Ag-ЯОР-белков составляют два главных аргирофильных белка С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин), играющих важнейшую роль в синтезе рибосомальной РНК. Эти белки выявляются в ядрах клеток во все фазы клеточного цикла, количественно увеличиваясь в 1,5-3 раза в S- и G^æîbi [3]. Показана обратная зависимость между количественным содержанием Ag-ЯОР-белков и длительностью клеточного цикла [4], временем удвоения опухоли [5], в том числе и при плоскоклеточном раке легкого [6]. Анализ существующей литературы показал противоречивый характер связи антигена ТороИа с клинико-морфологическими параметрами, антигеном Ki-67, Ag-ЯОР-белками и выживаемостью больных злокачественными опухолями [2, 7-12]. Кроме того, отсутствуют работы, уточняющие взаимную связь антигена ТороИа с клинико-морфологическими параметрами, антигеном Ki-67, Ag-ЯОР-белками и прогнозом при плоскоклеточном раке легкого. Исходя из вышеизложенного, целью работы стало исследование антигена ТороIIα во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами, антигеном Ki-67, Ag-ЯОР-белками и 5-летней выживаемостью при плоскоклеточном раке легкого. Материал и методы исследованы 111 операционных материалов плоскоклеточного рака легкого, удаленных за период 2007-2009 гг. в Алтайском краевом онкологическом диспансере (случаи с М1 и множественными опухолями исключены из исследования). Средний возраст пациентов составил 59 лет (от 40 до 75 лет); 106 (95%) мужчин и 5 (5%) женщин. Выполнена лобэктомия 67 (60%) пациентам и пневмонэктомия 44 (40%) пациентам. Пред- и постоперационная химиотерапия не проводились. Патогистологическая характеристика опухолей определена согласно классификации TNM 7-го пересмотра [13] и представлена в табл. 1. Кусочки ткани фиксировали 18-24 ч в 10% нейтральном забуференном формалине. После стандартной проводки операционного материала готовили гистологические срезы толщиной 4 мкм. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом/альциановым синим, по Крейбер-гу. Иммуногистохимическим методом определяли ТороИа (клон JS5B4), антиген Ki-67 (клон MiB-1), цитокератины High Molecular Weight (клон 34ßE12) в автоматическом стейнере Ventana XT. Определяли индекс метки (ИМ) ТороIIα и Ki-67 - количество положительно окрашенных клеток от общего количества подсчитанных клеток (в процентах). В каждом случае исследовали 1000 клеток в 5-7 полях зрения, при увеличении в 400 раз. Для изучения Ag-ЯОР-белков срезы окрашивали азотнокислым серебром по одностадийной методике Таблица 1 ТороІІа в плоскоклеточном раке легкого Характери Количество случаев ИМ ТороИа стика абс. % Первичная опухоль Т 1 22 20 21 (16-26) 1-2 (р = 0,9) Т 2 71 64 22 (14-30) 2-3 (р = 0,01) Т 3 18 16 26 (22-35) 1-3 (р = 0,02) Наибольший размер < 3 см 40 36 19 (15-25) 4-5 (р = 0,02) > 3 см 71 64 24 (17-31) Лимфатические узлы N 0 72 65 21 (16-29) 6-7 (р = 0,2) N 1 27 24 23 (14-33) 7-8 (р = 0,8) N 2 10 9 25 (22-27) 6-8 (р = 0,2) N 3 2 2 27 (25-28) Стадия I 55 50 20 (14-27) 10-11 (р = 0,2) II 37 33 23 (17-32) 11-12 (р = 0,2) III 19 17 26 (22-28) 10-12 (р = 0,008) Дифференцировка высокая 35 31 19 (15-26) 13-14 (р = 0,2) умеренная 52 47 23 (18-28) 14-15 (р = 0,2) низкая 24 22 26 (21-35) 13-15 (р = 0,01) ИП Ag-яОР-белков низкий 58 52 20 (16-26) 16-17 (р = 0,02) высокий 53 48 25 (18-31) ИМ Ki-67 низкий 50 45 20 (14-24) 18-19 (р < 0,001) высокий 61 55 25 (18-32) [14]. Перед окрашиванием срезы автоклавировали при 120°С 20 мин в 0,01 М цитратном буфере (рН 6,0) [14]. Докрашивание ядер не проводили, срезы заключали в канадский бальзам. В каждом случае определяли площадь Ag-ЯОР-белков (в мкм2) в ядрах 100-120 случайно выбранных клеток с 10- 15 цифровых изображений, полученных с соответствующих полей зрения микроскопа при увеличении в 1000 раз (объектив *100, 1.25, oil). Компьютерный анализ изображений проводили в программе ImageJ 1.42. Для исключения ошибки измерений гранулы размером менее 0,1 мкм2 исключены из анализа. В качестве внутреннего контроля окрашивания использовали площадь Ag-ЯОР-белков в ядрах малых лимфоцитов [15]. Находили индекс площади (ИП) Ag-ЯОР-белков - частное от деления площадей Ag-ЯОР-белков в клетке опухоли и малом лимфоците. Статистический анализ полученных данных осуществляли в программе Statistica 6.0. Так как распределение ИМ ТороIIα и Ki-67 было непараметрическим, то меру центральной тенденции представляли в виде медианы, а меру рассеяния в виде интерквар-тильного интервала. Распределение ИП Ag-ЯОР-белков было параметрическим, поэтому меру центральной тенденции представляли в виде среднего 23 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 2, 2014 »• 'if. ' . *, ^ - : ^ * ,фщл ' * - і> і. ■ * . ** I ■#.•>•• ^v‘ Ї' Л • ♦ • j ’ .. ц • Д. :' * : Ал • * .;•. >- **... . . .. .■& л- * .ГК < Е -і *г- ш . * ■ Г V «і? Рис. 1. Умерено дифференцированный плоскоклеточный рак легкого (а) с высоким содержанием ТороIIα (б), Ag-ЯОР-белков (в) и Ki-67 (г). а - окраска гематоксилином и эозином, *200; б, г - иммуногистохимический метод, *400; в - окраска азотнокислым серебром, *1000. значения, а меру рассеяния в виде стандартного отклонения. При проверке статистических гипотез применяли непараметрические методы: U-тест Манна-Уитни, коэффициент корреляции рангов Спирмена (r). Определяли общую скорректированную выживаемость больных за 5-летний период после операции, использовали метод Каплана-Мейера, логарифмический ранговый тест, регрессионную модель Кокса. Достоверность полученных критериев оценивали при р < 0,05. Результаты и обсуждение Результат иммуногистохимической окраски ТороIIα и Ki-67 определялся в виде окрашивания ядер клеток коричневого цвета, от светлого до темного оттенка в зависимости от фазы клеточного цикла с пиком экспрессии в G2 и М (рис. 1, б, г). Результат окраски срезов азотнокислым серебром определялся в виде округлых гранул черного цвета (Ag-ЯОР-белки), расположенных на фоне коричневого ядрышка или бледно-желтого ядра (рис. 1, в). ИМ ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого составил 22% (16-28%). Данное значение считали пороговым; соответственно, случаи с ИМ ТороIIα 22% и более считались с высоким ИМ ТороIIα (+ТороIIα), до 22% - с низким (-ТороIIα). ИМ Ki-67 в плоскоклеточном раке легкого составил 30% (23-45%). Данное значение считали пороговым, что согласуется с данными литературы [7]. Соответственно, случаи с ИМ Ki-67 30% и более считались с высоким ИМ Ki-67 (+Ki-67), до 30% - с низким (-Ki-67). Индекс площади Ag-ЯОР-белков в плоскоклеточном раке легкого составил 6,98 ± 1,48. По аналогии с оценкой ИМ ТороIIα и Ki-67, случаи с ИП Ag-ЯОР-белков 6,98 и более считались с высоким ИП Ag-ЯОР-белков ^Ag-ЯОР), до 6,98 - с низким (-Ag-ЯОР). Результаты определения ТороIIα в эпителиальных клетках плоскоклеточного рака легкого в связи с морфологическими параметрами опухоли, а также результаты сравнения между этими группами представлены в табл. 1. Отмечалось последовательное увеличение ИМ ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого в группах Т1, Т2, Т3, однако статистически значимое различие получено только между Т3 и Т1, Т2. Также отмечалось достоверное отличие ИМ ТороIIα между опухолями до 3 см и более 3 см. ИМ ТороIIα возрастал в группах N0, N1, N2, N3 (показатель N), однако, статистически значимого различия не было получено. Достоверное отличие ИМ ТороIIα получено между I и III стадией заболевания, высоко- и низкодифференцированной опухолью. Статистически значимые различия ИМ ТороIIα получены в группах с низким и высоким ИП Ag-ЯОР-белков и Им Ki-67. ИМ ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого имел слабую корреляцию с показателем Т (r = 0,20; р = 0,04), наибольшим размером опухоли (r = 0,23; р = 0,02), стадией (r = 0,24; р = 0,01), ИП Ag-ЯОР-белков (r = 0,23; р = 0,02) и умеренную корреляцию с ИМ Ki-67 (r = 0,39; р < 0,001). Таким образом, возрастание ак- 24 фундаментальная НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ 1 0,8 0,6 0,4 0,2 О -Ад-ЯОР р<0,001 +Ад-ЯОР -------А 400 800 1200 1600 2000 Рис. 2. Графики выживаемости по Каплану-Мейеру больных плоскоклеточным раком легкого. а - с низким и высоким содержанием ТороИа; б - с низким содержанием ТороIIα и низким/высоким содержанием Ag-ЯОР-белков; в - с высоким содержанием ТороIIα и низким/высоким содержанием Ag-ЯОР-белков. По оси абсцисс - время жизни (в днях), по оси ординат - доля выживших больных. тивности ТороIIα в процессе роста, при увеличении стадии заболевания и снижении дифференцировки плоскоклеточного рака легкого связано, вероятно, с увеличением пролиферативной активности опухоли и изменением функциональных процессов мутированной ДНК. Найденная нами корреляция ИМ ТороIIα с активностью ядрышковых организаторов и в большей степени с антигеном Ki-67 подтверждает значимость исследования ТороIIα в качестве маркера пролиферативной активности опухоли. Общая скорректированная выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого за 5-летний период после операции составила 49,0 ± 5,0%. Выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого имела статистически значимое различие в зависимости от содержания ТороIIα: с -ТороIIα 5-летняя выживаемость составила 74,8 ± 6,6%, с +ТороIIα - 24,8 ± 6,6% (рис. 2, а). В плоскоклеточном раке легкого с -ТороIIα и +ТороIIα выживаемость больных имела статистически значимые различия в зависимости от клинико-морфологических параметров - показателя N и стадии заболевания (табл. 2). На выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого с -ТороIIα и +ТороIIα оказывала влияние активность ядрышковых организаторов в клетках опухоли - в одной и той же группе выживаемость выше при низком ИП Ag-ЯОР-белков (см. табл. 2, рис. 2, б, в), что является отражением связи активности ядрышковых организаторов с продолжительностью клеточного цикла. Выживаемость больных с -ТороIIα и +ТороIIα не имела статистически значимых различий в зависимости от ИМ Ki-67. Таким образом, выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого зависит как от содержания ТороIIα, так и от клинико-морфологических параметров по системе TNM (показателя N, стадии заболевания) и ИП Ag-ЯОР-белков. При проведении одномерного регрессионного анализа содержание ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого имело влияние на выживаемость больных (Х2 = 27,2; ß = 1,59, стандартная ошибка 0,34, р < 0,001). При проведении многомерного регрессионного анализа только содержание ТороIIα (х2 = 61,4; ß = 1,0, стандартная ошибка 0,38,р < 0,01) и ИП Ag-ЯОР-белков (х2 = 61,4; ß = 1,31, стандартная ошибка 0,33, р < 0 ,001) влияли на выживаемость больных. В нашем исследовании найдена корреляция ТороIIα с ИМ Ki-67 в плоскоклеточном раке легкого, что согласуется с данными исследований рака легко- Таблица 2 Общая 5-летняя скорректированная выживаемость больных в зависимости от содержания ТороІІа и клинико-морфологических параметров, ИП Ag-ЯОР-белков, ИМ Ki-67 в плоскоклеточном раке легкого (логарифмический ранговый тест) Характе ристика -ТороИа +ТороПа п выживае мость, % р п выживае мость, % р Лимфатические узлы N 0 39 83,9 ± 6,6 < 0,01 33 35,8 ± 10,5 < 0,001 N 1-3 11 25,8 ± 15,6 28 9,0 ± 5,7 Стадия I 33 82,5 ± 7,5 0,02 22 35,0 ± 14,1 0,02 II-III 17 47,6 ± 13,3 39 14,5 ± 7,0 ИП Ag-ЯОР-белков низкий 34 86,2 ± 6,8 < 0,001 24 41,4 ± 13,2 < 0,001 высокий 16 37,2 ± 13,7 37 12,3 ± 5,6 Примечание.« - количество случаев. 25 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 2, 2014 го [8]. Также найдена умеренная корреляция ТороIIα с содержанием Ag-ЯОР-белков. Таким образом, ТороIIα является маркером пролиферативной активности при плоскоклеточном раке легкого. Содержание ТороIIα в плоскоклеточном раке легкого взаимосвязано с показателем Т, наибольшим размером опухоли, стадией и дифференцировкой. Взаимосвязь ТороIIα с клинико-морфологическими параметрами также показана в исследовании плоскоклеточного рака гортани [16]. Однако H. Erguden и соавт. [10] не нашли связи между содержанием ТороIIα и клинико-морфологическими параметрами при раке легкого. Выживаемостьбольныхплоскоклеточнымраком легкого с -ТороIIα достоверно выше по сравнению с опухолями с +ТороIIα. Такая взаимосвязь содержания ТороIIα с выживаемостью больных прослежена и в других исследованиях на материале рака легкого и гортани [8, 9, 16]. Однако в исследовании H. Erguden и соавт. [10] не найдено связи выживаемости больных раком легкого и ТороIIα. Выживаемость больных в группах -ТороIIα и +ТороIIα зависит также от клинико-морфологических параметров по системе TNM (показателя N и стадии заболевания) и от активности ядрышковых организаторов. Таким образом, для получения более точных актуа-риальных кривых выживания больных плоскоклеточным раком легкого необходимо данные исследования ТороIIα соотносить с клинико-морфологическими параметрами и другими методами исследования пролиферации (исследование активности Ag-ЯОР-белков). При проведении регрессионного анализа содержание ТороIIα и Ag-ЯОР-белков являются независимыми факторами прогноза в плоскоклеточном раке легкого. S. Yan и соавт. [8] при исследовании рака легкого также показали, что содержание ТороIIα является независимым фактором прогноза. Вероятно, высокое содержание ТороIIα отражает высокий пролиферативный потенциал опухоли и нарушения в топологической сборке мутированной ДНК. Таким образом, определение содержания ТороIIα во взаимосвязи с клинико-морфологическими параметрами и содержанием Ag-ЯОР-белков имеет прогностическое значение при плоскоклеточном раке легкого. Выводы 1. В плоскоклеточном раке легкого содержание ТороIIα имело связь с клинико-морфологическими параметрами (показателем Т, наибольшим размером опухоли, стадией и дифференцировкой) и маркерами пролиферации (Ag-ЯОР-белки, Ki-67). 2. Выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого с низким содержанием ТороIIα лучше по сравнению с высоким содержанием ТороIIα. 3. Выживаемость больных плоскоклеточным раком легкого зависит от взаимного содержания ТороIIα и клинико-морфологических параметров (показатель N и стадия заболевания), маркеров пролиферации (Ag-ЯОР-белков). 4. Содержание ТороIIα и Ag-ЯОР-белков в плоскоклеточном раке легкого являются независимыми факторами прогноза

About the authors

D. S Kobyakov

Kogalym City Hospital

Email: dskob@yandex.ru
628481, Kogalym, Russian Federation

E. Yu Bychkova

Altai branch N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

656049, Barnaul, Russian Federation

A. M Avdalyan

Altai branch N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

656049, Barnaul, Russian Federation

I. P Bobrov

Altai Medical University

656038, Barnaul, Russian Federation

S. A. Lazarev

Altai branch N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

656049, Barnaul, Russian Federation

N. M Kruglova

Altai branch N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

656049, Barnaul, Russian Federation

E. X Lushnikova

Scientific Research Institute of Regional Pathology and Pathomorphology of the Siberia Region under the Russian Academy of Medical Sciences

630117, Novosibirsk, Russian Federation

A. F Lazarev

Altai branch N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center under the Russian Academy of Medical Sciences

656049, Barnaul, Russian Federation

L. M Nepomnyashchikh

Scientific Research Institute of Regional Pathology and Pathomorphology of the Siberia Region under the Russian Academy of Medical Sciences

630117, Novosibirsk, Russian Federation

References

Supplementary files