Моделирование трансартериальной химиоэмболизации на крысах с перевиваемым гепатоцеллюлярным раком печени

Полный текст

Трансартериальная (внутриартериальная, в/а) химиоэмболизация (transarterial chemoembolization - TACE) относится к малоинвазивным интервенционно-радиологическим методам лечения неоперабельных опухолей, в том числе рака печени. Первичные злокачественные опухоли печени составляют 3-5% в структуре онкологических заболеваний, при этом 70% остаются неоперабельными и требуют паллиативной противоопухолевой терапии. ТАСЕ позволяет адресно доставить цитостатик и выключить кровоток в опухоли, в результате чего солитарные опухолевые узлы сокращаются вплоть до полного исчезновения [1-3]. Для проведения ТАСЕ используют микросферы (МС), нагруженные различными цитостатика- ми, в частности доксорубицином, DOX, МС/DOX. В клинической практике ТАСЕ с МС/DOX (DC-Bead, «Biocompatibles UK Ltd», Великобритания) показали значимую эффективность при относительно низкой токсичности [4]. В России для этого метода создаются различные МС, пригодные для ТАСЕ, в частности при опухолях печени [5, 6]. В коллекции ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России имеется пригодный для моделирования ТАСЕ, чувствительный к противоопухолевым цитостатикам штамм перевиваемого солидного гепатоцеллюлярного рака печени с хорошим регионарным кровоснабжением [7]. Настоящее исследование посвящено разработке адекватных доклинических опухолевых моделей для изучения ТАСЕ, соответственно сформулированы цель и задачи исследования. Цель исследования: разработка доклинической модели на крысах с внутримышечно трансплантированным гепатоцеллюлярным раком печени для изучения ТАСЕ. Задачи: 1. Оценить чувствительность гепатоцеллю- лярного рака печени крыс РС1 к доксорубицину. 2. На крысах с внутримышечно (в/м) трансплантированным РС1 определить эффективность и побочные эффекты ТАСЕ с помощью нагруженных доксорубицином МС. Материал и методы Для экспериментов использованы 80 особей 8-недельных половозрелых крыс-самцов массой тела 80-100 г из разведения ФГБУ «РОНц им. Н.Н. Блохина» Минздрава России: 6 крыс для поддержания штамма опухоли, 74 особи для эксперимента. Исследование проводили на модели гепатоцел- люлярного рака печени крыс РС1 из Банка РОНЦ [7], трансплантированного подкожно (п/к) и в/м крысам по 0,5 мл 10-20% взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса [8]. Чувствительность модели к DOX оценена на п/к РС1 при раннем однократном внутрибрюшинном (в/б) лечении через 48 ч после трансплантации с использованием контроля роста опухоли (КРО). Сравнительное изучение в/а химиоэмболизации проведено на развившемся в/м РС1 Еср 4,5 см3, что гарантировало наличие регионарного кровотока. В качестве объектов сравнения использованы КРО, лКРО с лигированной артерией, рКРО с введением разбавителя для МС или МС/DOX, «пустые» МС (контроль эмболизации) и с субстанцией DOX (cDOX). Для в/а химиоэмболизации/эмболизации использованы МС/cDOX d = 0,2 мм на основе криогеля поливинилового спирта с мол. массой 86 кДа и степенью дезацелирования 100%, а также «пустые» МС (контроль эмболизации), полученные из лаборатории криохимии биополимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН. МС/cDOX были нагружены субстанцией DOX («Сикор Сосиэта Италиана Кортикостероиди С.р.л.», Италия) по методике криогранулирования при -12°C из 9% водного раствора указанного полимера [5, 6]. МС/cDOX и МС получены в пробирках Эппен- дорф сухими и для получения инъекционной взвеси МС/cDOX и МС разбавлены ex tempore разбавителем, состоящим из физиологического раствора и рентгеноконтрастного препарата йодпромид-370 в соотношении 1:1. С учетом высвобождения 60% DOX в группах, подвергнутых лечению МС/cDOX, определена кумулятивная доза (КД) высвободившегося за 7 дней цитостатика. Агенты вводили крысам трансартериально (внутриартериально, в/а) струйно с помощью инфузионной системы, составленной из внутривенного периферического катетера «бабочка» размера до G27 (Troge, Германия) и пластикового шприца 2,0 мл без иглы по описанной методике [9]. Хирургический доступ к бедренной артерии (a. femoralis) крыс выполняли под наркозом с помощью препарата золе- тил-100 (Virbac, Франция) при использовании соответствующего инструментария. Крыс с п/к РС1 (n = 25) делили на 4 группы: первые 3 группы (n = 6) получали в/б DOX в диапазоне доз 5,0-7,5 - 12 мг/кг, 4-я группа (n = 7) получала в/б 0,5 мл физиологического раствора и использована для КРО без лечения. Крыс с в/м РС1 (n = 49) делили на 7 групп по 6 крыс: 1-я группа МС/cDOX-0,034 получала в/а лечение с КД = 3,3 мг/кг; 2-я группа МС/cDOX-0,05 получала в/а лечение с КД = 5,4 мг/кг; 3-я группа МС/ cDOX-0,1 получала в/а лечение с КД = 10,5 мг/кг; 4-я группа cDOX получала в/а DOX 12 мг/кг; 5-я группа МС получала в/а МС 0,05 мл; 6-я группа лКРО получала лигатуру на бедренную артерию; 7-я группа рКРО получала в/а 0,5 мл разбавителя для МС. Эффективность воздействий оценивали по стандартному показателю торможения роста опухоли ТРО% = (V- VH00 или T/C% = (V/VH00, где V0 и Vk средний объем опухоли в опыте или контроле Vср = (а • b • с). В качестве критериев эффективности использовали показатель < 42% [8]. О результативности химиоэмболизации/ эмболизации в сравниваемых группах судили также по дополнительным показателям, а именно по уменьшению скорости роста РС1 через 7 дней после воздействия, рассчитанной по соотношению конечного и исходного объемов опухолевых узлов в динамике (V/V0), времени удвоения объема опухоли т и коэффициенту эффективности K (топыта/ т ). Верификацию ингибирующего действия выполняли с помощью патоморфологической оценки лечебного патоморфоза (ЛП) в ткани РС1 после в/а лечения в соответствии с известными критериями [10]. Результаты подвергнуты статистической обработке с помощью компьютерной программы Exel 2013 и Exel для Windows 2007 с использованием критерия Г-test Фишера, значимыми считали различия при p < 0,05. После завершения экспериментов животных умерщвляли путем передозировки эфирного наркоза при соблюдении гуманных методов обращения, принятых в РФ [11]. Результаты Показано, что п/к РС1 чувствителен к в/б DOX, введенному однократно в диапазоне переносимых доз 5-12 мг/кг, ТРО 54-77% (р < 0,05) (рис. 1). Лучшие результаты в сравнении с группой КРО получены на 20-е сутки после лечения при максимальной дозе 12 мг/кг, Vср 6463 ± 831 мм3 против Vср 16749 ± 6080 мм3. При оценке эффективности объектов сравнения при изучении в/а химиоэмболизации с помощью МС/cDOX получены следующие данные. В группах без специфического лечения (Т/С 100%) лигирование артерии (лКРО) и в/а введение разбавителя (рКРО) практически не влияют на скорость роста опухоли, что описывается соотношением V/V 2,5 и 2,3 (21-е сутки) и V JV 3,8 и 3,4 (25-е сутки) без достоверных различий между группами. Это позволяет равнозначно использовать эти группы в качестве КРО без лечения. Эффективность эмболизации пустыми МС или проведение в/а монохимиотерапии DOX в разовой дозе 12 мг/кг практически равнозначно ингибируют рост опухоли. На 21-е и 25-е сутки скорость роста опухоли в Таблица 1 Скорость роста в/м РС1 в группах сравнения Г руппа V/VQ П0 отношению к воздействию на сутки роста опухоли т, дни* K** 0-е 21-е 25-е лКРО 1,0 2,5 3,8 2,0 1,0 МС 1,0 1,2 1,4 8,0 4,0 cDOX 1,0 1,3 1,6 8,5 4,3 Примечание: * - время удвоения объема опухоли, дни; ** - коэффициент задержки роста опухоли, т в опыте/т в контроле. группе МС описывается соотношением V/V 1,2 и VIV 1,4, соответственно Т/С = 53% (р = 0,03) и 40% (р = 0,004), K = 4,0. В группе cDOX - V/V0 1,3 и V j V0 1,6, соответственно Т/С = 51-42% (р = 0,03), К= 4,3 (рис. 2, табл. 1). Относительные показатели роста опухоли в контрольных группах представлены в табл. 1. Изучение эффективности МС/DOX при в/а химиоэмболизации крыс показало, что при объемах 0,034 и 0,05 мл терапия относительно малоэффективна. Ингибирование роста опухоли составляет Т/Cmin 41% (р = 0,03) и Т/С 38% (р = 0,0001) соответственно, но не сопровождается регрессией. На 21-е и 25-е сутки скорость роста опухоли в этих группах идентична и описывается соотношением V/V0 1,2 и 1,5 против V/V0 2,5 и 3,8 в группах контроля, т = 11 дней против 2 дней в группе КРО, К= 5,5. Выраженное ингибирование роста опухоли отмечено только в группе МС/DOX-0,1 (КД = 10,5 мг/кг), Т/Cmin 33% (р = 0,00004). Через 3 дня после лечения у одной крысы получена частичная регрессия на 11%, Vt4 4811 мм3 против Vt3 5347 мм3. Скорость роста опухоли на 21-е и 25-е сутки относительно снижена и описывается соотношением V/V 1,1 и 1,2 против V/V 2,5 и 3,8 в группах контроля, т = 16,0 против т = 2,0 в группах контроля, К= 8,0 (табл. 2, рис. 3). Анализ патоморфологических изменений в опухолевом материале после в/а химиоэмболизации показал, что в группах МС/cDOX-0,034 и МС/cDOX- 0,05 показатели ЛП не отличались от контролей. Сравнительный анализ показателей ЛП в группах MC/cDOX-0,1 (КД 10,5 мг/кг) и cDOX 12 мг/кг показал, что в этих группах все значения не различаются между собой, но отличаются от контрольных: число ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ Таблица 2 Относительные показатели роста в/м РС1 под действием MC/ cDOX в диапазоне доз Г руппа V(/V0 на сутки лечения** Эффективность 1-е 3-и 7-е т, дни** K*** Группа сравнения КРО* 1,0 2,5 3,8 2,0 1,0 лКРО МС/cDOX-0,034 1,0 1,2 1,5 11,0 5,5 лКРО МС/cDOX-0,05 1,0 1,2 1,5 11,0 5,5 лКРО 8,0 лКРО МС/cDOX-0,14* 1,0 1,1 1,2 16,0 1,9 cDOX 2 МС Примечание. * - контроль роста опухоли у крыс с лигированной артерией; ** - время удвоения объема опухоли, дни; *** - коэффициент задержки роста опухоли, равный т в опыте/т в контроле; 4* - кумулятивная доза cDOX КД 10,5 мг/кг. Таблица 3 Сравнительная характеристика показателей лечебного пато- морфоза в в/м РС1 под действием в/а химиоэмболизации с помощью МС/cDOX Группа Процент в срезе клеток с признаками митоза клеток с признаками апоптоза площади некроза МС/cDOX-0,034 3-5 0,2-0,5 8-10 МС/cDOX-0,05 3-5 0,2-0,5 8-10 МС/cDOX-0,1 2-4 0,3-0,5 10-12 МС 3-5 0,2-0,5 8-10 DOC 2-4 0,3-0,7 10-12 лКРО, рКРО 3-5 0,2-0,5 8-10 % 200001 Щ MC/cDOX-0,034 0 MC/cDOX-0,05 g mc/cdox-o,i Рис. 3. Сравнительный анализ циторедуктивного эффекта в/а химиоэмболизации с помощью МС/cDOX на развившемся в/м гепато- целлюлярном раке крыс РС1. клеток в митозе 2-4% против 3-5%, клеток с признаками апоптоза 0,3-0,5 и 0,3-0,7% против 0,2-0,5%, площадь некроза - до 10-12% против 8-10% (табл. 3). Переносимость лечения МС/cDOX при всех использованных объемах была удовлетворительной. Побочные эффекты при в/а химиоэмболизации МС/ cDOX проявлялись у части крыс через 7-16 дней некрозом различной интенсивности мягких тканей лапки и были вызваны полным выключением регионарного кровотока из-за несоответствия диаметру артерии. Указанные побочные эффекты являются неспецифическими для химиоэмболизации с цитоста- тиком. В течение 7 дней наблюдения характерных проявлений побочного действия cDOX не отмечено. Заключение Моделирование трансартериальной химиоэмболизации (transarterial chemoembolization - TACE) проведено на крысах (n = 6) с чувствительным к док- сорубицину (МПД = 12 мг/кг) гепатоцеллюлярным раком печени РС1, развившимся в мышцах бедра (в/м) (УсР 4,5 см3). ТАСЕ выполнена с эластичными микросферами d = 0,2 мм из поливинилового спирта, нагруженными доксорубицином (MC/cDOX) с высвобождением 7 дней. MC/cDOX - 0,034-0,1 мл (кумулятивная доза cDOX -3,3-10,5 мг/кг) вводили однократно в бедренную артерию (в/а) d ~ 0,16 мм под контролем эмболизации (МС, лигирование артерии) и химиотерапии ^DOX). ТАСЕ приводила к циторедукции на 67% (Т/С 33%, p = 0,0004) с единичной регрессией опухоли и развитием лечебного патомор- фоза 1-й степени. Терапевтический выигрыш MC/ cDOX выразился в сопряженном с циторедукцией уменьшении скорости роста опухоли (т 11-16 дней против 1,9-2 дней в группах контроля) при меньшей на 20% дозе cDOX против МПД. Побочные эффекты ТАСЕ (некроз мягких тканей, 7-16-й день) не связаны с ТАСЕ и связаны с полным выключением регионарного кровотока из-за несоответствия МС и диаметра артерии. Совокупность выявленных эффектов позволила считать модель на крысах с в/м опухолью пригодной для скрининга специфической активности агентов для ТАСЕ. Доклиническое изучение метода целесообразно выполнять на соответствующей модели у крупных животных с регионарной артерией достаточного сечения, позволяющей адекватно выполнять ТАСЕ. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Об авторах

Елена Михайловна Трещалина

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

Email: treshalina@yandex.ru
д-р мед. наук, проф., руководитель лаборатории комбинированной терапии опухолей НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей 115478, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24

М. Н Якунина

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

115478, г. Москва, Россия

А. Ю Фадеев

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

115478, г. Москва, Россия

Г. Б Смирнова

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

115478, г. Москва, Россия

Ю. А Борисова

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

115478, г. Москва, Россия

М. С Калишьян

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

115478, г. Москва, Россия

Б. И Долгушин

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

115478, г. Москва, Россия

Э. Р Виршке

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

115478, г. Москва, Россия

В. Ю Косырев

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России

115478, г. Москва, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы