Results of transarterial chemoembolization on rats with grafted hepatocellular cancer of liver

Full Text

Трансартериальная (внутриартериальная, в/а) химиоэмболизация (transarterial chemoembolization - TACE) относится к малоинвазивным интервенционно-радиологическим методам лечения неоперабельных опухолей, в том числе рака печени. Первичные злокачественные опухоли печени составляют 3-5% в структуре онкологических заболеваний, при этом 70% остаются неоперабельными и требуют паллиативной противоопухолевой терапии. ТАСЕ позволяет адресно доставить цитостатик и выключить кровоток в опухоли, в результате чего солитарные опухолевые узлы сокращаются вплоть до полного исчезновения [1-3]. Для проведения ТАСЕ используют микросферы (МС), нагруженные различными цитостатика- ми, в частности доксорубицином, DOX, МС/DOX. В клинической практике ТАСЕ с МС/DOX (DC-Bead, «Biocompatibles UK Ltd», Великобритания) показали значимую эффективность при относительно низкой токсичности [4]. В России для этого метода создаются различные МС, пригодные для ТАСЕ, в частности при опухолях печени [5, 6]. В коллекции ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России имеется пригодный для моделирования ТАСЕ, чувствительный к противоопухолевым цитостатикам штамм перевиваемого солидного гепатоцеллюлярного рака печени с хорошим регионарным кровоснабжением [7]. Настоящее исследование посвящено разработке адекватных доклинических опухолевых моделей для изучения ТАСЕ, соответственно сформулированы цель и задачи исследования. Цель исследования: разработка доклинической модели на крысах с внутримышечно трансплантированным гепатоцеллюлярным раком печени для изучения ТАСЕ. Задачи: 1. Оценить чувствительность гепатоцеллю- лярного рака печени крыс РС1 к доксорубицину. 2. На крысах с внутримышечно (в/м) трансплантированным РС1 определить эффективность и побочные эффекты ТАСЕ с помощью нагруженных доксорубицином МС. Материал и методы Для экспериментов использованы 80 особей 8-недельных половозрелых крыс-самцов массой тела 80-100 г из разведения ФГБУ «РОНц им. Н.Н. Блохина» Минздрава России: 6 крыс для поддержания штамма опухоли, 74 особи для эксперимента. Исследование проводили на модели гепатоцел- люлярного рака печени крыс РС1 из Банка РОНЦ [7], трансплантированного подкожно (п/к) и в/м крысам по 0,5 мл 10-20% взвеси опухолевой ткани в растворе Хенкса [8]. Чувствительность модели к DOX оценена на п/к РС1 при раннем однократном внутрибрюшинном (в/б) лечении через 48 ч после трансплантации с использованием контроля роста опухоли (КРО). Сравнительное изучение в/а химиоэмболизации проведено на развившемся в/м РС1 Еср 4,5 см3, что гарантировало наличие регионарного кровотока. В качестве объектов сравнения использованы КРО, лКРО с лигированной артерией, рКРО с введением разбавителя для МС или МС/DOX, «пустые» МС (контроль эмболизации) и с субстанцией DOX (cDOX). Для в/а химиоэмболизации/эмболизации использованы МС/cDOX d = 0,2 мм на основе криогеля поливинилового спирта с мол. массой 86 кДа и степенью дезацелирования 100%, а также «пустые» МС (контроль эмболизации), полученные из лаборатории криохимии биополимеров Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН. МС/cDOX были нагружены субстанцией DOX («Сикор Сосиэта Италиана Кортикостероиди С.р.л.», Италия) по методике криогранулирования при -12°C из 9% водного раствора указанного полимера [5, 6]. МС/cDOX и МС получены в пробирках Эппен- дорф сухими и для получения инъекционной взвеси МС/cDOX и МС разбавлены ex tempore разбавителем, состоящим из физиологического раствора и рентгеноконтрастного препарата йодпромид-370 в соотношении 1:1. С учетом высвобождения 60% DOX в группах, подвергнутых лечению МС/cDOX, определена кумулятивная доза (КД) высвободившегося за 7 дней цитостатика. Агенты вводили крысам трансартериально (внутриартериально, в/а) струйно с помощью инфузионной системы, составленной из внутривенного периферического катетера «бабочка» размера до G27 (Troge, Германия) и пластикового шприца 2,0 мл без иглы по описанной методике [9]. Хирургический доступ к бедренной артерии (a. femoralis) крыс выполняли под наркозом с помощью препарата золе- тил-100 (Virbac, Франция) при использовании соответствующего инструментария. Крыс с п/к РС1 (n = 25) делили на 4 группы: первые 3 группы (n = 6) получали в/б DOX в диапазоне доз 5,0-7,5 - 12 мг/кг, 4-я группа (n = 7) получала в/б 0,5 мл физиологического раствора и использована для КРО без лечения. Крыс с в/м РС1 (n = 49) делили на 7 групп по 6 крыс: 1-я группа МС/cDOX-0,034 получала в/а лечение с КД = 3,3 мг/кг; 2-я группа МС/cDOX-0,05 получала в/а лечение с КД = 5,4 мг/кг; 3-я группа МС/ cDOX-0,1 получала в/а лечение с КД = 10,5 мг/кг; 4-я группа cDOX получала в/а DOX 12 мг/кг; 5-я группа МС получала в/а МС 0,05 мл; 6-я группа лКРО получала лигатуру на бедренную артерию; 7-я группа рКРО получала в/а 0,5 мл разбавителя для МС. Эффективность воздействий оценивали по стандартному показателю торможения роста опухоли ТРО% = (V- VH00 или T/C% = (V/VH00, где V0 и Vk средний объем опухоли в опыте или контроле Vср = (а • b • с). В качестве критериев эффективности использовали показатель < 42% [8]. О результативности химиоэмболизации/ эмболизации в сравниваемых группах судили также по дополнительным показателям, а именно по уменьшению скорости роста РС1 через 7 дней после воздействия, рассчитанной по соотношению конечного и исходного объемов опухолевых узлов в динамике (V/V0), времени удвоения объема опухоли т и коэффициенту эффективности K (топыта/ т ). Верификацию ингибирующего действия выполняли с помощью патоморфологической оценки лечебного патоморфоза (ЛП) в ткани РС1 после в/а лечения в соответствии с известными критериями [10]. Результаты подвергнуты статистической обработке с помощью компьютерной программы Exel 2013 и Exel для Windows 2007 с использованием критерия Г-test Фишера, значимыми считали различия при p < 0,05. После завершения экспериментов животных умерщвляли путем передозировки эфирного наркоза при соблюдении гуманных методов обращения, принятых в РФ [11]. Результаты Показано, что п/к РС1 чувствителен к в/б DOX, введенному однократно в диапазоне переносимых доз 5-12 мг/кг, ТРО 54-77% (р < 0,05) (рис. 1). Лучшие результаты в сравнении с группой КРО получены на 20-е сутки после лечения при максимальной дозе 12 мг/кг, Vср 6463 ± 831 мм3 против Vср 16749 ± 6080 мм3. При оценке эффективности объектов сравнения при изучении в/а химиоэмболизации с помощью МС/cDOX получены следующие данные. В группах без специфического лечения (Т/С 100%) лигирование артерии (лКРО) и в/а введение разбавителя (рКРО) практически не влияют на скорость роста опухоли, что описывается соотношением V/V 2,5 и 2,3 (21-е сутки) и V JV 3,8 и 3,4 (25-е сутки) без достоверных различий между группами. Это позволяет равнозначно использовать эти группы в качестве КРО без лечения. Эффективность эмболизации пустыми МС или проведение в/а монохимиотерапии DOX в разовой дозе 12 мг/кг практически равнозначно ингибируют рост опухоли. На 21-е и 25-е сутки скорость роста опухоли в Таблица 1 Скорость роста в/м РС1 в группах сравнения Г руппа V/VQ П0 отношению к воздействию на сутки роста опухоли т, дни* K** 0-е 21-е 25-е лКРО 1,0 2,5 3,8 2,0 1,0 МС 1,0 1,2 1,4 8,0 4,0 cDOX 1,0 1,3 1,6 8,5 4,3 Примечание: * - время удвоения объема опухоли, дни; ** - коэффициент задержки роста опухоли, т в опыте/т в контроле. группе МС описывается соотношением V/V 1,2 и VIV 1,4, соответственно Т/С = 53% (р = 0,03) и 40% (р = 0,004), K = 4,0. В группе cDOX - V/V0 1,3 и V j V0 1,6, соответственно Т/С = 51-42% (р = 0,03), К= 4,3 (рис. 2, табл. 1). Относительные показатели роста опухоли в контрольных группах представлены в табл. 1. Изучение эффективности МС/DOX при в/а химиоэмболизации крыс показало, что при объемах 0,034 и 0,05 мл терапия относительно малоэффективна. Ингибирование роста опухоли составляет Т/Cmin 41% (р = 0,03) и Т/С 38% (р = 0,0001) соответственно, но не сопровождается регрессией. На 21-е и 25-е сутки скорость роста опухоли в этих группах идентична и описывается соотношением V/V0 1,2 и 1,5 против V/V0 2,5 и 3,8 в группах контроля, т = 11 дней против 2 дней в группе КРО, К= 5,5. Выраженное ингибирование роста опухоли отмечено только в группе МС/DOX-0,1 (КД = 10,5 мг/кг), Т/Cmin 33% (р = 0,00004). Через 3 дня после лечения у одной крысы получена частичная регрессия на 11%, Vt4 4811 мм3 против Vt3 5347 мм3. Скорость роста опухоли на 21-е и 25-е сутки относительно снижена и описывается соотношением V/V 1,1 и 1,2 против V/V 2,5 и 3,8 в группах контроля, т = 16,0 против т = 2,0 в группах контроля, К= 8,0 (табл. 2, рис. 3). Анализ патоморфологических изменений в опухолевом материале после в/а химиоэмболизации показал, что в группах МС/cDOX-0,034 и МС/cDOX- 0,05 показатели ЛП не отличались от контролей. Сравнительный анализ показателей ЛП в группах MC/cDOX-0,1 (КД 10,5 мг/кг) и cDOX 12 мг/кг показал, что в этих группах все значения не различаются между собой, но отличаются от контрольных: число ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ Таблица 2 Относительные показатели роста в/м РС1 под действием MC/ cDOX в диапазоне доз Г руппа V(/V0 на сутки лечения** Эффективность 1-е 3-и 7-е т, дни** K*** Группа сравнения КРО* 1,0 2,5 3,8 2,0 1,0 лКРО МС/cDOX-0,034 1,0 1,2 1,5 11,0 5,5 лКРО МС/cDOX-0,05 1,0 1,2 1,5 11,0 5,5 лКРО 8,0 лКРО МС/cDOX-0,14* 1,0 1,1 1,2 16,0 1,9 cDOX 2 МС Примечание. * - контроль роста опухоли у крыс с лигированной артерией; ** - время удвоения объема опухоли, дни; *** - коэффициент задержки роста опухоли, равный т в опыте/т в контроле; 4* - кумулятивная доза cDOX КД 10,5 мг/кг. Таблица 3 Сравнительная характеристика показателей лечебного пато- морфоза в в/м РС1 под действием в/а химиоэмболизации с помощью МС/cDOX Группа Процент в срезе клеток с признаками митоза клеток с признаками апоптоза площади некроза МС/cDOX-0,034 3-5 0,2-0,5 8-10 МС/cDOX-0,05 3-5 0,2-0,5 8-10 МС/cDOX-0,1 2-4 0,3-0,5 10-12 МС 3-5 0,2-0,5 8-10 DOC 2-4 0,3-0,7 10-12 лКРО, рКРО 3-5 0,2-0,5 8-10 % 200001 Щ MC/cDOX-0,034 0 MC/cDOX-0,05 g mc/cdox-o,i Рис. 3. Сравнительный анализ циторедуктивного эффекта в/а химиоэмболизации с помощью МС/cDOX на развившемся в/м гепато- целлюлярном раке крыс РС1. клеток в митозе 2-4% против 3-5%, клеток с признаками апоптоза 0,3-0,5 и 0,3-0,7% против 0,2-0,5%, площадь некроза - до 10-12% против 8-10% (табл. 3). Переносимость лечения МС/cDOX при всех использованных объемах была удовлетворительной. Побочные эффекты при в/а химиоэмболизации МС/ cDOX проявлялись у части крыс через 7-16 дней некрозом различной интенсивности мягких тканей лапки и были вызваны полным выключением регионарного кровотока из-за несоответствия диаметру артерии. Указанные побочные эффекты являются неспецифическими для химиоэмболизации с цитоста- тиком. В течение 7 дней наблюдения характерных проявлений побочного действия cDOX не отмечено. Заключение Моделирование трансартериальной химиоэмболизации (transarterial chemoembolization - TACE) проведено на крысах (n = 6) с чувствительным к док- сорубицину (МПД = 12 мг/кг) гепатоцеллюлярным раком печени РС1, развившимся в мышцах бедра (в/м) (УсР 4,5 см3). ТАСЕ выполнена с эластичными микросферами d = 0,2 мм из поливинилового спирта, нагруженными доксорубицином (MC/cDOX) с высвобождением 7 дней. MC/cDOX - 0,034-0,1 мл (кумулятивная доза cDOX -3,3-10,5 мг/кг) вводили однократно в бедренную артерию (в/а) d ~ 0,16 мм под контролем эмболизации (МС, лигирование артерии) и химиотерапии ^DOX). ТАСЕ приводила к циторедукции на 67% (Т/С 33%, p = 0,0004) с единичной регрессией опухоли и развитием лечебного патомор- фоза 1-й степени. Терапевтический выигрыш MC/ cDOX выразился в сопряженном с циторедукцией уменьшении скорости роста опухоли (т 11-16 дней против 1,9-2 дней в группах контроля) при меньшей на 20% дозе cDOX против МПД. Побочные эффекты ТАСЕ (некроз мягких тканей, 7-16-й день) не связаны с ТАСЕ и связаны с полным выключением регионарного кровотока из-за несоответствия МС и диаметра артерии. Совокупность выявленных эффектов позволила считать модель на крысах с в/м опухолью пригодной для скрининга специфической активности агентов для ТАСЕ. Доклиническое изучение метода целесообразно выполнять на соответствующей модели у крупных животных с регионарной артерией достаточного сечения, позволяющей адекватно выполнять ТАСЕ. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Helena M. Treshalina

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Email: treshalina@yandex.ru
MD, PhD, DSc, Рrоf., Head of the Laboratory of combination therapy of tumors of the Research Institute of Experimental diagnostics and therapy of tumors Moscow, 115478, Russian Federation

M. N Yakunina

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

A. Yu Fadeev

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

G. B Smirnova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

Ju. A Borisova

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

M. S Kalishyan

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

B. I Dolgushin

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

E. R Virshke

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

V. Yu Kosirev

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center

Moscow, 115478, Russian Federation

References

Supplementary files